水蜜桃疏果多酚類物質(zhì)提取及抗氧化活性研究

楊立風，馬超，張明，王崇隊，范祺，張博華，孟曉峰，竇勇博,2，吳茂玉*

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250014；2.齊魯工業(yè)大學食品科學與工程學院，山東濟南 250353）

植物多酚是具有芳香環(huán)及羥基取代基的天然化合物的總稱，是植物重要的次級代謝產(chǎn)物之一[1]。新陳代謝過程中人體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧簇，過多將會損傷機體細胞及組織[2-3]，進而引發(fā)各種疾病。植物多酚因具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗糖尿病、預防心腦血管疾病以及抗腫瘤等生理活性[4-6]，已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥以及化妝品等領(lǐng)域[7]。

水蜜桃（Prunus persicaL.Batsch）果實肉甜汁多，口感細膩，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛。然而水蜜桃坐果率較高，容易導致果實因營養(yǎng)競爭性而變小、變形[8]，為保證整體產(chǎn)量及質(zhì)量，需要疏除部分幼果以合理調(diào)節(jié)果樹負荷[9-10]。疏果中營養(yǎng)及功能成分多樣，尤其多酚類含量顯著高于成熟果。有研究顯示蘋果[11]和桃[12]疏果中多酚類物質(zhì)含量可達成熟果的10 倍左右。據(jù)統(tǒng)計，山東、河北、浙江等地區(qū)的水蜜桃疏果量約為100 kg/667 m2[13]。而目前國內(nèi)針對水蜜桃疏果的研究較少，因此開展水蜜桃疏果中多酚類物質(zhì)研究，對果樹資源的綜合利用和經(jīng)濟附加值的提高具有重要意義。植物中功能性成分的提取多采用超聲輔助提取技術(shù)，該技術(shù)主要是利用機械效應、空化效應以及熱效應來激發(fā)分子高速運動，使植物細胞組織結(jié)構(gòu)破裂從而釋放出內(nèi)含物[14]。本研究采用超聲波輔助提取法，以多酚提取得率（extraction yield of polyphenols，EP）、黃酮提取得率（extraction yield of flavonoids，EF）為考察指標，對超聲波輔助提取工藝進行了優(yōu)化，并采用2,2-二苯代苦味酰基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法對提取物抗氧化活性進行了研究，以期為果樹下腳料資源在食品、化妝品等領(lǐng)域的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水蜜桃疏果，2017 年5 月采集于山東省臨沂市蒙陰縣；沒食子酸標準品、福林酚試劑、DPPH 自由基，購于上海麥克林生化科技有限公司；蘆丁標準品，購于北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、甲醇等均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204E/02 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-250B 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；DLSB-5/20 型低溫冷卻液循環(huán)泵，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SB-1100 型水浴鍋，N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；FD-2 型真空冷凍干燥機，上海比郎儀器制造有限公司；Vortex-3 型旋渦混合儀，上海嘉鵬科技有限公司；UV1000 型單光束紫外/可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料處理

新鮮水蜜桃疏果經(jīng)切片、真空冷凍干燥后，粉碎過篩（40 目）得到水蜜桃疏果粉，密封避光保存。

1.3.2 水蜜桃疏果多酚提取工藝

準確稱取一定量的水蜜桃疏果粉，采用水醇體系超聲（800 W）輔助提取法提取水蜜桃疏果多酚，利用單因素及正交試驗確定適宜的提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度，提取液經(jīng)離心（3 000 r/min、5 min）、過濾、濃縮、真空冷凍干燥后，制得水蜜桃疏果多酚提取物。

1.3.3 沒食子酸標準曲線繪制

采用Folin-Ciocalteus 法[15]，利用紫外/可見分光光度法，測定反應體系于760 nm 處的吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度c（μg/mL）為橫坐標、吸光度A（Abs）為縱坐標進行線性分析，得回歸方程。

1.3.4 蘆丁標準曲線繪制

采用NaNO2-Al(NO3)3法[16]，利用紫外/可見分光光度法，測定反應體系于510 nm 處的吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度c（μg/mL）為橫坐標、吸光度A（Abs）為縱坐標進行線性分析，得回歸方程。

1.3.5 疏果多酚提取物清除DPPH 自由基活性評價

采用DPPH 自由基清除法[17-18]，準確量取樣品溶液2 mL，加入400 μmol/L DPPH 溶液2 mL，于30 ℃暗室維持反應30 min，以2 mL 去離子水為對照、2 mL 甲醇為空白，利用紫外/可見分光光度法，測定反應體系于517 nm處的吸光度，計算自由基清除率及IC50值。

式中：A1-樣品，A2-對照，A3-樣品空白，A4-DPPH 空白。

1.3.6 單因素對水蜜桃疏果EP 及EF 的影響

采用超聲波（800 W）輔助提取法，分別選擇提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、提取時間（15、30、45、60、75 min）、料液比（1：20、1：30、1：40、1：50、1：60 g/mL）、乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）進行單因素試驗，依據(jù)1.3.2 方法進行提取，參考1.3.3 及1.3.4 分別考察各因素對水蜜桃疏果EP 及EF 的影響。

1.3.7 正交試驗設計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度四個因素（見表1），以水蜜桃疏果EP 及EF 為考察指標，進行L9(34)正交試驗優(yōu)化多酚的提取工藝條件。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factor-level table of orthogonal test

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

采用Folin-Ciocalteus 法，繪制沒食子酸標準曲線，得回歸方程：A=0.040 9c+0.054 3（R2=0.999 6）。

2.2 蘆丁標準曲線

采用NaNO2-Al(NO3)3法，繪制蘆丁標準曲線，得回歸方程：A=0.006 7c+0.003 2（R2=0.999 9）。

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取溫度對水蜜桃疏果EP 及EF 的影響

由圖1 分析可知，隨著提取溫度的升高，水蜜桃疏果EP 呈現(xiàn)先增加至趨于平緩后再下降的趨勢；低于40 ℃時，EF 隨溫度升高而下降，高于40 ℃時，EP 同樣呈現(xiàn)先增加趨于平緩后再下降的趨勢；50 ℃時，EP 及EF 均相對較高，分別為0.71%±0.06%與1.74%±0.01%。由于隨著溫度的升高，脂溶性雜質(zhì)溶解度增大，多酚類物質(zhì)在高溫時易被氧化變質(zhì)，故選擇50 ℃作為最適提取溫度。

2.3.2 提取時間對水蜜桃疏果EP 及EF 的影響

由圖2 分析可知，隨著超聲提取時間的延長，EP 呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，超聲提取30 min 時，EP 相對較高，可達0.64%±0.12%，超過30 min，EP 有所下降；同時，EF 呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，超聲提取60 min 時，EF 可達1.80%±0.11%，之后增加不明顯。分析其原因，可能由于作用時間過長，致使脂溶性雜質(zhì)競爭性溶出以及多酚類物質(zhì)被部分氧化修飾[19]。同時為縮短生產(chǎn)周期，降低能耗，節(jié)約成本，因此選擇30 min 作為工藝優(yōu)化的最適提取時間。

2.3.3 料液比對水蜜桃疏果EP 及EF 的影響

由圖3 可知，隨著料液比的增加，EP 呈現(xiàn)先增加后略微下降的趨勢，料液比超過1：50（g/mL），EP 有所下降；1：50（g/mL）時，EP 相對較高，為0.73%±0.14%。EF 同樣呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，料液比為1：50（g/mL），EF可達1.89%±0.04%，之后增加不明顯。可能由于提取溶劑增加導致雜質(zhì)溶出增多，故綜合考慮EP、EF 及提取成本，可選擇1：50（g/mL）作為最適料液比。

2.3.4 乙醇濃度對水蜜桃疏果EP 及EF 的影響

由圖4 可知，隨著乙醇濃度的增加，EP 及EF 均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，乙醇濃度超過60%均有所下降，濃度為60%時EP 及EF 均相對較高，分別為0.64%±0.03%與1.80%±0.10%?？赡苁怯捎谝掖紳舛鹊陀?0%時，水醇體系利于破壞酚類物質(zhì)與多糖、蛋白質(zhì)間氫鍵及疏水作用力，增加濃度則有助于多酚溶出釋放；而乙醇濃度超過60%，溶劑與多酚間極性差異擴大，從而導致EP及EF 下降[20]。故選擇60%作為最適乙醇濃度。

2.4 正交試驗結(jié)果與分析

由表2（見下頁）中極差分析結(jié)果可知，各影響因素對EP 的影響次序為A＞D＞B＞C，對EF 影響次序為D＞A＞B＞C，其中料液比對EP 及EF 影響均相對最??；進一步對提取溫度、提取時間、乙醇濃度進行方差分析（見下頁表3），由分析結(jié)果可知，各影響因素對EP 及EF 均未達到顯著水平，F(xiàn)值分析結(jié)果顯示，各影響因素對EP 及EF的影響次序均為D＞A＞B，與EF 極差分析結(jié)果一致；其中乙醇濃度為影響水蜜桃疏果多酚提取的最主要因素，直觀表現(xiàn)最優(yōu)組合為A2B3C1D2（EP，0.68±0.01%）與A3B1C3D2（EF，1.95±0.00%）。經(jīng)綜合k值、K值及方差分析結(jié)果得出理論最優(yōu)組合為A3B2C1D2與A3B2C3D2。經(jīng)驗證試驗（見下頁表4），得出A3B2C3D2的EP、EF 分別為0.71%±0.02%和1.91%±0.03%，均高于其他組合。綜上考察，確定最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度60 ℃、提取時間30 min、料液比1：60（g/mL）、乙醇濃度60%。

2.5 疏果多酚提取物對DPPH 自由基的清除活性

DPPH 法即利用分光光度法測定特征吸收峰吸光度的下降程度來評價抗氧化劑清除自由基的能力[21]。以水蜜桃疏果粉為原料，于最佳提取工藝條件下，制得水蜜桃疏果多酚水醇提取液，經(jīng)濃縮、真空冷凍干燥后得水蜜桃疏果多酚提取物，進行DPPH 自由基清除率測定，結(jié)果見圖5（見第19 頁）。由圖5 可知，水蜜桃疏果多酚提取物對DPPH 自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增加，呈濃度依賴性，最大清除率可達88.87%；水蜜桃疏果多酚提取物對DPPH 自由基清除率在36.18%～88.87%范圍內(nèi)呈線性相關(guān)（y=62.673x+12.207），其半數(shù)抑制濃度IC50為0.60 mg/mL。

表2 正交試驗設計及結(jié)果Table 2 The design and results of orthogonal test

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment results

表4 驗證試驗結(jié)果Table 4 Results of verification experiment

3 結(jié)論

本研究以水蜜桃疏果為原料，采用超聲波輔助提取法，以EP 及EF 為考察指標，通過單因素及正交試驗優(yōu)化水蜜桃疏果多酚的提取工藝，得到最優(yōu)提取條件為提取溫度60 ℃、提取時間30 min、料液比1：60（g/mL）、乙醇濃度60%；其中乙醇濃度是最主要的影響因素。此條件下水蜜桃疏果EP 及EF 均最，高分別可達0.71%±0.02%與1.91%±0.03%，且提取物顯示較強的DPPH 自由基清除能力，最高可達88.87%，IC50為0.60 mg/mL?？梢姡厶沂韫喾犹崛∥锞哂休^好的抗氧化效果，這為其進一步分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性評價以及深度開發(fā)利用提供參考依據(jù)。