芒果苷抑制金黃色葡萄球菌誘導的細胞凋亡

王豕辰，徐 珺，董 恒，李金堯，侯曉林

(北京農學院 動物科學技術學院，北京 102206)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)也稱金葡菌，是革蘭氏陽性菌代表，致病性僅次于沙門氏菌和副溶血桿菌[1]。它可以產生多種毒力因子[2]，刺激細胞發(fā)生凋亡[3]，產生局部炎癥，造成大量感染甚至威脅畜禽生命[4]。有研究表明，金葡菌通過激活細胞膜上TLR2受體，從而激活下游細胞信號通路，誘導細胞凋亡[5]。芒果苷又稱莞知母寧，藥理作用廣泛，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等作用[6]。據報道，芒果苷可以通過抑制腦神經元細胞凋亡來減輕腦組織缺血再灌注時的損傷[7]，其還可以抑制促凋亡蛋白的表達從而保護高糖誘導的胰島細胞損傷[8]。但是，芒果苷對金葡菌誘導的RAW264.7細胞凋亡的抑制作用及其作用機制尚少見報道。

本試驗建立了金葡菌刺激后RAW264.7細胞凋亡模型，通過檢測芒果苷對細胞凋亡相關因子和蛋白表達探索芒果苷是否具有抑制細胞凋亡的作用，從而為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

小鼠巨噬細胞(RAW264.7)，購自北京協和細胞資源中心；金葡菌ATCC29213購自上海北諾生物技術科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(Gibco)；雙抗(Gibco)；MH肉湯培養(yǎng)基(海博生物，中國)；甘油(索萊寶，中國)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigam,美國)；芒果苷>98%(阿拉丁，中國)；四唑鹽(MTT)(Amresco，美國)；ELISA試劑盒(Raybiotech,，美國)；Caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天，中國)細胞全蛋白提取試劑盒(凱基，中國)；BCA蛋白含量檢測試劑盒(凱基，中國)；Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin一抗(CST，美國)；脫脂奶粉(Oxoid，英國)；Alexa Fluor 488抗兔熒光二抗(Life Technologies，美國)。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內，根據細胞數目形態(tài)1～2 d傳代1次，保持細胞處于對數生長期。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 金葡菌在MH肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h后，10倍梯度稀釋9～10次后，取100 μL涂板計數，20%甘油凍存，-80 ℃保存。

1.2.3 芒果苷對金葡菌最小抑菌濃度測定 采用國家標準方法檢測[9]。

1.2.4 MTT比色法檢測細胞活力 根據實驗指南步驟[10]檢測細胞活力。

1.2.5 金葡菌感染細胞 試驗分為5組：空白處理作為對照組(C)，金葡菌感染作為模型組(SA)，芒果苷低(25 μmol/L)、中(50 μmol/L)、高(100 μmol/L)濃度預處理作為加藥組。細胞以4×105個/孔鋪至6孔板，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h后，加入25、50、100 μmol/L 芒果苷作用1h后，以感染復數MOI=100∶1(細菌∶細胞)的比例加入金葡菌作用 4h。

1.2.6 檢測Caspase 3活性 同“1.2.5”處理細胞。收集細胞，根據Caspase-3活性檢測試劑盒說明書測定細胞內Caspase-3活性。

1.2.7 ELISA檢測細胞因子 同“1.2.5”處理細胞。取細胞上清液，根據ELISA試劑盒說明書分別測定細胞分泌的IL-10、IL-6和TNF-α濃度量。

1.2.8 Western blot檢測相關蛋白表達 同“1.2.4”處理細胞。使用細胞全蛋白提取試劑盒提取細胞全蛋白，同時用BCA蛋白含量檢測試劑盒定量所提取全蛋白的蛋白濃度。配制濃度為5%的濃縮膠和15%的分離膠。每個樣品上樣量為20 μg蛋白。恒壓80 V，電泳120 min。濕法恒流250 mA，轉膜120 min。5%脫脂奶粉封閉60 min。4 ℃孵育一抗過夜。熒光二抗避光孵育40 min。利用奧德賽雙色紅外激光成像系統(tǒng)對待測膜進行掃描、成像。使用Imgae J進行灰度值定量分析。

1.2.9 數據分析 試驗結果使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，數據是3個平行樣本的平均數±標準差。

2 結 果

2.1 金葡菌最小抑菌濃度測定結果

按照國標測定方法檢測芒果苷對金葡菌ATCC29213的最小抑菌濃度，結果顯示，256μg/mL以下濃度的芒果苷對其不具有抑菌作用。用于后續(xù)細胞試驗中的最高濃度為200 μmol/L(84.4μg/mL)，遠遠低于256 μg/mL。

2.2 芒果苷和金葡菌對RAW264.7細胞毒性試驗結果

為了研究芒果苷和金葡菌對RAW264.7細胞的毒性，篩選芒果苷作用細胞的最適濃度和金葡菌作用細胞時間點。取不同濃度芒果苷作用細胞24 h，采用MTT法檢測細胞活力，結果發(fā)現，120 μmol/L組的細胞活力明顯下降，100 μmol/L以下濃度的芒果苷對RAW264.7細胞沒有明顯的毒性作用(圖 1-A)，因此后期試驗選用25、50、100 μmol/L 的芒果苷對細胞進行預處理。金葡菌取不同時間點感染細胞，采用MTT法檢測細胞活力，結果發(fā)現，與0 h組相比，感染4 h組細胞的活力明顯下降(圖 1-B)，因此用感染復數MOI=100∶1(細菌∶細胞)刺激RAW264.7細胞4 h作為細胞凋亡模型。

圖1 芒果苷和金葡菌對RAW264.7細胞毒性Fig.1 Mangiferin and Staphylococcus aureus are toxic to RAW264.7 cells

2.3 芒果苷抑制金葡菌誘導細胞凋亡相關細胞因子的表達

為了檢測芒果苷對金葡菌誘導RAW264.7促炎細胞因子的分泌，采用ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-10、TNF-α的表達。結果如圖 2-A-C所示，與對照組(C)相比，模型組(SA)的IL-6、IL-10和TNF-α均呈現顯著上調，加入芒果苷預處理后，其呈現顯著下調且具有濃度依賴性。同時檢測了細胞內Caspase-3的活性，結果與上述結果相同(圖 2-D)。

圖2 芒果苷對金葡菌侵染RAW264.7細胞引起炎癥因子表達和Caspase-3活化的影響Fig.2 The effect of Mangiferin on theexpression of inflammatory factors and caspase-3 activation induced by Staphylococcus aureus infection of RAW264.7 cells

圖3 芒果苷對金葡菌侵染RAW264.7細胞引起細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig.3 The effect of Mangiferin on the expression of apoptosis related proteins caused by Staphylococcus aureus infection of RAW264.7 cells

2.4 芒果苷抑制金葡菌誘導細胞凋亡

為了進一步探討芒果苷對金葡菌誘導的細胞凋亡的影響，采用Western blot檢測與細胞凋亡相關蛋白Bax, Bcl-2, Caspase-3的表達。結果如圖3所示，與對照組(C)相比，模型組(SA)Bax, Caspase-3蛋白的表達量呈現顯著上調，加入芒果苷預處理后，呈現明顯下調且具有濃度依賴性。

3 討 論

細胞凋亡是多種細胞因子和蛋白共同參與的生理病理過程，是細胞主動實施的程序性死亡[11]。細胞凋亡的激活包括兩種途徑：一種是死亡受體途徑，如Fas-FasL[12]；另一種是線粒體途徑[13]，如抑制細胞凋亡的基因Bcl-2等和促進細胞凋亡的基因Bax等[14]。當細胞受到外界刺激時，促炎癥因子分泌增加，抗炎癥因子分泌減少[15]，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白相互作用，激活下游Caspase家族蛋白，Caspase家族蛋白是可以直接造成細胞凋亡的一類蛋白酶系統(tǒng)[16]。有研究表明，金黃色葡萄球菌可以誘導人單核細胞和中性粒細胞凋亡。

芒果苷是一種四羥基吡酮的碳糖苷，具有抗炎和抗凋亡等多種藥理特性。研究證明，芒果苷可以降低肝損傷小鼠體內TNF-α、IL-6和IL-10的表達水平，從而起到緩解肝損傷的作用[19, 20]。芒果苷可以通過抑制Bax和Caspase-3發(fā)揮神經保護作用減緩創(chuàng)傷性顱腦損傷[21]。本研究發(fā)現，金葡菌刺激RAW264.7細胞時，細胞炎性因子IL-10，IL-6，TNF-α的分泌量明顯增加，Bax，Caspase-3的蛋白表達量顯著上調，而芒果苷可以顯著降低其炎性因子的分泌和促凋亡蛋白的表達。

芒果苷可以通過降低Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達量，緩解金黃色葡萄球菌誘導的RAW264.7細胞的凋亡。