鈣離子ATP酶2a基因修飾的骨髓干細(xì)胞移植治療大鼠慢性心力衰竭

王曉露

（山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院，山西太原030025）

心力衰竭是各類型心臟疾病進(jìn)展至終末期的常見疾病類型，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年因心力衰竭死亡患者有40萬，其死亡率占同期心血管疾病的40%[1]。該病具有較高的致殘率、致死率，明顯增加了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及衛(wèi)生資源，成為全球關(guān)注的重點(diǎn)問題。近年來，藥物對(duì)心力衰竭的治療取得一定進(jìn)展，但其療效欠佳，預(yù)后較差[2]。而心臟移植手術(shù)供體缺乏、排斥反應(yīng)明顯，心肌成形術(shù)難以耐受，故需探索一種新的治療方法?；虔煼?、細(xì)胞移植是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的治療策略，但基因療法需明確致病靶基因，降低基因表達(dá)擴(kuò)散以及細(xì)胞移植的保護(hù)，提高其存活率等問題仍需進(jìn)一步處理[3]。因此有研究[4]將基因療法與細(xì)胞移植相結(jié)合，以此修正兩種療法的缺陷，充分發(fā)揮治療作用。本研究擬建立慢性心力衰竭大鼠模型，分析鈣離子ATP酶2a基因修飾的骨髓干細(xì)胞移植治療作用，旨在為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取由北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的雄性SD大鼠及雌性SD大鼠，4周齡，清潔級(jí)。將雄性大鼠作為骨髓供體，36只雌性大鼠為細(xì)胞移植受體及基因治療的受體，體重200～250g；正常飲食、飲水。

1.2 試劑與儀器

浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)的小動(dòng)物呼吸機(jī)，德國Leica公司生產(chǎn)的冰凍切片機(jī)，Philips公司生產(chǎn)的心臟超聲心動(dòng)圖。胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基、胰蛋白酶由Sigma公司提供，氯胺酮由上海第一生化藥業(yè)公司提供，蛋白酶K由北京精益化工產(chǎn)品公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

模型建立：將36只雌性大鼠進(jìn)行慢性心力衰竭大鼠模型建立，左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎，制作模型，造模成功后將其分為4組：對(duì)照組（n=9），腺病毒空載體；A組（n=9），鈣離子ATP酶2a基因治療；B組（n=9），骨髓干細(xì)胞移植治療；C組（n=9），經(jīng)基因修飾后的骨髓干細(xì)胞移植治療。另選取雄性大鼠作為骨髓供體。

骨髓干細(xì)胞：雄性大鼠乙醚麻醉后，處死。取下肢長骨，骨腔沖洗，離心10 min，轉(zhuǎn)速15 000 r/min，留取中間層液體，添加磷酸鹽緩沖液，離心3次，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，丟棄淋巴細(xì)胞分離液。將細(xì)胞添加培養(yǎng)瓶（含有20%胎牛血清、青霉素100 mg/L、鏈霉素100 mg/L）內(nèi)，37 ℃，置入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3 d更換一次液，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長。當(dāng)其將近鋪滿瓶底，進(jìn)行傳代至第3代，取出非貼壁的球形骨髓造血細(xì)胞，獲取純化骨髓干細(xì)胞。

骨髓干細(xì)胞生長至90%并匯合，培養(yǎng)液吸取，置入鈣離子ATP酶2a病毒工作液、無血清的IMDM培養(yǎng)基，將其孵化12 h，病毒液吸取后繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染第2 d，顯微鏡下觀察細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)，收取細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞變圓以完全培養(yǎng)基停止消化，離心10 min，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，丟棄上清液，觀察計(jì)數(shù)。B、C組移植5×106個(gè)細(xì)胞。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）大鼠模型建立后，于治療前、治療后采用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)其心臟功能，包括左室前壁、室間隔收縮與舒張期縱向峰值速度、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；（2）統(tǒng)計(jì)骨髓干細(xì)胞陽性率，即利用染料Hoechest標(biāo)記，選取10個(gè)視野內(nèi)陽性細(xì)胞比例；（3）統(tǒng)計(jì)肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a基因及蛋白表達(dá)，提取心肌組織內(nèi)的DNA、RNA，以PCR鑒定；取心肌組織2g，以組織裂解液裂解，反復(fù)凍融，離心，采集上清蛋白質(zhì)樣本，并測定其含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用（±s）表示，采取重復(fù)方差F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分比率（%）表示，采取χ2檢驗(yàn)；P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性心力衰竭模型建立

大鼠行左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎4周后，超聲心動(dòng)圖測定左室射血分?jǐn)?shù)≤45%，左室短軸切面呈不規(guī)則扭動(dòng)或不規(guī)則擺動(dòng)，各切面左室前壁、側(cè)壁菲薄，向外膨出，室壁節(jié)段性運(yùn)動(dòng)異常，對(duì)側(cè)室壁運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)。長軸切面顯示左室輪廓擴(kuò)大呈球形，即為慢性心力衰竭建立成功。

2.2 骨髓干細(xì)胞移植存活率

治療21 d，經(jīng)連續(xù)切片綠色熒光染色檢測，C組骨髓干細(xì)胞移植存活率98%，B組骨髓干細(xì)胞移植存活率72%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05）。

2.3 心臟功能

如表1所示，治療后21 d，A、B、C組的LVEF明顯高于對(duì)照組，左室前壁、室間隔收縮與舒張期縱向峰值速度高于對(duì)照組，其中C組較A、B組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05）。

表1 比較四組LVEF及左室前壁、室間隔收縮與舒張期縱向峰值速度

2.4 肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a基因及蛋白表達(dá)

如表2所示，治療后21 d，A、C組肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a基因及蛋白表達(dá)明顯高于B組、對(duì)照組，其中C組表達(dá)提高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤ 0.05）。

表2 肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a蛋白表達(dá)（U/mg）

3 討論

近年來，我國心力衰竭發(fā)生率及帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)呈逐年增加趨勢(shì)，成為世界衛(wèi)生組織重點(diǎn)關(guān)注的疾病。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，對(duì)心力衰竭致病機(jī)制的研究日漸深入，并提出基因療法、細(xì)胞移植療法，以期保護(hù)心肌組織，挽救瀕臨死亡的心肌組織，增強(qiáng)心肌功能[5]?，F(xiàn)今，基因療法集中在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其面臨的主要問題是如何發(fā)現(xiàn)并解決致病靶基因，提高基因轉(zhuǎn)染率，確定轉(zhuǎn)向?qū)Щ蜉d體，進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控[6]。細(xì)胞移植是當(dāng)前治療心臟疾病的新型研究策略，多種細(xì)胞類型已用于臨床研究，其中以骨髓干細(xì)胞具有獨(dú)特的增殖、多向分化作用，可轉(zhuǎn)為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞，但細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間的作用，會(huì)影響細(xì)胞分化，且細(xì)胞存活率也受到臨床重點(diǎn)關(guān)注。故此，在基因修飾下進(jìn)行細(xì)胞移植，在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，可有效調(diào)控基因表達(dá)，降低基因表達(dá)的失控率，提高基因療法的安全性；同時(shí)移植細(xì)胞經(jīng)基因修飾，可提高移植細(xì)胞的存活率及存活功能。兩者相互補(bǔ)充、相互作用，將骨髓干細(xì)胞作為載體，結(jié)合基因修飾作用，能夠發(fā)揮潛在的治療優(yōu)勢(shì)[7]。

在心力衰竭病理狀態(tài)下，肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a基因mRNA豐度、蛋白表面明顯降低，使Ca2+的穩(wěn)態(tài)及活動(dòng)異常，致心肌收縮力降低。肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶主要分布在心肌肌漿網(wǎng)，可調(diào)整心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定及活動(dòng)，與心肌收縮、舒張功能密切相關(guān)，且參與了心肌細(xì)胞電節(jié)律、凋亡等生理活動(dòng)[8]。肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a基因作為治療心力衰竭的新型靶基因，在機(jī)體生理狀態(tài)下，會(huì)消耗ATP逆濃度，將胞漿內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)移至肌漿網(wǎng)，同時(shí)在磷酸化時(shí)，可使受磷蛋白（PLM）肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a基因復(fù)合物結(jié)締，增強(qiáng)對(duì)Ca2+的親和性[9]。但其表達(dá)率、轉(zhuǎn)染率的控制，仍影響著臨床治療。骨髓干細(xì)胞治療策略可提高心力衰竭的心臟功能，縮小梗死面積，增加室壁厚度，但細(xì)胞存活率較低。故采用鈣離子ATP酶2a基因修飾的骨髓干細(xì)胞移植治療策略，利用鈣離子ATP酶2a基因轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞后，成功組裝并表達(dá)鈣離子ATP酶2a基因蛋白，以此發(fā)揮基因療法及細(xì)胞移植的作用[10]。本組研究中，治療21d，C組骨髓干細(xì)胞移植存活率為98%，高于B組的72%，B、C組的LVEF高于對(duì)照組，左室前壁、室間隔收縮與舒張期縱向峰值速度高于對(duì)照組，其中C組較A、B組升高明顯（P≤0.05）。A、C組肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a基因及蛋白表達(dá)明顯高于B組、對(duì)照組，其中C組表達(dá)提高明顯（P≤0.05）。研究提示，較單純基因療法、細(xì)胞移植策略相比，鈣離子ATP酶2a基因轉(zhuǎn)染骨髓干細(xì)胞治療慢性心力衰竭，可顯著恢復(fù)大鼠的心功能，具有更為穩(wěn)定、持久的作用效應(yīng)，且骨髓干細(xì)胞移植能夠有效調(diào)控基因表達(dá)；而基因修飾能夠提高移植細(xì)胞存活率及治療效應(yīng)。

4 結(jié)論

鈣離子ATP酶2a基因修飾的骨髓干細(xì)胞移植治療大鼠慢性心力衰竭具有一定效果，心臟功能改善明顯，將骨髓干細(xì)胞作為治療基礎(chǔ)的細(xì)胞載體，以基因修飾細(xì)胞，兩者相互作用，可提高其治療作用。