122例原發(fā)性閉經(jīng)患者的外周血染色體核型分析

盧婉 劉艷秋 黃寧 周吉會(huì) 饒慧華 黎俏 吳翠婷 周萍

閉經(jīng)是婦科常見的癥狀，可因生殖器發(fā)育不全、下丘腦-垂體功能異常、藥物、遺傳等不同的原因引起，通常將閉經(jīng)分為原發(fā)性閉經(jīng)和繼發(fā)性閉經(jīng)。原發(fā)性閉經(jīng)是指女性年齡超過14周歲仍無第二性征發(fā)育，或者年齡超過16周歲出現(xiàn)第二性征發(fā)育但無月經(jīng)來潮[1]。導(dǎo)致原發(fā)性閉經(jīng)的原因很多，其中染色體異常是引起原發(fā)性閉經(jīng)的重要遺傳因素，且不能治愈，因此若能早發(fā)現(xiàn)早診斷，并通過合理的治療改善患者的性器官發(fā)育，對減少患者身心傷害及提高生活質(zhì)量具有明顯的幫助[2-3]。本文對122例原發(fā)性閉經(jīng)患者進(jìn)行外周血染色體核型分析，并且對涉及Y染色體的患者利用PCR熒光探針法進(jìn)行Y染色體微缺失檢測，以探討原發(fā)性閉經(jīng)與染色體異常及Y染色體微缺失的關(guān)系。

對象與方法

1. 研究對象：選擇2015年1月至2017年12月于江西省婦幼保健院就診的122例原發(fā)性閉經(jīng)者，社會(huì)性別為女性，平均年齡14～31歲。每位患者詳細(xì)記錄病史，抽取外周血。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性閉經(jīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：年齡超過14歲，第二性征未發(fā)育；或者年齡超過16歲，第二性征已發(fā)育但月經(jīng)還未來潮。因化學(xué)因素、放射因素、免疫因素或醫(yī)源性損傷等引起的閉經(jīng)患者均排除在外。納入的患者均簽署知情同意書。

3.研究方法

(1)外周血染色體核型分析：抽取患者外周血2 ml，使用肝素抗凝。用7號針頭接種28滴(約1 mL)全血于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中(達(dá)輝生物技術(shù)公司)，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)終止前4 h加入秋水仙素(20 μg/mL)，按常規(guī)方法制片，G顯帶，分辨率為320～400條帶。使用萊卡染色體核型掃描分析系統(tǒng)，計(jì)數(shù)30個(gè)核型，至少分析5個(gè)核型，嵌合體病例計(jì)數(shù)至少50個(gè)核型。按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2013)的標(biāo)準(zhǔn)命名核型。

(2) 全血基因組DNA提?。簢?yán)格按照試劑盒說明操作，靜脈抽取患者2 mL的EDTA抗凝外周血，混勻后取200 μL全血，采用自動(dòng)化儀器(天隆NP968磁珠核酸提取儀)抽提DNA。

(3)PCR擴(kuò)增及熒光信號定量分析：采用兩管多重PCR擴(kuò)增，四個(gè)通道(FCMVIC/ROX/Cy5)熒光檢測的方法，判斷AZFa (sY84,sY86)，AZFb (sY127,sY134)，AZFc (sY254,sY255) 三個(gè)區(qū)域六個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)的微缺失，同時(shí)設(shè)置兩個(gè)內(nèi)對照基因：男性性別決定基因(SRY)和編碼鋅指蛋白基因ZFX/ZFY。

結(jié)果

1.外周血染色體核型及臨床表現(xiàn)

122例原發(fā)性閉經(jīng)患者中共檢出異常核型30例，異常率為24.6%。其中性染色體數(shù)目異常10例，性染色體結(jié)構(gòu)異常10例，性染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常1例，性染色體與常染色體平衡易位1例，性分化異常6例，常染色體異常2例。30例異常核型中涉及性染色體的有28例，占93.3%(表1)。性染色體核型的異常，常導(dǎo)致其生長發(fā)育異常，且不同的性染色體異常核型，其臨床表現(xiàn)也有差異之分，主要表現(xiàn)為特納綜合征、超雌綜合癥、生殖發(fā)育異常等(表2)。

2.Y染色體微缺失檢測

對6例涉及Y染色體的患者進(jìn)一步檢測Y染色體微缺失，發(fā)現(xiàn)4例46,XY患者及1例45,X[22]/46,X,dic(Y)[28]嵌合體患者存在SRY基因；1例核型為46,X,+mar[76]/45,X[20]/46,XY[4]的患者有SRY基因，但是Y染色體存在AZFc區(qū)域缺失。

討論

閉經(jīng)是婦科常見的癥狀之一，根據(jù)病因的不同可分為原發(fā)性閉經(jīng)和繼發(fā)性閉經(jīng)。染色體異常是原發(fā)性閉經(jīng)重要因素之一，其異常率可達(dá)23%～45%[4-6]。在本研究的122例原發(fā)性閉經(jīng)患者中，共檢查30例染色體異常，異常率為24.6%，與國內(nèi)其他文獻(xiàn)報(bào)道接近。在30例染色體異?；颊咧校匀旧w異常有28例，占93.3%，提示性染色體異常是導(dǎo)致原發(fā)性閉經(jīng)的重要原因之一[3]。其中包括性染色體數(shù)目異常10例，性染色體結(jié)構(gòu)異常10例，性染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常1例，性染色體與常染色體平衡易位1例及性分化異常6例。

性染色體數(shù)目異常中45,X是最常見的核型，有5例，占16.7%，這也是先天性卵巢發(fā)育不全(Turner綜合征)常見的異常核型[7]。由于缺乏一條X染色體，患者表現(xiàn)為智力一般、身材矮小、蹼頸、肘關(guān)節(jié)外翻、幼稚型生殖器。此外，3例45,X/46,XX嵌合體患者則根據(jù)嵌合比例的不同表現(xiàn)出輕重不一的癥狀。2例47,XXX(超雌綜合癥)患者，表現(xiàn)為身材矮小、肥胖、短頸、骨骼發(fā)育異常[8]。

性染色體結(jié)構(gòu)異常主要包括X染色體長臂等臂、長臂缺失、短臂缺失、假雙著絲粒等，占33.3%。不平衡的染色體結(jié)構(gòu)異常通常會(huì)造成卵巢發(fā)育不全，導(dǎo)致閉經(jīng)[9]。本研究中10例患者主要表現(xiàn)為智力稍差、乳房未發(fā)育、無陰毛、外陰幼女型、幼稚子宮、卵巢發(fā)育不良、未見卵泡。另外還有1例性染色體-常染色體平衡易位，可能由于平衡易位造成基因結(jié)構(gòu)或功能的破壞而致卵巢發(fā)育不良，引起閉經(jīng)。

表1 30例異常染色體核型分析

表2 部分染色體異常核型患者的臨床表現(xiàn)

Y染色體的95%是男性特異性的區(qū)域，包含性別特異性的胚胎發(fā)育的遺傳物質(zhì)，如睪丸決定基因(sex determining region Y,SRY)以及控制精子發(fā)生的基因無精癥因子(azoospermia factor,AZF)。AZF基因影響著精子的生成，發(fā)生AZF基因的缺失稱為AZF微缺失，也稱Y染色體微缺失[10-11]。本組4例核型為46,XY的患者生物學(xué)性別為男性，稱為性反轉(zhuǎn)綜合癥，兒童期臨床表現(xiàn)為兩性畸形、性腺發(fā)育不良、身材矮小，成人表現(xiàn)為閉經(jīng)以及不孕癥。對這4例性反轉(zhuǎn)患者和1例45,X[22]/46,X,dic(Y)[28]嵌合體患者進(jìn)行AZF基因檢測，發(fā)現(xiàn)SRY均為陽性。而核型為46,X,+mar[76]/45,X[20]/46,XY[4]的患者雖有SRY基因，但是Y染色體存在AZFc區(qū)域缺失，臨床表現(xiàn)為無子宮卵巢、性腺條索狀。

本研究中，除去30例檢測染色體異常的患者，仍有92例患者為正常核型46,XX，但由于其卵巢衰竭或性腺功能障礙，在臨床上表現(xiàn)為原發(fā)性閉經(jīng)。雖然這部分患者為正常核型，但鑒于目前染色體核型分析技術(shù)分辨率有限，尚無法有效檢出小于5Mb的結(jié)構(gòu)異常和變異，存在染色體微小缺失的漏檢[12]。此外，國外有研究者利用基因組雜交技術(shù)對染色體核型正常但卵巢早衰的患者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)部分患者存在染色體微缺失[13]。由此可見，對于染色體核型正常的原發(fā)性閉經(jīng)患者，進(jìn)一步的基因檢測以排除染色體微缺失的可能性是十分有必要的。

綜上所述，引起原發(fā)性閉經(jīng)的重要原因之一為性染色體異常，對閉經(jīng)的患者尤其是伴有性腺、生殖器異常的患者進(jìn)行核型分析，對患者早診斷早治療有很好的臨床意義。