生命早期抗生素應(yīng)用對小鼠體重、脂代謝及胰島素的影響*

劉萬軍，鄧 亞，王建青，楊琍琦

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 兒科 (合肥 230000)

新生兒期的抗生素暴露對個體較長時間內(nèi)的體重增長都具有明顯影響，而且其體重的變化程度因應(yīng)用抗生素的種類和方式而不同[1]，有研究[2]證實廣譜的抗生素對新生兒遠期體重的增加更為明顯，并且會改變體內(nèi)激素水平并且造成脂代謝紊亂，從而發(fā)生肥胖[3]。目前，臨床上新生兒期應(yīng)用最為廣泛的抗生素為第三代頭孢菌素和青霉素[4]，但是關(guān)于這兩類抗生素在新生兒期的應(yīng)用對個體整個生命周期體重的具體情況如何，目前尚無相關(guān)報道。因此,研究第三代頭孢菌素和青霉素在小鼠生命早期不同方案的應(yīng)用將為新生兒抗生素方案選擇提供理論依據(jù)，也為預(yù)防兒童遠期肥胖提供重要價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取2周齡雄性清潔級昆明小鼠144只，體重8～13 g，由北京維通利華實驗動物公司提供標(biāo)準(zhǔn)飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。將實驗動物隨機分為6組，每組24只：靜脈注射給藥對照組(以下簡稱靜脈對照組)、頭孢噻肟靜脈注射給藥組(應(yīng)用抗生素為頭孢噻肟，以下簡稱靜脈單用組)、抗生素聯(lián)用靜脈注射給藥組(應(yīng)用抗生素為頭孢噻肟聯(lián)合氨芐西林舒巴坦，以下簡稱靜脈聯(lián)用組)、經(jīng)口給藥對照組(口服生理鹽水，以下簡稱口服對照組)、口服單抗生素組(應(yīng)用抗生素為頭孢噻肟，以下簡稱口服單用組)、口服聯(lián)用抗生素組(應(yīng)用抗生素為頭孢噻肟聯(lián)合氨芐西林舒巴坦，以下簡稱口服聯(lián)用組)。將抗生素配成25 g/L液體，通過小鼠相對人體表面積用藥量計算小鼠用藥劑量，按0.018 mL/kg分別通過尾靜脈注射、口服(灌胃)給藥[5]。注射給藥3次/d，口服給藥3次/d。各組小鼠均自由采食，連續(xù)飼養(yǎng)3月。給藥期間，每天稱量小鼠體重1 次，根據(jù)體重變化及時調(diào)整給藥量。所有小鼠實驗期間自由攝食及飲水，環(huán)境溫度(22±2)℃和濕度(55±10)%，明暗周期12 h。

1.2 藥物及試劑

本研究所用抗生素頭孢噻肟(注射粉劑，規(guī)格：1.0 g)購自華北制藥河北華民藥業(yè)，氨芐西林舒巴坦(注射粉劑，規(guī)格：0.75 g)購自意大利豪普特生產(chǎn)廠?？偰懝檀?total cholesterol，TC)、 甘油三酯(triglyceride，TG)、 低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)及高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。胰島素(insulin，INS)試劑盒購自安徽欣樂生物技術(shù)有限公司。

1.3 相關(guān)指標(biāo)檢測

分別于飼養(yǎng)1月末、2月末、3月末剖殺小鼠，剖殺前小鼠禁食12 h，每組每個時間點隨機剖殺8只，留取血液樣本，采用酶比色法按照試劑盒操作說明進行分析，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測小鼠相關(guān)脂代謝指標(biāo)。應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中小鼠胰島素(INS)水平，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中小鼠胰島素濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同方案抗生素干預(yù)對小鼠體重的影響

為了探討抗生素對小鼠肥胖的影響，選取初始體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)的小鼠，不同分組方式連續(xù)干預(yù)1周，后于整個飼養(yǎng)周期內(nèi)每天測量1次小鼠的體重。選取初始體重、飼養(yǎng)1月末、2月末、3月末終體重進行分析，各組之間在起始體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?？股仂o脈注射給藥組小鼠在1月末和2月末相比靜脈注射對照組均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，3月末與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在經(jīng)口干預(yù)的小鼠中，3組小鼠在喂養(yǎng)過程中的體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組小鼠體重的比較

注: 與靜脈對照組相比較，*P<0.05；與口服對照組相比較，#P>0.05

2.2 不同方案抗生素干預(yù)對小鼠血脂成分及胰島素的影響

在飼養(yǎng)周期的1、2、3月末每組隨機選取8只小鼠剖殺，留取血液樣本進行TC、TG、HDL、LDL和INS檢測。與口服對照組相比，口服給藥兩組小鼠在喂養(yǎng)過程中TC、TG、HDL、LDL和INS水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與靜脈對照組相比，靜脈單用組、靜脈聯(lián)用組的TC水平在喂養(yǎng)過程中的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在TG水平上，靜脈單用組、靜脈聯(lián)用組相較于靜脈對照組呈先升高后降低的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。靜脈單用組、靜脈聯(lián)用組相較于靜脈對照組的HDL水平呈先降低后升高的趨勢，這種趨勢與TG相反，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在LDL水平上，靜脈單用組、靜脈聯(lián)用組相較于靜脈對照組在喂養(yǎng)的1月末和2月末均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在3月末比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在INS水平上，靜脈單用組、靜脈聯(lián)用組相較于靜脈對照組喂養(yǎng)的1月末和2月末均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在3月末比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2～6)。

表2 各組小鼠血清TC比較

注: 與口服對照組相比較，#P>0.05

表3 各組小鼠血清TG比較

注: 與靜脈對照組相比較，*P<0.05；與口服對照組相比較，#P>0.05

表4 各組小鼠血清HDL比較

注: 與靜脈對照組相比較，*P<0.05；與口服對照組相比較，#P>0.05

表5 各組小鼠血清LDL比較

注: 與靜脈對照組相比較，*P<0.05；與口服對照組相比較，#P>0.05

表6 各組小鼠血清INS比較

注: 與靜脈對照組相比較，*P<0.05；與口服對照組相比較，#P>0.05

3 討論

近年來，研究[6-7]表明，生命早期的抗生素暴露都將會改變個體的體重變化，并且體重的變化與抗生素暴露的時間長短呈正相關(guān)。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)生命早期有抗生素暴露的兒童體重指數(shù)與無抗生素暴露的兒童存在明顯差異，且經(jīng)常有抗生素暴露的兒童發(fā)生肥胖的概率大于無經(jīng)常性抗生素暴露的兒童[1]。目前，在一些臨床小鼠的機制研究[8-9]中表明，抗生素改變小鼠的體重不僅是依賴于增加能量攝入或荷爾蒙的變化調(diào)節(jié)飽腹感,也與碳水化合物轉(zhuǎn)換成短鏈脂肪酸從而調(diào)節(jié)結(jié)腸的能量吸收效率有關(guān)。而另一種可能的機制是，新生兒期脆弱的腸道菌群穩(wěn)態(tài)極易受到抗生素的擾動，而生命早期的腸道菌群失調(diào)將可能會破壞個體的脂代謝平衡[10]。在臨床工作中，在新生兒出生時通常接受經(jīng)驗性的抗生素治療，而在新生兒更容易受到抗生素暴露相關(guān)的干擾[11-12]。在生命早期抗生素暴露實驗研究中，通過塑造青霉素破壞小鼠腸道菌群模型證明在抗生素暴露下，機體所產(chǎn)生的代謝異常在停藥后將在相當(dāng)長時間內(nèi)持續(xù)存在[10]。這也反映了生命早期的抗生素暴露在個體生命周期中的長期影響。

一般來說，生命早期在人類特指2周歲之前的嬰幼兒期。此期兒童免疫力低下，易于罹患各種感染性疾病，此期兒童抗生素的使用相較于其他時期更為頻繁[13]。在本研究的靜脈干預(yù)小鼠模型中，選擇2周齡未離乳的幼鼠作為干預(yù)對象，并且選擇1～3月齡小鼠作為最終指標(biāo)的觀察對象，對應(yīng)人類生命周期中新生兒期至成年期的各階段情況[14]。在本研究中，與靜脈對照組相比，靜脈單用組、靜脈聯(lián)用組小鼠在1月末和2月末相比靜脈注射對照組均明顯增高，而在3月末無明顯變化，這說明在生命早期單獨靜脈應(yīng)用或者聯(lián)合應(yīng)用抗生素都將導(dǎo)致小鼠體重增高，并且這種影響將在小鼠生命周期中持續(xù)相當(dāng)長時間。從血清中各組脂類分析中可以看出，與靜脈對照組相比，靜脈單用組、靜脈聯(lián)用組的LDL、TG均在干預(yù)后相當(dāng)長時間內(nèi)表現(xiàn)為增高，而HDL的變化趨勢與之呈相反,這種差異與肥胖兒童和正常兒童之間的差異相同[15]，這說明生命早期單獨靜脈應(yīng)用或者聯(lián)合應(yīng)用抗生素都將導(dǎo)致小鼠脂代謝的異常。在INS水平上，靜脈單用組、靜脈聯(lián)用組相較于靜脈對照組總體呈先降低后升高的趨勢，這說明在生命早期單獨靜脈應(yīng)用或者聯(lián)合應(yīng)用抗生素都將導(dǎo)致小鼠胰島素代謝水平的異常。而胰島素水平的異常，與肥胖個體的胰島素抵抗存在密切關(guān)系[16]。本研究中口服抗生素干預(yù)組小鼠與對照組小鼠相比，其體重、脂代謝和胰島素水平在喂養(yǎng)過程中均未出現(xiàn)明顯差異。 Morel等[17]研究認為新生兒動物模型口服應(yīng)用抗生素不會導(dǎo)致體重增加，這與本研究的結(jié)果一致。這說明口服抗生素對個體代謝、胰島素、體重等影響相對較小，也證明不同方案的抗生素暴露對個體產(chǎn)生的影響亦不同。生命早期靜脈應(yīng)用抗生素將造成小鼠較長期的體重增加，脂代謝、胰島素分泌紊亂，且無論單獨應(yīng)用還是聯(lián)合應(yīng)用都會對個體產(chǎn)生較長期的影響。而這種影響在生命早期口服應(yīng)用抗生素對小鼠的影響并不明顯。導(dǎo)致口服與靜脈用藥不同情況的出現(xiàn)，可能是由于靜脈用藥與口服用藥吸收率的不同。相較于口服用藥，靜脈用藥對腸道微生物群具有更大的破壞力[18]，這種腸道菌群構(gòu)成的改變可能是本實驗中小鼠體重、代謝指標(biāo)、激素等異常的更深層次的原因[19]。

綜上所述，既往關(guān)于抗生素與肥胖的研究多是研究在短時間內(nèi)代謝及體重變化，本研究通過選擇嬰期最常用的抗生素在小鼠生命早期進行抗生素干預(yù)，檢測小鼠脂代謝、胰島素及記錄體重的長期動態(tài)變化過程，研究對比抗生素干預(yù)組和對照組小鼠生命不同階段的體重、外周血清脂代謝及胰島素的動態(tài)變化過程。本研究證明在生命早期以不同方案應(yīng)用抗生素造成的影響不同，其中靜脈應(yīng)用抗生素將對個體體重增加并且造成較長期的脂代謝、胰島素分泌異常，這將為臨床在兒童生命早期選擇最佳抗生素應(yīng)用方案提供理論依據(jù)。本實驗不足之處在于沒有對抗生素劑量的應(yīng)用進行進一步探討，后期可完善抗生素劑量方面的分組，為臨床抗生素劑量選擇提供理論依據(jù)。