ADAMTS4與ADAMTS5蛋白酶在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性

孫曉玲 張曉娟 張清泉 邱雷 王林娜 侯素平

腦膠質(zhì)瘤是臨床常見的惡性腫瘤，其新增病例數(shù)約為1.4萬例/年，該病可見于不同年齡人群中，不同類型膠質(zhì)瘤的高發(fā)人群存在差異，男性發(fā)病率高于女性。腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不佳，死亡率非常高，5年死亡率居于各類惡性腫瘤的第三位。膠質(zhì)細(xì)胞存在細(xì)胞遷移性，而且腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較高的侵襲能力，其病情進(jìn)展為多種分子參與的復(fù)雜生物學(xué)過程，Kim等[1]的研究建立了動物膠質(zhì)瘤模型，指出細(xì)胞外基質(zhì)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)的重塑已成為惡性腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素，透明蛋白聚糖、含血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS)之間平衡的改變可能參與病情變化。ADAMTS4、ADAMTS5 蛋白酶屬于ADAMTS家族成員，兩者均可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的分解、軟化。但是，目前關(guān)于ADAMTS4、ADAMTS5 兩種蛋白酶在惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中的作用機制尚未明確，不同惡性腫瘤細(xì)胞中其表達(dá)水平存在差異，Chen等[2]研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS4在晚期結(jié)直腸癌中可以促進(jìn)腫瘤的生長，而Lu等[3]發(fā)現(xiàn)ADAMTS4和ADAMTS5 的表達(dá)水平在結(jié)直腸癌早期階段卻降低。另有研究顯示，在胃癌中細(xì)胞惡性程度越高則ADAMTS5表達(dá)水平越低[4]，而在非小細(xì)胞肺癌中ADAMTS5表達(dá)水平越高者5年生存率越低、預(yù)后越差[5]。因此，本研究分析ADAMTS4、ADAMTS5兩種蛋白酶在膠質(zhì)瘤中表達(dá)及其同患者病情、預(yù)后的相關(guān)性，以期為今后深入探討ADAMTS4、ADAMTS5參與膠質(zhì)瘤遷移的機制，尋求新的治療靶點奠定基礎(chǔ)。

1 對象和方法

1.1 觀察對象選取作者醫(yī)院神經(jīng)外科自2016年1月至2017年1月期間收治的116例腦膠質(zhì)瘤患者，男62例、女54例，年齡29～72歲，平均(54.68±9.32)歲。膠質(zhì)瘤患者入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)《WHO 2016年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷及分類》[6]符合膠質(zhì)瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)均為初診患者；(3)對本研究知情同意；并排除合并其他惡性腫瘤、關(guān)節(jié)炎、血液系統(tǒng)疾病者，排除存在顱腦外傷以及腦部其他疾病者，排除在取樣前接受放化療等治療者。

依據(jù)《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》[7]對膠質(zhì)瘤進(jìn)行組織學(xué)分級：Ⅰ級10例，Ⅱ級44例，Ⅲ級22例，Ⅳ級40例，Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ為高級別膠質(zhì)瘤，低級別膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為比較溫和，有進(jìn)展為高級別膠質(zhì)瘤的趨勢，高級別膠質(zhì)瘤惡性程度高預(yù)后差，兩者在治療上也不同，區(qū)別膠質(zhì)瘤的級別對患者的治療和預(yù)后都很有意義，本實驗就兩組進(jìn)行分析和討論。依據(jù)《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》[7]進(jìn)行病理分類：毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤10例，彌漫性星形細(xì)胞瘤20例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤10例，多形性黃色星形細(xì)胞瘤6例，少突星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤8例，間變性星形細(xì)胞瘤14例，間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤8例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤36例，彌漫性中線膠質(zhì)瘤4例；伴重度瘤周水腫者42例，輕度瘤周水腫者74例；伴囊變者38例，未伴囊變者78例。

1.2 試劑和儀器兔抗人多克隆抗體 ADAMTS4、兔抗人多克隆抗體 ADAMTS5均來源于Santa Cruz Biotechnology公司，DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒、稀釋液均來源于北京中杉生物技術(shù)公司，蘇木素及伊紅來源于上海碧云天技術(shù)有限公司。儀器包含石蠟切片機(Leica RM2245)、光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯 BX43)、恒溫水浴鍋( HWS-12，上海合恒儀器設(shè)備有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1免疫組化染色法和結(jié)果評價：收集患者經(jīng)手術(shù)切除或穿刺采集的膠質(zhì)瘤病灶組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，并取瘤周正常組織作為對照，取樣范圍為病灶區(qū)邊緣3～5 cm，癌周正常組織定義依據(jù)為不含腫瘤細(xì)胞，由兩名高年資病理醫(yī)師在顯微鏡下進(jìn)行雙盲評判，有異議者舍棄。具體操作如下，病灶組織用組織脫水機脫水、透明后進(jìn)行石蠟包埋制備成石蠟標(biāo)本并連續(xù)切片切成4 μm厚的蠟片，選取質(zhì)量好的一張，展片后平鋪于處理后的載玻片上，玻片在55℃條件下烤干，使用二甲苯浸泡脫蠟、梯度酒精水化，再置于高壓鍋中用檸檬酸鹽緩沖液浸泡進(jìn)行抗原修復(fù)，用磷酸緩沖液沖洗5 min×3次，組織上滴加濃度為3% 的過氧化氫在37℃下8 min，沖洗5 min×3次。按照試劑盒說明書要求滴加一抗(兔抗人多克隆抗體 ADAMTS4、兔抗人多克隆抗體 ADAMTS5)、二抗(通用型鼠抗兔多克隆抗體)、DAB顯色，去除多余的顯色液，并浸入蘇木素溶液5 min，自來水沖洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。

在高倍(400倍)光學(xué)顯微鏡下觀察病灶中全部細(xì)胞的染色狀況，(1)按照染色強度計分，深棕黃色計為3 分，棕黃色計為2分，淺棕黃色計為1分，沒有染色計為0分；(2)按照陽性著色細(xì)胞的百分比計分，隨機選取10個高倍鏡視野，計數(shù)陽性細(xì)胞百分比的平均數(shù)，百分比0%計為 0 分，1%≤百分比<25%計為1分，25%≤百分比<50%計為2分，50%≤百分比<75%計為3分，≥75%計為4分。按照兩種計分結(jié)果的乘積評價蛋白酶的最終表達(dá)結(jié)果，<3.5分為陰性表達(dá)，≥3.5分為陽性表達(dá)。同樣方法觀察瘤周正常腦組織兩種抗原的表達(dá)作為對照組。

染色結(jié)果由兩名高年資主治醫(yī)師分別觀察，若觀察結(jié)果存在分歧則由主任醫(yī)師判定。

比較不同腫瘤分級、瘤周水腫程度以及是否伴囊變患者的病灶組織中ADAMTS4與ADAMTS5蛋白酶的陽性表達(dá)率差異(每組病例中ADAMTS4與ADAMTS5蛋白酶表達(dá)陽性的例數(shù)除以每組的總例數(shù)，得出的百分比即為表達(dá)率)，并分析兩種蛋白酶表達(dá)率的相關(guān)性，比較ADAMTS4陽性、陰性表達(dá)與ADAMTS5陽性、陰性表達(dá)的累積生存率差異。瘤周水腫程度按照Schoenegger等[8]文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)判斷，>20 mm屬于重度，≤20 mm屬于輕度。所有入組患者術(shù)前均進(jìn)行MRI檢查，MRI征象能對不同級別的膠質(zhì)瘤的囊性變進(jìn)行準(zhǔn)確反映[9]，MRI顯示腫瘤實質(zhì)部分T1W1為低或等信號，T2W1為高信號。囊性變在T1W1為低或等信號，T2W1為高信號，囊變的判斷由兩名影像科醫(yī)生進(jìn)行獨立觀察，意見一致視為囊變，有分歧者，由主任醫(yī)生進(jìn)行定奪。腫瘤囊變的部位、大小、多少及囊壁的厚薄均不作為單獨因素加以區(qū)分。

1.3.2患者累積生存率計算：定期隨訪截止至2019年3月，隨訪時間為3～38個月。通過電話隨訪、病歷信息收集等途徑獲取患者生存時間的資料。累積生存率即這段時間內(nèi)仍存活例數(shù)/觀察總例數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS24.0軟件進(jìn)行分析。蛋白酶的表達(dá)率以n(%)的形式表示，不同方式分組中兩組間蛋白酶表達(dá)比較采用χ2檢驗；兩種蛋白酶表達(dá)率的相關(guān)性分析采用Spearman 分析；累積生存曲線采用Kaplan-Meier法進(jìn)行繪制。以P<0.05表示差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

注：ADAMTS：含血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶，表1～3同 圖 1 患者病灶細(xì)胞中ADAMTS4(A)、ADAMTS5(B)表達(dá)(免疫組化×400)

2.1 患者膠質(zhì)瘤病灶細(xì)胞中ADAMTS4、ADAMTS5的表達(dá)率和相關(guān)性病灶組織中腫瘤細(xì)胞存在核異型性，核增大，ADAMTS4、ADAMTS5多位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)，多呈棕黃色(圖1)。

ADAMTS4、ADAMTS5表達(dá)率分別為79.31%(92例)、84.48%(98例)，Ⅳ級、Ⅲ級患者病灶組織中ADAMTS4與ADAMTS5蛋白酶表達(dá)率明顯高于Ⅰ級、Ⅱ級者(P<0.05)；伴重度瘤周水腫患者的病灶組織中ADAMTS4與ADAMTS5蛋白酶的表達(dá)率明顯高于伴輕度瘤周水腫者(P<0.05)；伴囊變和未伴囊變者的病灶組織中ADAMTS4與ADAMTS5蛋白酶的表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具體見表1～3。

表1 不同級別膠質(zhì)瘤ADAMTS4和ADAMTS5表達(dá)率比較〔n(%)〕

表2 不同瘤周水腫程度ADAMTS4和ADAMTS5表達(dá)率比較〔n(%)〕

表3 是否伴囊變ADAMTS4和ADAMTS5表達(dá)率比較〔n(%)〕

兩種蛋白酶的表達(dá)率成正相關(guān)(r=0.361，P=0.001)。

2.2 兩種蛋白酶的表達(dá)同累積生存率的關(guān)系A(chǔ)DAMTS4、ADAMTS5陽性表達(dá)者的累積生存率比陰性表達(dá)者均明顯降低(P<0.05)，ADAMTS4蛋白酶表達(dá)的生存分析log-rank值=23.98，P=0.00，ADAMTS5表達(dá)的生存分析log-rank值=8.60，P=0.00，具體見圖2和圖3。

圖 2 ADAMTS4蛋白酶陽性與陰性表達(dá)的生存曲線圖

圖 3 ADAMTS5蛋白酶陽性與陰性表達(dá)的生存曲線圖

3 討論

腦膠質(zhì)瘤為神經(jīng)系統(tǒng)的高發(fā)性惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞可擴散至周邊或遠(yuǎn)處的腦組織，常規(guī)手術(shù)治療無法完全清除病灶組織。另外，腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后差異顯著，同一分級和類型膠質(zhì)瘤患者的生存時間也可能存在較大差異，因此分析特殊蛋白表達(dá)同預(yù)后的關(guān)系具有重要意義。ADAMTS家族的蛋白酶結(jié)構(gòu)域存在高度保守性，家族成員較多，隨著分子生物學(xué)和蛋白組學(xué)的發(fā)展，研究者逐漸發(fā)現(xiàn)該家族多個蛋白酶成員參與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展或抑癌作用有關(guān)。在本研究中，腦膠質(zhì)瘤患者病灶組織中ADAMTS4、ADAMTS5表達(dá)率分別為79.31%、84.48%，兩種蛋白酶的表達(dá)率均較高，同朱德位等[10]的研究結(jié)果接近。

本研究的結(jié)果中，Ⅳ級、Ⅲ級患者病灶組織中ADAMTS4與ADAMTS5蛋白酶的表達(dá)率高于Ⅰ級、Ⅱ級者(P<0.05)；伴重度瘤周水腫患者的病灶組織中ADAMTS4與ADAMTS5蛋白酶的表達(dá)率高于輕度瘤周水腫者(P<0.05)，提示膠質(zhì)瘤的分級、瘤周水腫程度越高，則患者病灶細(xì)胞中ADAMTS4、ADAMTS5蛋白酶表達(dá)越高，ADAMTS4、ADAMTS5蛋白酶在一定程度上可反映腫瘤的浸潤程度和惡性程度。膠質(zhì)瘤病灶首先分離出侵襲細(xì)胞并在整合蛋白的作用下將其黏附于細(xì)胞外基質(zhì)上，腦組織中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分為透明質(zhì)酸、蛋白聚糖，病灶細(xì)胞可合成較多的透明質(zhì)酸酶、蛋白酶，催化細(xì)胞外基質(zhì)的分解，其中ADAMTS4可催化透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白B/b的水解[11]，阻礙該結(jié)合蛋白對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞運動、遷移的抑制作用，以至于腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移；ADAMTS5可催化細(xì)胞外基質(zhì)的分解，促進(jìn)膜錨定內(nèi)皮前體細(xì)胞的釋放，使得病灶細(xì)胞通過血管腔、血管-薄壁組織交界處發(fā)生遷移運動，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長和血管的新生，導(dǎo)致病情進(jìn)展。瘤周水腫會降低病灶周邊組織的緊密度，同時影響血氧供應(yīng)，有助于病灶細(xì)胞的遷移、擴散，因此重度瘤周水腫者的腫瘤細(xì)胞更易于侵襲，惡性程度更高，Wang等[12]的研究也表明這一觀點。囊變是很多膠質(zhì)瘤伴發(fā)的改變，囊變是血漿蛋白質(zhì)在血-腦屏障損傷時進(jìn)入到腦組織中，經(jīng)過長時間積累形成的，由于腫瘤代謝快，增殖活躍，腫瘤新生血管與供血、供氧之間失衡，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生壞死、出血和囊性變，Chan等[13]研究證實腫瘤囊變與缺氧因子(HIF-1α、VEGF、CD34)有關(guān)，本實驗伴囊變與未伴囊變組織中的ADAMTS4和ADAMTS5兩種蛋白表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，推斷其作用機制可能與這些因子無關(guān)，而與上述水腫有關(guān)因子可能有關(guān)，具體機制有待進(jìn)一步研究。

Dwyer等[14]的試驗研究指出，ADAMTS4與ADAMTS5蛋白酶能降解膠質(zhì)瘤微環(huán)境中透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白B/b，降解后的碎片，能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運動，尤其是在晚期膠質(zhì)瘤中，能夠促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。還有研究指出，膠質(zhì)瘤周水腫程度越重、膠質(zhì)瘤分級越高則組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的表達(dá)水平越高，這些活性因子水平的變化將會影響ADAMTS4、ADAMTS5的表達(dá)，而且IL-1的刺激會促進(jìn)ADAMTS4高表達(dá)[15]，推測其原因可能為這些細(xì)胞因子和ADAMTS4、ADAMTS5蛋白酶共同參與了膠質(zhì)瘤的病情進(jìn)展，但其相互關(guān)系及機制還不清楚。

經(jīng)Spearman分析上述兩種蛋白酶表達(dá)率成明顯正相關(guān)(P<0.05)，提示兩種蛋白酶可能存在協(xié)同效應(yīng)，然而其具體作用信號通路尚不明確，仍然需進(jìn)一步深入分析。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ADAMTS4、ADAMTS5兩種蛋白酶陽性表達(dá)者的累積生存率比陰性表達(dá)的明顯降低(P<0.05)，這提示ADAMTS4、ADAMTS5的表達(dá)可能同膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后狀況有關(guān)，而ADAMTS4、ADAMTS5的陽性表達(dá)者生存時間較短，可能與陽性表達(dá)者病情較重有關(guān)。

綜上可見，腦膠質(zhì)瘤分級高、瘤周水腫嚴(yán)重者ADAMTS4、ADAMTS5兩種蛋白酶表達(dá)率增高，而是否伴囊變者這兩種蛋白酶表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)差異，推測ADAMTS4、ADAMTS5與腦膠質(zhì)瘤的病情進(jìn)展和病灶浸潤有關(guān)，同時這兩種蛋白酶可能存在協(xié)同效應(yīng)，但是這兩種蛋白酶與腦膠質(zhì)瘤的具體關(guān)系還需進(jìn)一步研究進(jìn)行驗證。