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    海藻渣改良栽培料對平菇多糖產(chǎn)量影響的研究

    2020-05-18 07:03:44王盟星朱紅薇張琳黃樂秦益民
    生物化工 2020年2期
    關(guān)鍵詞:棉籽殼平菇靜置

    王盟星,朱紅薇,張琳,黃樂,秦益民

    (1.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江嘉興 314001;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海藻類肥料重點實驗室,山東青島 266400;3.海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室,山東青島 266400)

    平菇是廣受大家喜愛的一種食物,不僅擁有良好的口感而且營養(yǎng)豐富,其中含有多糖、氨基酸、維生素等對人體有益的成分[1-4]。多糖(polysaccharide)是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈,至少由10個以上單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物,是可以通過口服的功能性食品,不僅對人體有益,同時也具備很多臨床作用[5-6]。

    浙江省等沿海城市,海藻資源豐富。海藻渣則是提取海藻內(nèi)海藻酸、甘露醇、碘等產(chǎn)品的副產(chǎn)物,排放到水中會與水形成膠性粘稠物,造成水體污染[7-9]。海藻渣富含蛋白質(zhì)、粗纖維、微量元素和少量的糖、粗脂肪等可適用于平菇栽培,如果能夠提高食用菌品質(zhì),將具有重要的經(jīng)濟和社會價值。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗菌種

    高平58(Pleurotus ostreatus),本實驗室保存。

    1.1.2 主要試劑

    配制 3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS),AR分析純;0.01g/mL羧甲基纖維素鈉水溶液(CMC),AR分析純;1 mmol/L ABTS溶液,AR分析純;pH=4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,AR分析純(濟南鑫達化工有限公司);海藻渣(青島明月提供)。

    1.1.3 主要儀器

    UV-1100紫外分光光度計(濟南千司生物技術(shù)有限公司);SBA1243電子分析天平(哈爾濱德遠科技開發(fā)有限公司);Eppendorf 5810R 離心機(深圳市德優(yōu)平科技有限公司);VS-130超凈臺(成都宜恒實驗儀器有限公司);DVG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海巨為儀器設(shè)備有限公司)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 培養(yǎng)基配置及菌種活化

    制備PDA培養(yǎng)基,將錐形瓶中培養(yǎng)基融化,倒入無菌平板,待其凝固。用打孔器在普通菌種平板上打出餅狀菌種,用鑷子取出放入凝固后的PDA培養(yǎng)基上,放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2.2 栽培料配置

    栽培基質(zhì)以棉籽殼培養(yǎng)基為基礎(chǔ),加入海藻渣,其輔料配比如表1所示。

    拌勻培養(yǎng)料的輔料,加入少量去離子水,靜置發(fā)酵24 h,調(diào)節(jié)pH至中性;水分調(diào)節(jié)至用手緊握培養(yǎng)料之間有水珠滲出即可。分裝至200 mL玻璃瓶中,在栽培料中間打一個2~3 cm深的接種孔,放入高壓滅菌鍋,121 ℃滅菌2 h,室溫冷卻。

    1.2.3 接種及出菇管理

    將活化后的菌種接種于栽培料中,瓶裝栽培料置于28 ℃環(huán)境中,恒溫培養(yǎng)至菌絲長滿整個栽培料,打開瓶蓋,將室溫降至20~25 ℃,促進菌絲扭結(jié)。保持一定的濕度及栽培室內(nèi)的空氣流動,有一定的散射光照射。

    1.2.4 多糖提取工藝優(yōu)化

    將烘干至恒重的子實體粉碎、過60目篩,按固液比(g∶mL)1∶15、1∶20、1∶25量取菌粉2 g及蒸餾水所需用量于錐形瓶中(每梯度各3瓶),分別在60 ℃、70 ℃、80 ℃下熱水浸提1 h、2 h、3 h后抽濾、加入3倍體積的80%乙醇溶液搖勻、靜置過夜。

    1.2.5 多糖溶液的配制與測定

    將靜置過夜的提取液在4 000 r/min離心20 min,棄去上清液,沉淀用乙醇反復(fù)洗滌3次后放入1 000 mL容量瓶中充分溶解,取1 mL溶解后的多糖溶液于試管中,加入1 mL 6%的苯酚溶液,搖勻,緩慢加入5 mL濃硫酸后在25 ℃水浴中恒溫保持30 min后取出。將配置好的溶液裝于石英比色皿中,在488 nm處測定紫外吸收值。

    1.2.6 粗酶液的提取

    對菌菇廢渣的自然pH進行測定,選取自然pH附近的緩沖溶液作為提取液。每1 kg廢渣用1 L的提取液浸泡,靜置過夜。將靜置過夜的栽培料浸取液用3層濾網(wǎng)過濾,將濾液置于離心管中于4 ℃下9 000 r/min離心5 min,取上清液即為粗酶液。

    1.2.7 酶活的測定

    取兩支試管,一支加入3 mL蒸餾水,一支加入1 mL粗酶液、2 mL過氧化氫,加完后隨即計時,將反應(yīng)液迅速加入石英比色杯中,在420 nm處每30 s記錄一次,測定3 min之內(nèi)吸光值的變化量,以每分鐘吸光值減小0.1為一個酶活力單位[10-12]。

    表1 栽培料培養(yǎng)基配比

    取5支試管分別加入4 mL CMC,50 ℃水浴3 min,取出后加入稀釋50倍的粗酶液1 mL。繼續(xù)置于50 ℃水浴30 min后取出立即加入5 mL DNS,沸水浴5 min。待試管冷卻至室溫后測定530 nm處紫外吸收值,重復(fù)多次實驗,計算每組纖維素酶活力單位數(shù)值[13-16]。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 食用菌生長情況

    由圖1可知,在相同的生長條件下,菌絲隨著海藻渣添加量的增加生長速率先增加后減小,由此可以說明適量的海藻渣可以縮短菌絲長滿玻璃瓶的時間,促進菌絲的生長。從圖2可以看出菌絲潔白、濃密、粗壯且整齊,長勢優(yōu)良。海藻渣比例不同,對菌絲生長的影響也不相同??傮w來看,適量的海藻渣有助于菌絲的生長,這可能是因為海藻渣中含有的營養(yǎng)物質(zhì)適合菌絲生長,當(dāng)海藻渣量較多時,由于海藻渣容易結(jié)塊使得栽培料通氣性差,不適宜菌絲的生長。

    圖1 菌絲生長圖

    圖2 出菇過程圖

    2.2 多糖提取工藝優(yōu)化結(jié)果

    2.2.1 響應(yīng)面分析

    如表2所示,通過實驗因素水平的設(shè)置及實驗的驗證,采用響應(yīng)面分析法即非線性擬合方法,確定出多糖提取工藝為:提取時間3 h,水浴溫度為60 ℃,固液比為1∶25,該模型預(yù)測指導(dǎo)性很強,可靠性強。

    表2 實驗因素水平表

    2.2.2 不同比例栽培料對平菇多糖含量的影響

    由表3可知,當(dāng)海藻渣、棉籽殼比例為5∶5時,平菇子實體多糖產(chǎn)率最高。同時,平菇子實體多糖的產(chǎn)率隨著海藻渣添加量的增加先增大后減小??赡苁请S著海藻渣的添加,粗纖維含量升高促進了纖維素酶活性的提高,加速了纖維素的分解,促進子實體的吸收。但當(dāng)海藻渣過多時,海藻渣容易結(jié)塊,不利于海藻渣內(nèi)纖維素的分解及子實體的吸收。

    表3 多糖產(chǎn)量

    2.2.3 不同比例栽培料對平菇酶活的影響

    如圖3多組重復(fù)檢測數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,當(dāng)海藻渣、棉籽殼比例為7∶3時,平菇菌絲體內(nèi)過氧化氫酶活及纖維素酶活性最高,且與傳統(tǒng)栽培料栽培的平菇菌絲體內(nèi)酶活性相近。此外,隨著海藻渣加入量的增多,菌絲體內(nèi)纖維素酶活性呈現(xiàn)上升趨勢,該現(xiàn)象與菌絲體中過氧化氫酶活性變化相符??赡苁怯捎诤T逶鼉?nèi)富含的粗纖維沒有棉籽殼中的含量多,所以當(dāng)海藻渣、棉籽殼為1∶9時纖維素酶活性較低,然而隨著海藻渣添加,體系內(nèi)纖維素不斷增多,促進了纖維素酶活性的提高。

    圖3 過氧化氫酶和纖維素酶活性檢測結(jié)果

    3 結(jié)論

    當(dāng)海藻渣、棉籽殼比例為5∶5時,平菇菌絲蔓延速度最快,且平菇子實體多糖含量高達14.84%,適量海藻渣的加入對平菇菌絲發(fā)育、子實體形成過程具有促進作用;當(dāng)海藻渣、棉籽殼比例為7∶3時,平菇菌絲中過氧化氫酶及纖維素酶活性最高,且隨著海藻渣量的增加,兩種酶活均呈現(xiàn)出上升趨勢,但酶活性與多糖產(chǎn)量之間沒有協(xié)同關(guān)系,說明過氧化氫酶及纖維素酶不是平菇產(chǎn)多糖的主要酶類;實驗只測了2種特殊的胞外酶,關(guān)于平菇多糖產(chǎn)量是否與其它胞外酶有關(guān)以及具體的作用機制有待進一步研究。

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