高效液相色譜指紋圖譜分析鈷60輻照前后龍膽和秦艽成分變化

鄧超

（湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南長(zhǎng)沙 410125）

秦艽為龍膽科龍膽屬植物，同屬4個(gè)種，能夠作為秦艽藥材使用。秦艽分布在青海省、西藏等地區(qū)，藏醫(yī)使用廣泛。隨著《中國(guó)藥典》對(duì)中藥制劑中微生物限度要求的不斷提高，中藥制劑的滅菌方式備受重視，尤其是含有生物原粉的中藥制劑。常見(jiàn)的重要滅菌方式包括干熱、濕熱、濾過(guò)、輻射等滅菌方法。相關(guān)規(guī)定表示，使用輻射方法滅菌中藥制劑前后，要使用指紋圖譜等對(duì)藥品成分種類(lèi)或者含量變化情況進(jìn)行充分地展示[1]。因此，本文采用高效液相色譜指紋圖譜分析龍膽與秦艽在鈷60輻照前后的成分變化進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilen公司），主要包括自動(dòng)進(jìn)樣器、真空脫氣機(jī)、四元泵、檢測(cè)器；德國(guó)Binder公司生產(chǎn)S120型超聲清洗機(jī)；德國(guó)Binder公司生產(chǎn)ED53型干燥箱；山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)全自動(dòng)臺(tái)式蒸汽滅菌器；Thermo公司生產(chǎn)IGS180通用型微生物培養(yǎng)箱；德國(guó)Binder公司生產(chǎn)DI115型培養(yǎng)箱；日本三洋公司生產(chǎn)MIR-254型低溫培養(yǎng)箱；WTBbinder公司生產(chǎn)BD240型生物培養(yǎng)箱。

龍膽苦苷（批號(hào)：190617-190819，含量96%）、當(dāng)藥苷（批號(hào)：190619-190825，含量93%）、馬錢(qián)苷酸（批號(hào)：190612-190816，含量97%）、獐芽菜苦苷（批號(hào)：190620-190824，含量80%）。

三批龍膽藥材（批號(hào)190620、190712、190816）在云南購(gòu)買(mǎi)，通過(guò)鑒定為堅(jiān)龍膽；三批秦艽藥材（批號(hào)190620、190615、190625）通過(guò)中一藥業(yè)在甘肅采購(gòu)，通過(guò)鑒定為親近。

色譜純甲醇（液相色譜用）、分析純甲醇（提取用），其余藥品均為分析純[2]，超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 輻照滅菌

在湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所輻照中心使用動(dòng)態(tài)方式輻照處理龍膽和秦艽樣品。鈷源裝載量為80萬(wàn)Ci，輻射過(guò)程中在樣品包裝盒中采用重鉻酸鉀（銀）-高氯酸劑量計(jì)進(jìn)行防治，確保輻照劑量的精準(zhǔn)。第1次輻照劑量為3 kGy、6 kGy、8 kGy、10 kGy、25kGy，通過(guò) 3 kGy、6 kGy、8 kGy、10kGy輻照的樣品進(jìn)行第2次劑量為10kGy的輻照，將其作為（3+10） kGy、（6+10） kGy、（8+10） kGy、（10+10） kGy的輻照劑量。

1.2.2 樣品提取

稱(chēng)取0.5 g過(guò)4號(hào)篩（65目）的秦艽或龍膽樣品粉末，溶于20.00 mL甲醇（50%）溶液中，超聲提取30 min后搖勻并通過(guò)0.45 μm濾膜，得到提取液。超聲前后要稱(chēng)量溶液質(zhì)量，并通過(guò)補(bǔ)充50%甲醇溶液保持恒重。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil G18 5 μm分析柱；流動(dòng)相為甲醇（A）和0.04%磷酸水溶液（B），按照10∶90、20∶80、30∶70、35∶65的程序進(jìn)行梯度洗脫；流速設(shè)置為1.00 mL/min；進(jìn)樣量為4 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為222 nm，柱溫設(shè)置為30 ℃，采樣時(shí)間為70 min[3]。

1.2.4 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)

精密吸取龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、獐芽菜苦苷、馬錢(qián)苷酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

將“1.2.2”中獲得的提取液分別在放置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h后進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，并計(jì)算RSD值。

（3）重復(fù)性

對(duì)各提取液進(jìn)行3次進(jìn)樣，制備供試品溶液，記錄指紋圖譜，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均值[4]。

1.2.5 成分變化百分率計(jì)算

成分變化百分率采用公式（1）計(jì)算。

公式中的Ai指的是第i個(gè)劑量中某峰面積，A0指的是未輻照樣品中某峰的峰面積，Wi指的是i個(gè)劑量供試品稱(chēng)樣量，W0指的是未輻照樣品稱(chēng)樣量。將成分變化百分率作為縱坐標(biāo)，輻照劑量作橫坐標(biāo)，對(duì)比指紋圖譜各峰變化的情況。

1.3 方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)上述穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)分析，表明該試驗(yàn)方法精密度、重復(fù)性良好，供試品溶液在48 h之內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果分析

3.1 成分變化

圖1和圖2為龍膽、秦艽3批樣品在輻照劑量中的成分和未輻照樣品對(duì)比情況?？梢钥闯?，龍膽輻照之后峰1含量提高，25kGy輻照之后3批樣品峰1含量分別為113%、127%和127%。峰7通過(guò)輻照之后含量在不斷降低，10kGy輻照之后3批樣品龍膽苦苷含量為未輻照樣品的65%、59%、56%，25kGy輻照之后龍膽苦苷含量是未輻照樣品的39%、45%、38%，其他峰沒(méi)有明顯改變。

秦艽輻照之后峰8（龍膽苦苷）含量降低，10 kGy輻照之后3批樣品龍膽苦苷含量為未輻照樣品的74%、73%和66%；25kGy輻照后龍膽苦苷含量為未輻照樣品的65%、58%、49%。峰7含量也不斷降低，通過(guò)25kGy輻照后3批樣品是未輻照樣品的83%、77%、69%。峰1含量不斷增加，變化并不明顯，其他峰沒(méi)有改變[5]。

圖1 3批龍膽樣品在不同輻照劑量下的成分和未輻照樣品對(duì)比情況

圖2 3批秦艽樣品在不同輻照劑量下的成分和未輻照樣品對(duì)比情況

3.2 相似度分析

使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》分析輻照前后色譜圖，各批樣品將同批未輻照樣品作為對(duì)照，對(duì)其他輻照劑量中色譜圖相似度進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，輻照之后的秦艽和龍膽樣品與同批次輻照之前樣品色譜圖的相似度大于0.95。圖3為秦艽樣品的聚類(lèi)圖。因?yàn)椴糠值姆迕娣e增加或者降低，沒(méi)有峰個(gè)數(shù)缺失或者增加，因此輻照之后樣品指紋圖譜和輻照前的樣品具有較高的相似度，在輻照劑量不斷增加中，相似度也在不斷的降低。

3.3 主要已知成分定量結(jié)果

使用外標(biāo)法對(duì)已知4個(gè)成分定量。表1為沒(méi)有輻照和經(jīng)25kGy劑量輻照的3批龍膽與秦艽樣品中4個(gè)成分的含量?？梢钥闯?，輻照之后龍膽苦苷含量明顯降低，其他3個(gè)成分含量變化不大或有少量減少，規(guī)律和3.1相同，也與《中國(guó)藥典》中的結(jié)果相同[6]。

圖3 秦艽樣品的聚類(lèi)圖

表1 沒(méi)有輻照和經(jīng)25kGy劑量輻照的龍膽和秦艽中4個(gè)成分含量的對(duì)比

4 結(jié)論

創(chuàng)建指紋圖譜方法能夠滿足秦艽和龍膽輻照前后成分含量改變的研究需求。研究結(jié)果表明，秦艽和龍膽中龍膽苦苷的含量隨著輻照劑量的增加而降低，與其他研究人員研究結(jié)果一致；龍膽中未知色譜峰（峰1）在輻照之后含量不斷增加，秦艽中獐芽菜苦苷含量不斷降低，未在其他研究中發(fā)現(xiàn)相似變化。