發(fā)酵型黃精米酒動力學及抗氧化性研究

汪 濤，裴海生，王民敬，胡雪芳，唐維媛，張志民

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工工程研究所，北京 100121；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點實驗室，北京 100121；3.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025；4.貴州理工學院，貴陽 550003）

黃精（Polygonatum sibiricum）又名雞頭黃精，我國首批進入食藥同源的品種，黃精富含活性多糖、黃酮類化合物、多酚類化合物、甾體皂苷、蒽醌類化合物、生物堿和多種人體有用氨基酸類化合物[1]。經(jīng)研究，黃精在治療疲勞、降血糖、提高免疫和緩解性功能障礙等方面均有很好的療效[2-4]。李錦松等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃精有助于釀酒酵母的生長，并能提高黃酒的產(chǎn)酒率和體外抗氧化能力。

發(fā)酵動力學主要是研究微生物生長、產(chǎn)物生成及底物消耗隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律構(gòu)建適合的數(shù)學模型，并通過模型對發(fā)酵生產(chǎn)進行工藝控制、定量分析和各項指標的準確預(yù)測；還可以通過模型預(yù)判發(fā)酵初期出現(xiàn)的異常情況，對過渡到工業(yè)發(fā)酵具有實際的指導意義[6-8]。李秀萍等[9]采用Logistic和Leudeking-Piret模型，構(gòu)建甘蔗果酒發(fā)酵過程中酵母菌生長、酒精生成及底物消耗動力學模型，擬合度R2分別為0.983 2、0.972 4和0.972 1，能準確模擬甘蔗果酒的發(fā)酵過程，有利于其工業(yè)化生產(chǎn)。蔣艾廷等[10]采用Matlab軟件對一株優(yōu)選釀酒酵母構(gòu)建發(fā)酵動力模型，對發(fā)酵過程中微生物數(shù)量的變化和葡萄糖的消耗分別進行非線性擬合，擬合度R2分別為0.997 2和0.978 4，擬合效果較好，說明擬合模型能很好的描述該菌的發(fā)酵過程。

目前，發(fā)酵型黃精米酒的研究主要集中在發(fā)酵工藝方面，陶濤[11]運用響應(yīng)面法研究發(fā)酵型黃精米酒加工工藝；梁安怡[12]通過正交試驗優(yōu)選出發(fā)酵型黃精米酒的最佳釀制條件。但關(guān)于發(fā)酵型黃精米酒在發(fā)酵過程中酵母菌生長、酒精生成及殘?zhí)窍膭恿W特征方面的研究鮮有報道。本試驗采用經(jīng)典的“S”曲線模型對發(fā)酵型黃精米酒發(fā)酵過程中酵母菌含量變化、酒精生成及殘?zhí)窍倪M行非線性擬合，構(gòu)建發(fā)酵動力學模型。測定發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的變化，同時結(jié)合總抗氧化能力試劑盒法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法和鄰苯三酚自氧化物法探討不同發(fā)酵時間發(fā)酵型黃精米酒的抗氧化性。通過對發(fā)酵型黃精米酒動力學及抗氧化性的研究分析，為后期工業(yè)生產(chǎn)和產(chǎn)品的定位提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精（Polygonatum sibiricum）：遼寧澳地森生物工程有限公司；圓江糯米：盤錦大米集團；釀酒酵母：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院；酒曲：雅大科技實業(yè)有限公司。

麥芽汁培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博覽生物技術(shù)有限公司；亞鐵氰化鉀、沒食子酸標準品、蘆丁標準品、鄰苯三酚、DPPH自由基（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

CH-270LFJG-00米酒發(fā)酵罐：上海承歡輕工機械有限公司；酒精計：廣州市銘睿電子科技有限公司；LDZX-50KBS立體式高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：西安喬普生物科技有限公司；HZQ-C空氣浴振蕩器：東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)技術(shù)有限公司；PB-10 酸度計：杭州微米派科技有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵型黃精米酒工藝流程

糯米汽蒸后冷卻至常溫，添加0.6%酒曲糖化24 h后，接種2%釀酒酵母并加入7%的黃精粉發(fā)酵，28 ℃進行主發(fā)酵6 d，結(jié)束后將溫度降至15 ℃進入后發(fā)酵14 d。主發(fā)酵每隔1 d取樣，后發(fā)酵每隔2 d取樣。

1.3.2 發(fā)酵動力學指標測定方法

菌含量：細胞干質(zhì)量法[7]；酒精度、殘?zhí)呛堪碐B/T 13662—2008《黃酒》測定[13]。

1.3.3 總酚、總黃酮含量的測定

總酚含量：采用Folin-Ciocalteu法[14]測定；沒食子酸標準曲線回歸方程：y=0.845 8x+0.034 2，R2=0.999 5。

總黃酮含量：采用分光光度法[14]測定；蘆丁標準曲線回歸方程：y=0.299 6x+0.021 7，R2=0.999 3。

1.3.4 總抗氧化能力的測定

按照總抗氧化能力測定試劑盒法[15]操作步驟測定總抗氧化能力。按下式計算總抗氧化能力：

1.3.5 O2-·清除率的測定

取1.0 mL樣品與5.0 mL Tris-HCl溶液（pH8.2）混勻，25 ℃水浴20 min后加入0.05 mol/L鄰苯三酚溶液1.0 mL，搖勻，25℃水浴5 min，加入濃鹽酸1.0 mL終止反應(yīng)，蒸餾水調(diào)零，在波長325nm處測定樣品吸光度值[16]。按下式計算O2-·清除率。

式中：A0為蒸餾水代替樣品的吸光度值；Ax0為蒸餾水代替鄰苯三酚的吸光度值；Ax為樣品的吸光度值。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測定

取2.0 mL樣品與2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混勻，暗反應(yīng)30 min，蒸餾水調(diào)零，在波長517 nm處測定吸光度值（Ax）；同樣測定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液與2.0 mL體積分數(shù)70%的乙醇溶液的吸光度值（A0）；以及2.0 mL樣品與體積分數(shù)70%的乙醇溶液的吸光度值（Ax0）[17]。按下式計算DPPH自由基清除率。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 2017軟件對實驗數(shù)據(jù)作圖分析，選取典型“S”曲線模型對酵母菌含量、酒精度及殘?zhí)呛窟M行非線性擬合，選擬合度R2大的數(shù)學模型描述其發(fā)酵動力學特征，并應(yīng)用SPSS 19.0軟件對最佳模型預(yù)測值與實驗值進行T顯著性檢驗。應(yīng)用Origin 2017軟件對發(fā)酵過程中總酚含量、總黃酮含量及抗氧化性變化進行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中酵母菌含量、酒精度及殘?zhí)呛康淖兓闆r

由圖1可知，酵母菌在發(fā)酵1～4 d經(jīng)歷遲滿滯期和對數(shù)期，菌體含量大幅度增加。發(fā)酵4～6 d酵母菌增殖進入穩(wěn)定期，菌體含量最大為21.9 g/L。發(fā)酵6 d后酵母菌進入衰亡期，菌體含量開始減少，主要原因是隨著發(fā)酵時間的延長，還原糖快速消耗，酒精度快速上升，菌體出現(xiàn)自溶和沉淀；另外，發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化，使發(fā)酵醪液的滲透壓升高，嚴重抑制酵母菌的代謝[18]。酒精度在發(fā)酵1～6 d增長速度較快，發(fā)酵6 d后，酒精度增加極其緩慢基本趨于穩(wěn)定，酒精度最高為11.4%vol。由于酵母菌將殘?zhí)寝D(zhuǎn)化為酒精及合成自身所需要的能量物質(zhì)，殘?zhí)呛恐饾u降低，發(fā)酵1～6 d降低速度較快；到6 d后因為酵母菌的衰老和數(shù)量的減少，殘?zhí)呛炕痉€(wěn)定在較低的水平。

圖1 發(fā)酵過程中酵母菌含量、酒精度及殘?zhí)呛康淖兓厔軫ig.1 Change trends of yeast number,alcohol content and residual sugar content during fermentation process

2.2 發(fā)酵型黃精米酒動力學模型

2.2.1 酵母菌生長動力學模型

對發(fā)酵1～6 d酵母菌生長情況進行非線性擬合，通過SGompertz模型、DoseResp模型和Logistic模型進行擬合，結(jié)果見表1。由表1可知，擬合度R2分別為0.936 7、0.997 5和0.992 5，故選DoseResp模型對酵母菌生長進行擬合，擬合曲線如圖2所示。

表1 酵母菌含量擬合方程及R2值Table 1 Fitting equation of yeast number and R2 value

圖2 DoseResp模型下酵母菌生長擬合曲線Fig.2 Fitting curve of yeast growth with DoseResp model

由表2可知，在置信區(qū)間95%，顯著水平α=0.05時，t1（0.05）=0.496 7，檢驗值T1=-0.008 2＜t1（0.05），說明預(yù)測值與實驗值不存在顯著性差異（P＞0.05），DoseResp模型能很好的模擬發(fā)酵過程中酵母菌生長情況。

表2 酵母菌生長模型預(yù)測值與實驗值T檢驗結(jié)果Table 2 Comparison of model and experimental values for yeast growth by T test results

2.2.2 酒精生成動力學模型

通過Boltzmann模型、DoseResp模型和Logistic模型對發(fā)酵過程中酒精生成進行非線性擬合，如表3所示。由表3可知，擬合度R2分別為0.995 3、0.995 3和0.990 6，故選Boltzmann模型和DoseResp模型對酒精生成進行擬合，擬合曲線如圖3和圖4所示。

表3 酒精生成擬合方程及R2值Table 3 Fitting equation of alcohol formation and R2 value

圖3 Boltzmann模型下酒精生成擬合曲線Fig.3 Fitting curve of alcohol formation with Boltzmann model

圖4 DoseResp模型下酒精生成擬合曲線Fig.4 Fitting curve of alcohol formation with DoseResp model

表4 酒精生成模型預(yù)測值與實驗值T檢驗結(jié)果Table 4 Comparison of model and experimental values for alcohol formation by T test results

由表4可知，在置信區(qū)間95%，顯著水平α=0.05時，t2（0.05）=0.477 3，檢驗值T2=-0.058 1＜t2（0.05），檢驗值T3=1.113 6E-5＜t2（0.05），說明兩模型預(yù)測值與實驗值不存在顯著性差異（P＞0.05），Boltzmann模型與DoseResp模型均能很好的模擬發(fā)酵過程中酒精生成情況。

2.2.3 殘?zhí)窍膭恿W模型

通過Boltzmann模型，DoseResp模型和Logistic模型對發(fā)酵過程中殘?zhí)窍倪M行非線性擬合，如表5所示。由表5可知，擬合度R2分別為0.993 2、0.993 2和0.982 7，故選Boltzmann模型和DoseResp模型對殘?zhí)窍倪M行擬合，擬合曲線如圖5和圖6所示。

表5 殘?zhí)窍臄M合方程及R2值Table 5 Fitting equation of residual sugar consumption and R2 value

圖5 Boltzmann模型下殘?zhí)窍臄M合曲線Fig.5 Fitting curve of residual sugar consumption with Boltzmann model

由表6可知，在置信區(qū)間95%，顯著水平α=0.05時，t3（0.05）=0.5，檢驗值T4=-1.70146E-5＜t3（0.05），檢驗值T5=-0.023 3＜t3（0.05），說明兩模型預(yù)測值與實驗值不存在顯著性差異（P＞0.05），Boltzmann模型與DoseResp模型均能很好的模擬發(fā)酵過程中殘?zhí)窍那闆r。

圖6 DoseResp模型下殘?zhí)窍臄M合曲線Fig.6 Fitting curve of residual sugar consumption with DoseResp model

表6 殘?zhí)窍哪Ｐ皖A(yù)測值與實驗值T檢驗結(jié)果Table 6 T test results of model and experimental values for residual sugar consumption

2.3 發(fā)酵過程中總酚、總黃酮含量的變化情況

圖7 發(fā)酵過程中總酚含量的變化趨勢Fig.7 Change trends of total phenols contents during fermentation process

由圖7可知，總酚含量呈先增加后降低并緩慢趨于穩(wěn)定的趨勢，一方面是因為隨著發(fā)酵的進行酒精度不斷的上升，且酚類物質(zhì)易溶于有機溶劑；另一方面可能是酚類化合物在發(fā)酵液中發(fā)生了氧化和降解反應(yīng)[19]。發(fā)酵1～6 d期間總酚含量呈上升趨勢，最高含量達4.87 mg/mL；發(fā)酵6 d后總酚含量開始降低并趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時總酚含量顯著高于發(fā)酵初始水平（P＜0.05）。

由圖8可知，總黃酮含量總體較低，變化趨勢與總酚含量類似。主發(fā)酵期間總黃酮含量快速增長，發(fā)酵8 d時總黃酮含量最大為0.34 mg/mL，發(fā)酵8 d后呈下降趨勢直至穩(wěn)定。主發(fā)酵階段總黃酮含量增加較快，與酒精含量的增加趨勢基本吻合，原因是酒精有助于黃酮類化合物的溶出；后發(fā)酵階段總黃酮含量的降低主要是因為酵母菌代謝的次級代謝產(chǎn)物與黃酮類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成大分子的衍生物，此外發(fā)酵過程中一些不穩(wěn)定的類黃酮化合物會降解成分子量較小的酚單元[19-20]。

圖8 發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化趨勢Fig.8 Change trends of total flavonoids contents during fermentation process

2.4 發(fā)酵過程中抗氧化性的變化情況

2.4.1 發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化趨勢

圖9 發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化趨勢Fig.9 Change trends of total antioxidant capacity during fermentation process

由圖9可知，總抗氧化能力呈先增加后降低的變化趨勢，總抗氧化能力與總酚、總黃酮含量的變化趨勢相對應(yīng)，發(fā)酵到第6天時總抗氧化能力最大為63.43單位/mL，發(fā)酵6 d后由于總酚、總黃酮等抗氧化活性成分含量的降低，總抗氧化能力也隨之下降[21]。

2.4.2 發(fā)酵過程中O2-·和DPPH·清除率的變化趨勢

圖10 發(fā)酵過程中O2-·和DPPH·清除率的變化趨勢Fig.10 Change trends of O2-·and DPPH·svavenging rates during fermentation process

由圖10可知，O2-·和DPPH·清除率均為先增加后降低的變化趨勢，總體變化不顯著（P＞0.05）。隨著發(fā)酵的進行抗氧化物質(zhì)浸出增多，O2-·和DPPH·清除率也相應(yīng)的增加，發(fā)酵第3天時DPPH·清除率最高為95.53%，第6天時O2-·清除率最高為67.36%；繼續(xù)發(fā)酵后，自由基清除率開始下降。

3 結(jié)論

采用Boltzmann模型和DoseResp模型對發(fā)酵型黃精米酒在發(fā)酵過程中酵母菌生長、酒精生成和殘?zhí)窍倪M行非線性擬合，同時對模型預(yù)測值和實驗值進行T顯著性檢驗，T檢驗結(jié)果均不顯著（P＞0.05），說明所選擬合方程能夠很好的模擬發(fā)酵過程及描述其動力學特征；發(fā)酵過程中總酚含量、總黃酮含量、總抗氧化能力、O2-·和DPPH·清除率均呈現(xiàn)先增加后降低并趨于穩(wěn)定的趨勢，在主發(fā)酵階段呈上升趨勢，后發(fā)酵階段呈下降趨于穩(wěn)定的趨勢。通過對發(fā)酵型黃精米酒動力學及抗氧化性研究，可以為后期工業(yè)生產(chǎn)和產(chǎn)品定位提供理論指導。