槲皮素聯(lián)合CADM1對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖和凋亡的影響

田 金，姚 麗，蘇 敏，婁雪玲，張書偉

(1 鄭州人民醫(yī)院婦科，鄭州 450003；2 鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，鄭州 450003；3 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，鄭州 450003)

子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜組織在子宮內(nèi)膜以外的部位生長、浸潤，能引起不孕、進(jìn)行性痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等癥狀，嚴(yán)重影響女性健康和生活質(zhì)量。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可改善卵巢功能異常、調(diào)節(jié)自身免疫、提高子宮內(nèi)膜容受性[1-2]。槲皮素是一種天然小分子黃酮類化合物，廣泛存在于多種中草藥中，具有多種藥理作用和生物學(xué)活性，能抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬和凋亡、增強藥物及放射敏感性、逆轉(zhuǎn)耐藥性等[3]。有研究報道，槲皮素可抑制大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型中異位內(nèi)膜的生長，且與達(dá)那唑聯(lián)合治療效果更顯著[4-5]。槲皮素還可上調(diào)Caspase-9、Caspase-3，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制異位內(nèi)膜生長。細(xì)胞黏附因子1(cell adhesion molecule-1，CADM1)是CADMs家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，CADM1在多種腫瘤細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞增殖、黏附和轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[6]。據(jù)報道，CADM1在子宮內(nèi)膜異位癥患者組織中低表達(dá)，其可能與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7]。但CADM1對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其與槲皮素聯(lián)合作用對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞影響尚未闡明，本研究旨在探討槲皮素和CADM1對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其聯(lián)合作用的效果是否更顯著。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞核試劑

子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞End1/E6E7購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；槲皮素購自四川省維克奇生物科技有限公司；LipofectamineTM2000購自Sigma公司；MTT試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒、BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體購自上海煊翎生物科技有限公司；載體、質(zhì)粒均由金瑞斯生物科技公司構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞End1/E6E7用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2天換液一次，待細(xì)胞融合至80%左右時，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 藥物處理與分組

當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時，將細(xì)胞傳代接種至96孔板中，用20 μg/mol的槲皮素處理End1/E6E7細(xì)胞，作為Quercetin組；未經(jīng)任何處理的細(xì)胞，作為對照組(Control組)。將pcDNA-CADM1轉(zhuǎn)染至End1/E6E7細(xì)胞，記為pcDNA-CADM1組；將pcDNA-CADM1轉(zhuǎn)染至End1/E6E7細(xì)胞后用20 μg/mol的槲皮素處理，記為Quercetin+pcDNA-CADM1組，轉(zhuǎn)染均采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒。

1.4 Western Blot檢測蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，然后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個蛋白樣品重復(fù)3次。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞活力

在各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時加入20 μl (5 g/L)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細(xì)胞活力(%)=實驗組A值/空白對照組A值×100。每組重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，然后1000 r/min離心5 min，去上清，PBS重懸洗滌2次；1000 r/min離心5 min，去上清，100 μl PBS重懸細(xì)胞，緩慢加入700 μl預(yù)冷的80%乙醇，使乙醇終質(zhì)量濃度為70%，4 ℃固定24 h以上，1000 r/min離心5 min，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入100 μl核糖核酸酶A(RNase A，50 mg/L)，37 ℃水浴30 min，加入400 μl PI(50 mg/L)，4 ℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測PI熒光強度，用Modfit軟件計算Sub G0/G1期、G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞End1/E6E7中CADM1的表達(dá)量

與Control組相比，Quercetin組和pcDNA-CADM1組End1/E6E7細(xì)胞中CADM1的表達(dá)水平均升高；與Quercetin組和pcDNA-CADM1組相比，Quercetin+pcDNA-CADM1組End1/E6E7細(xì)胞中CADM1的表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖1和表1?？梢姡纹に睾瓦^表達(dá)CADM1均可促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞End1/E6E7中CADM1的表達(dá)，且槲皮素聯(lián)合CADM1效果更顯著。

圖1 Western Blot檢測End1/E6E7細(xì)胞中CADM1的表達(dá)

表1 各組End1/E6E7細(xì)胞中CADM1的表達(dá)量

與Control組比較，a：P<0.05；與Quercetin組比較，b：P<0.05；與pcDNA-CADM1組比較，c：P<0.05；下同

2.2 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細(xì)胞增殖的影響

與Control組相比，Quercetin組和pcDNA-CADM1組End1/E6E7細(xì)胞活力均降低；與Quercetin組和pcDNA-CADM1組相比，Quercetin+pcDNA-CADM1組End1/E6E7細(xì)胞活力降低(P<0.05)。見表2?？梢姡纹に睾瓦^表達(dá)CADM1均可抑制子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖，且槲皮素聯(lián)合CADM1抑制效果更顯著。

表2 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細(xì)胞增殖的影響

2.3 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細(xì)胞凋亡的影響

與Control組相比，Quercetin組和pcDNA-CADM1組End1/E6E7細(xì)胞凋亡率均升高，Bax表達(dá)水平均升高，Bcl-2表達(dá)水平均降低；與Quercetin組和pcDNA-CADM1組相比，Quercetin+pcDNA-CADM1組End1/E6E7細(xì)胞凋亡率升高，Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖2、表3和圖3。可見，槲皮素和過表達(dá)CADM1均可促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞凋亡，且槲皮素聯(lián)合CADM1促進(jìn)效果更顯著。

圖2 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細(xì)胞凋亡的影響

表3 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Western Blot檢測End1/E6E7細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細(xì)胞周期的影響

與Control組相比，Quercetin組和pcDNA-CADM1組Sub G0/G1期細(xì)胞比例升高，G0/G1期細(xì)胞比例降低(P<0.05)；S期和G2/M期細(xì)胞比例無顯著變化。與Quercetin組和pcDNA-CADM1組相比，Quercetin+pcDNA-CADM1組Sub G0/G1期細(xì)胞比例均升高，G0/G1期細(xì)胞比例均降低(P<0.05)；S期和G2/M期細(xì)胞比例無顯著變化。見表4。可見，槲皮素和過表達(dá)CADM1能使End1/E6E7細(xì)胞阻滯于G0/G1期，且槲皮素聯(lián)合CADM1效果更顯著。

表4 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細(xì)胞周期的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種婦科進(jìn)展性疾病，發(fā)病機制復(fù)雜，且發(fā)病率呈不斷上升趨勢。近年來，中醫(yī)藥臨床治療取得良好的療效[8-9]。槲皮素是從中藥及天然植物中提取的黃酮類化合物，具有抗腫瘤細(xì)胞增殖及促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[10]。有研究表明，槲皮素可抑制子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[11]，可逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌耐藥細(xì)胞株B-MD-CI(ADR+/+)細(xì)胞多藥耐藥性[12]。此外，槲皮素還能抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長及促進(jìn)其凋亡[13]，并增強順鉑對HeLa細(xì)胞黏附、遷移及侵襲的抑制作用[14]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素可抑制子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞End1/E6E7的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；且能促進(jìn)Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步說明槲皮素可促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞凋亡。這與前人研究結(jié)果相符，說明槲皮素具有抗腫瘤效果。

槲皮素可顯著抑制系膜細(xì)胞增殖，使系膜細(xì)胞阻滯于G0～G1期[15]；使結(jié)腸癌BIU-87細(xì)胞周期阻滯于G2/M期[16]；通過誘導(dǎo)P53非依賴性的G2/M細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而實現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[17]。以上結(jié)果均表明槲皮素可通過阻滯細(xì)胞周期而抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞分裂都經(jīng)由G1-S-G2-M期，G0/G1是細(xì)胞周期關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過調(diào)控G0/G1可阻止腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，槲皮素可增加Sub G0/G1期細(xì)胞，減少G0/G1期細(xì)胞，而S期和G2/M期細(xì)胞無顯著差異變化，說明槲皮素可能通過將細(xì)胞阻滯于G0/G1期而抑制子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖。

CADMs家族又屬于免疫球蛋白超家族，CADM1作為CADMs家族一員可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞識別和殺傷腫瘤細(xì)胞[18]。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷CADM1可以減少胰腺癌細(xì)胞晚期凋亡[19]；CADM1過表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲[20]，以及抑制肝癌細(xì)胞生長并負(fù)向調(diào)節(jié)G1/S轉(zhuǎn)換[21]。且有研究表明，CADM1在子宮內(nèi)膜異位癥患者組織中低表達(dá)。本研究為探討CADM1對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖和凋亡的影響，轉(zhuǎn)染CADM1過表達(dá)載體，結(jié)果顯示，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率升高，Sub G0/G1期細(xì)胞增加，G0/G1期細(xì)胞減少。說明過表達(dá)CADM1可抑制子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

為探討槲皮素和CADM1兩者聯(lián)合作用對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖和凋亡的影響，本研究在轉(zhuǎn)染CADM1過表達(dá)載體的同時用槲皮素處理，結(jié)果顯示，相比單獨過表達(dá)CADM1，過表達(dá)CADM1的同時用槲皮素處理，CADM1表達(dá)水平升高，說明槲皮素可促進(jìn)CADM1的表達(dá)。且相比單獨槲皮素處理或單獨過表達(dá)CADM1，過表達(dá)CADM1的同時用槲皮素處理，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率升高，Sub G0/G1期細(xì)胞增加，G0/G1期細(xì)胞減少。說明槲皮素聯(lián)合CADM1對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞End1/E6E7的增殖抑制和凋亡促進(jìn)效果更顯著，且其可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖的。

綜上，槲皮素和CADM1均可抑制子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加Sub G0/G1期細(xì)胞，減少G0/G1期細(xì)胞，且槲皮素聯(lián)合CADM1作用效果更顯著，有望為子宮內(nèi)膜異位癥的治療提供新思路和新靶點。