腐胺對高齡女性卵巢的作用

甘冬英 韓閣閣 劉嘉茵 胡艷秋

隨著人口預(yù)期壽命的增長及工業(yè)化社會變革，女性生育年齡越來越高。在中國，由于二胎政策的放開,高齡孕婦越來越多。然而，高齡女性在不孕、流產(chǎn)、出生缺陷等方面存在更大風(fēng)險。因為高齡女性卵巢功能下降、產(chǎn)生的卵母細(xì)胞質(zhì)量變差。雖然輔助生殖技術(shù)幫助數(shù)百萬女性實現(xiàn)了生育,但不能解決女性卵巢衰老的根本問題即卵子數(shù)量和質(zhì)量下降，尋找一個理想的干預(yù)措施是解決生殖衰老的關(guān)鍵[1]。多種哺乳動物的卵巢組織在排卵前鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)活性(腐胺從頭合成的限速酶)及腐胺短暫升高。高齡女性卵巢ODC活性和腐胺下降，且補(bǔ)充腐胺可以減少卵母細(xì)胞非整倍體率、減少胚胎畸形率，提示排卵前ODC活性和腐胺的升高可能是一個進(jìn)化保護(hù)機(jī)制[2]。本文就高齡女性卵巢特點、腐胺的來源和體內(nèi)調(diào)節(jié)及對卵巢的作用進(jìn)行綜述。

一、高齡女性卵巢的特點

高齡女性卵巢特點主要表現(xiàn)在卵巢儲備功能下降及卵母細(xì)胞質(zhì)量降低。卵巢儲備功能降低包括與年齡相關(guān)生理性和與年齡無關(guān)非生理性卵巢儲備功能降低。本文主要關(guān)注前者即人類生育潛能隨年齡增長而下降，表現(xiàn)為妊娠率降低、流產(chǎn)率增加、生育平均間隔時間延長等。卵巢儲備參考評估指標(biāo)很多，如卵巢超聲檢查基礎(chǔ)竇狀卵泡數(shù)(antral follicle count，AFC)、抗苗勒管激素(serum anti-Mullerian hormone，AMH)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、雌二醇、抑制素 B(inhibin B，INH B)等。本文簡要描述高齡女性卵巢以AFC、AMH為代表的卵巢儲備下降特點及自由基、線粒體DNA突變對卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響。

1.卵巢儲備功能下降

(1)基礎(chǔ)竇狀卵泡數(shù)降低。卵巢中的卵泡出生時約100～200萬個，到月經(jīng)初潮時，卵巢中僅剩余約30～40萬個卵泡，在絕經(jīng)期時卵巢殘留的卵泡數(shù)不足1000個。 女性一生有超過99.9% 的卵泡都相繼發(fā)生閉鎖，僅400～500 個始基卵泡發(fā)育成熟并排卵。研究發(fā)現(xiàn)，在20～41歲月經(jīng)規(guī)則女性中，小竇卵泡(2～7 mm)每年下降4.4%，提示基礎(chǔ)竇狀卵泡數(shù)隨著年齡的增加而逐漸降低[3]。此外，不孕女性中只有40.0%竇卵泡數(shù)大于10個，而86.7%正常生育力女性的竇卵泡數(shù)大于10個，說明不孕女性比正常生育力女性下降更明顯[4]。

(2)血清抗苗勒管激素下降。AMH屬于轉(zhuǎn)化生長因子家族中一員，由小卵泡中顆粒細(xì)胞分泌。AMH在月經(jīng)周期中變化不大，是反應(yīng)卵巢儲備功能的良好指標(biāo)。AMH在幼年期幾乎檢測不到，在青春期啟動時快速提高。研究發(fā)現(xiàn)25至35歲之間的女性，AMH每年下降1.4 pmol/L，大于35歲時，每年下降0.7 pmol/L，大于40歲時，每年下降1.4 pmol/L，到了更年期則檢測不到，說明AMH隨年齡的增長呈逐漸下降趨勢[5]。

2.卵母細(xì)胞質(zhì)量下降

(1)自由基及抗氧化系統(tǒng)。對不同月份的雌性C57BL/6小鼠研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，卵巢間質(zhì)細(xì)胞及卵泡氧化脂質(zhì)、蛋白、DNA含量增加，抗氧化基因、線粒體及胞質(zhì)中的抗氧化酶基因表達(dá)減少。說明在卵巢衰老過程中，卵巢細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御能力下降，清除自由基能力降低，造成自由基過量堆積，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致卵巢抗氧化損傷增加[6]。

(2)線粒體DNA突變及缺失。線粒體分布于能量需求最大的卵質(zhì)區(qū)域，如減數(shù)分裂紡錘體的組裝和拆卸。隨著年齡增加，卵母細(xì)胞線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)不穩(wěn)定性增加、DNA突變增加，mtDNA數(shù)量減少，出現(xiàn)形態(tài)及功能的異常。表現(xiàn)為線粒體腫脹、空泡化、嵴改變，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化異常、供能障礙，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞的發(fā)生及成熟過程出現(xiàn)異常，如卵母細(xì)胞減數(shù)分裂時紡錘體形成不佳，不利于染色體分離，增加卵母細(xì)胞非整倍體率[7]。

二、腐胺的來源及其在體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)

腐胺是一種二胺,化學(xué)結(jié)構(gòu)為NH2-CH2CH2CH2CH2-NH2，水溶性，存在于多種器官如胰腺、胸腺、皮膚、腦、子宮、卵巢。且隨著年齡的增加，腐胺水平逐漸下降。腐胺也普遍存在食物中，如麥芽、青椒、大豆、開心果、橙子等[8]。腐胺的來源有外源性和內(nèi)源性兩種途徑。外源性經(jīng)典來源：精氨酸和脯氨酸通過代謝生成鳥氨酸，鳥氨酸在ODC作用下脫羧基轉(zhuǎn)化生成腐胺；外源性非經(jīng)典來源：精氨酸在精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase,ADC)作用下合成胍丁胺，胍丁胺在胍丁胺水解酶作用下生成腐胺。內(nèi)源性來源：精胺與亞精胺/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N1-acetyltransferase,SAT1)、多胺氧化酶(polyamine oxidase)的結(jié)合，轉(zhuǎn)化為亞精胺，亞精胺同樣途徑轉(zhuǎn)化為腐胺[9]。見圖1。

腐胺穩(wěn)定主要依靠三方面調(diào)節(jié)：合成調(diào)節(jié)、分解代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)。ODC是腐胺合成的限速酶，合成調(diào)節(jié)最主要的是調(diào)節(jié)ODC活性。鳥氨酸脫羧酶抗酶(ornithine decarboxylase antizyme，AZI)與ODC的26s蛋白酶體結(jié)合促進(jìn)ODC降解，鳥氨酸脫羧酶抗酶抑制劑(ornithine decarboxylase antienzymeinhibitor，AZIN)與AZI競爭，以更高親和力結(jié)合ODC，抑制ODC被AZI降解，AZI-AZIN通過控制ODC活性來調(diào)節(jié)腐胺的合成。此外，腐胺可以負(fù)反饋抑制ODC、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(s-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)、SAT1和AZIN翻譯，減少腐胺合成原料、促進(jìn)腐胺-亞精胺-精胺正向合成、抑制其逆向轉(zhuǎn)化，從而負(fù)向調(diào)節(jié)自身合成。在細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)中,腐胺和肝素化磷脂酰肌醇聚糖-1分子(heparansulfate on glypican-1 molecules，HSG)結(jié)合，以受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)游離腐胺通過可溶性載體SLC3A2轉(zhuǎn)出。此外AZI減少腐胺轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，而AZIN通過與AZI負(fù)性作用刺激腐胺攝取[10]。見圖1。

三、腐胺對卵巢的作用

1.腐胺對卵母細(xì)胞的影響

(1)降低卵子非整倍體率。高齡女性面臨生育難題的很大原因歸于卵子非整倍體率高，其將導(dǎo)致胚胎染色體異常、流產(chǎn)或出生缺陷。高齡卵子非整倍體率高于年輕女性，因為卵子在長達(dá)10～50年的發(fā)生過程中減數(shù)分裂時同源染色體或/和姐妹染色單體錯誤分離。這可能是因為染色體著絲粒和染色體臂的黏連蛋白隨著年齡的增長逐漸減少，也可能是紡錘體形成異常以致染色體非直線排列于赤道板上[2]，最終導(dǎo)致染色體分離障礙。研究發(fā)現(xiàn)排卵前高齡小鼠卵巢中的ODC和腐胺含量降低，補(bǔ)充腐胺可改善妊娠結(jié)局[2,11]，這表明腐胺在短暫的排卵過程中扮演著重要角色。如果促使高齡小鼠排卵前ODC升高，能使卵子非整倍體率從12.7%降至5.3%。而高齡女性O(shè)DC活性在排卵前較年輕女性低[2]，ODC降低導(dǎo)致卵子非整倍體增加。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂在排卵期的短暫時間排出第一極體，成為次級卵母細(xì)胞，這說明腐胺對卵母細(xì)胞成熟過程中染色體的正確分離起重要作用。此外，未成熟卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加鳥氨酸脫羧酶抑制劑α-二氟基鳥氨酸(α-difluoromethyl ornithine，DFMO),卵母細(xì)胞非整倍體率明顯增加，可能是ODC在減數(shù)分裂I期中保護(hù)靠近著絲粒的黏連蛋白，促進(jìn)同源染色體分開的同時，保護(hù)兩條姐妹染色單體，減少其過早分離，從而減少卵母細(xì)胞非整倍體率[12]。

(2)促進(jìn)卵母細(xì)胞質(zhì)成熟。研究表明大多數(shù)自發(fā)性流產(chǎn)胚胎是整倍體[13]，說明非整倍體不是造成胚胎發(fā)育不良的主要原因，但在高齡小鼠中補(bǔ)充腐胺可降低胎兒自發(fā)流產(chǎn)率(從60.0%至28.0%)[11]。可能腐胺對卵母細(xì)胞核及胞質(zhì)質(zhì)量扮演重要角色。還有研究表明，去卵質(zhì)卵子與正常精子結(jié)合形成的受精卵發(fā)育成囊胚時OCT4陽性細(xì)胞比例喪失，但高齡小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加腐胺可以提高囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)OCT4陽性細(xì)胞比，可能是因為腐胺促進(jìn)卵細(xì)胞胞質(zhì)成熟從而提高胚胎發(fā)育潛能[14]。

圖1 腐胺的來源及其調(diào)節(jié)注:ADC:arginine decarboxylase精氨酸脫羧酶；SAT1:N1-acetyltransferase亞精胺/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶；ODC：ornithine decarboxylase 鳥氨酸脫羧酶；AZI：ornithine decarboxylase antizyme鳥氨酸脫羧酶抗酶；AZIN：Ornithine decarboxylase antienzymeinhibitor鳥氨酸脫羧酶抗酶抑制劑；HSG：heparansulfate on glypican-1 molecules肝素化磷脂酰肌醇聚糖-1分子。

正常發(fā)育的卵母細(xì)胞含有豐富的線粒體，但它不是均勻分布于卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，而是聚集于能量需求最大的卵質(zhì)區(qū)域，減少與線粒體呼吸相關(guān)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[2]。隨著年齡的增加，卵母細(xì)胞成熟間期的線粒體分布、形態(tài)、功能出現(xiàn)異常[7,15]，氧化還原調(diào)節(jié)失去平衡，產(chǎn)生大量ROS，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞加速凋亡。減數(shù)分裂周期G2/M轉(zhuǎn)換展示高水平的ROS，同期ODC活性提高，提示ODC有對抗ROS對卵母細(xì)胞損害作用，同時發(fā)現(xiàn)腐胺可以降低非洲爪蟾蜍ODC嗎啉反義寡聚核苷酸(morpholino oligonucleotides antisense to xenopus ODC，xODC mo)引起的卵母細(xì)胞ROS升高，說明腐胺可以改善卵母細(xì)胞線粒體氧化還原反應(yīng)失調(diào)，改善卵巢微環(huán)境,促進(jìn)卵母細(xì)胞胞質(zhì)優(yōu)化[16]。

2.腐胺對黃體生成素的作用

研究表明在規(guī)律月經(jīng)周期的不同女性中,排卵前黃體生成素峰(Luteinizing hormone surge，LH surge)在形態(tài)(單峰、平臺型、雙峰、多峰)、振幅和持續(xù)時間上都有很大變異[17]。它是即將排卵的可靠標(biāo)志,在排卵中是不可或缺的，可促進(jìn)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂排出第一極體，成為次級卵母細(xì)胞。此外，LH峰促進(jìn)排卵前卵泡黃素化，產(chǎn)生少量孕酮，二者協(xié)同激活卵泡液內(nèi)蛋白溶酶活性，消化卵泡壁部分膠原形成排卵孔，LH在整個排卵過程中扮演重要角色。但與ODC、腐胺相似，高齡女性LH峰振幅降低[18]，故而提示ODC、腐胺和LH是否有一定的關(guān)聯(lián)？

(1)腐胺對LH峰形成的影響。Aslam等人的體外試驗表明，用黃體生成素釋放激素(luteinizing hormone releasing hormone，LHRH)刺激大鼠動情前期的垂體時，ODC和LH升高，DFMO可抑制ODC和LH的升高，但腐胺可以消除DFMO降低效應(yīng)。奇怪的是，腐胺不能提高LH峰振幅或者增大垂體對LHRH反應(yīng)性，猜測腐胺在LH峰形成過程中不是必須的，只是為LH峰的形成創(chuàng)造條件，促進(jìn)LH峰的形成[19]。但體內(nèi)試驗研究發(fā)現(xiàn)，在LH峰形成前，DFMO可以降低下丘腦LHRH水平，從而降低LH峰的振幅和總LH含量(圖2)，說明ODC和腐胺是LH峰形成必須的，總之，體內(nèi)體外試驗證明腐胺在LH峰形成中扮演著重要角色[20]。

(2)腐胺和LH對排卵的影響。排卵前LH可以提高卵巢ODC活性，說明LH可以控制ODC活性。且LHRH只在大鼠動情前期提高ODC水平，在動情間期對ODC無影響，提示ODC與排卵相關(guān)[21]。用xODC mo抑制ODC時,雖不影響卵母細(xì)胞第一極體的釋放,但影響減數(shù)第二次分裂中期赤道板上染色體排列，抑制卵母細(xì)胞核成熟，導(dǎo)致胚胎碎片化(圖2)，說明腐胺是產(chǎn)生健康卵子所必須的[16]。此外，DFMO抑制動情前期ODC時，卵子數(shù)目減少70.0%(圖2)[20]，DFMO導(dǎo)致排卵障礙可能是通過抑制ODC對LH反應(yīng)性，也可能是通過鈍化LH峰，減弱LH的排卵作用，具體機(jī)制尚不明確。

(3)腐胺和LH對黃體化過程影響。在小鼠動情前期用DFMO抑制ODC活性后，通過減少卵巢中類固醇生成因子-1、細(xì)胞色素膽固醇側(cè)鏈裂解酶、類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，降低血漿和卵巢孕酮水平，同時減少黃體血管密度。推測排卵前的ODC升高是排卵時卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞黃體化的關(guān)鍵，結(jié)合LH峰是黃體化所必須的且顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中ODC對LH高度反應(yīng)性，說明ODC是LH在卵泡發(fā)育和早期黃體化過程中的重要介質(zhì)[22]。黃體分泌的孕酮是囊胚植入必須的，因此抑制排卵前ODC的活性將導(dǎo)致不孕，原因可能是：ODC的缺乏不利于顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞充分黃體化，使產(chǎn)生的孕酮不足[23]。

圖2 腐胺和ODC對黃體生成素的作用注釋：DFMO：α-difluoromethyl ornithine α-二氟基鳥氨酸；LHRH：Luteinizing Hormone Releasing Hormone黃體生成素釋放激素；xODC mo：morpholino oligonucleotides antisense to Xenopus ODC非洲爪蟾蜍ODC嗎啉反義寡聚核苷酸。

四、展望

高齡女性腐胺在排卵前升高不如年輕女性明顯，且腐胺在排卵過程中可以提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，因此推測排卵期補(bǔ)充腐胺可能是補(bǔ)救卵巢衰老的理想干預(yù)措施之一。腐胺是機(jī)體自然產(chǎn)生的；外源性補(bǔ)充腐胺很容易被吸收，且停止補(bǔ)充后，腐胺會被快速清除，對母親和胎兒都是安全的；補(bǔ)充腐胺所需要的干預(yù)時間很短；在IVF和自然受孕都可以應(yīng)用[11]，但腐胺因在人體中研究較少，其有效性及安全性尚不能證實，還尚未應(yīng)用于臨床中，需更多的研究證實其效用及安全性。