玉米黑粉菌多糖的提取及其對小鼠急性酒精肝損傷保護作用的研究*

張永紅，張 杰，張 橋，榮 林，孫永全，呂文旭，柏瑞彤

齊魯醫(yī)藥學院 (淄博 255300)

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是臨床上常見的肝臟疾病，主要是由于長時間大量飲酒所引發(fā)的肝臟損害性病變[1]。為治療ALD，近年來人們做了很多研究，如發(fā)現(xiàn)CYP2E1的表達水平[2]、細胞因子[3-4]等，都與ALD的發(fā)生關系密切，但在有效治療ALD方面，僅局限在戒酒、營養(yǎng)支持、對癥藥物治療及肝移植等[5-7]，因此如何才能安全且有效的預防和治療酒精性肝損傷便具有重要意義[8]。

近年來，人們對真菌多糖的研究不斷深入，越來越多真菌多糖的活性被開發(fā)和研究利用[9-13]。玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)又叫玉蜀黍黑粉菌，屬于擔子菌亞門，冬孢菌綱，黑粉菌目，黑粉菌科，孢堆黑粉菌屬，分布范圍廣。大量研究[14]證實，玉米黑粉菌具有諸多生物活性，比如在《植物病原真菌學》一書中，就記載了玉米黑粉菌的藥用價值。費尚芬等[15]也提出玉米黑粉菌可藥用，利肝臟。陳利軍等[16]指出玉米黑粉菌具有利膽保肝、益腸胃，解毒作用，可用于預防和治療肝臟系統(tǒng)疾病和胃腸道潰瘍，并能助消化、通便。但目前關于玉米黑粉菌多糖的研究極少，本研究建立了小鼠急性酒精肝損傷模型，研究了玉米黑粉菌多糖對小鼠急性酒精肝損傷的保護作用，為玉米黑粉菌多糖的開發(fā)利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明系小鼠60只，雄性，20～24 g，購自濟南金豐實驗動物有限公司。

1.1.2 藥品及主要試劑 玉米黑粉菌子實體干品，來自齊魯醫(yī)藥學院醫(yī)學遺傳研究中心；聯(lián)苯雙酯，購自淄博仁濟堂醫(yī)藥連鎖有限公司；谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)檢測試劑盒，購自南京建成生物技術公司。

1.1.3 主要儀器 旋轉蒸發(fā)儀，型號RE-3000A，購自上海振捷實驗設備有限公司；可見分光光度計，型號V-5000，購自上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米黑粉菌粗多糖的提取 玉米黑粉菌60 ℃烘干，粉碎，過40目篩，取黑粉菌粉末1∶20料液比，于70 ℃水浴中3 h，提取3次，4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清，合并3次提取液。70 ℃旋轉蒸發(fā)后，加入4倍體積95%乙醇，4 ℃沉淀過夜。4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取沉淀，于60 ℃烘干，得玉米黑粉菌粗多糖。

1.2.2 脫蛋白 將粗多糖溶解于100 mL水中，沙維積法(Sevag法)(多糖溶液∶氯仿∶正丁醇=20∶4∶1)脫蛋白，旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑，加入4倍體積95%乙醇，4 ℃沉淀過夜，4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取沉淀，于60 ℃烘干，得玉米黑粉菌精多糖。

1.2.3 多糖含量測定 總糖含量采用苯酚-硫酸法測定[17]。精確吸取稀釋10倍多糖溶液2 mL，加入6%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL充分混勻，顯色，在490 nm波長處測其吸光度值。根據葡萄糖標準曲線和多糖的吸光度值計算多糖含量。

1.2.4 小鼠AST、ALT、AKP含量測定 昆明系小鼠60只隨機分為空白組、模型組[生理鹽水(150 mg/kg)]、陽性組[聯(lián)苯雙酯(150 mg/kg)]、高糖組(400 mg/kg)、中糖組(200 mg/kg)、低糖組(100 mg/kg)，每組各10只。每天灌胃給藥1次，持續(xù)30 d，最后1次給藥1 h后，除空白組給予生理鹽水外，其余5組均按12 mL/kg的量灌胃給予50%酒精[18]。禁食24 h后，眼球采血，4 000 r/min，離心半徑6 cm，離心10 min，取血清，測定ALT、AST、AKP含量。

1.2.5 小鼠肝臟組織病理學檢查 取各小組小鼠肝臟，經10%甲醛溶液固定，然后70%、80%、90%、95%、100%梯度酒精依次脫水，石蠟包埋、切成6 μm薄蠟片，并用蘇木素-伊紅(HE)染色，制作病理切片，在40倍光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 標準曲線繪制

葡萄糖標準曲線如下(圖1)。

2.2 玉米黑粉菌多糖的含量

玉米黑粉菌細粉，經過水提醇沉，得到玉米黑粉菌粗多糖，得率為13.01%。粗多糖通過Sevag法脫蛋白后，又經乙醇沉淀過夜、干燥后得精多糖，其得率為1.52%。玉米黑粉菌的多糖含量為92.37%，多糖含量較高，可進行下一步實驗。

2.3 玉米黑粉菌多糖對小鼠血清AST、ALT、AKP影響

與空白組相比，模型組血清中AST、ALT、AKP含量明顯升高(P<0.05)，說明小鼠急性酒精肝損傷模型已建立。與模型組相比，陽性組和高糖組血清中AST、ALT、AKP含量明顯降低(P<0.05)，說明一定濃度的玉米黑粉菌多糖對小鼠急性酒精肝損傷具有保護作用(表1)。

組別 ALT/(U/L)AST/(U/L)AKP/(U/100 mL)空白組18.95±2.53?21.39±6.78??13.82±1.46?模型組27.75±6.7739.43±9.4819.81±1.99陽性組14.43±5.68??27.90±3.12?14.17±4.17?高糖組18.03±3.24?25.60±6.54??14.67±6.50?中糖組20.29±7.8033.04±5.2012.91±3.49?低糖組24.47±6.7036.21±7.4313.54±1.86?

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.4 玉米黑粉菌多糖對小鼠病理切片的影響

根據病理切片結果可知，空白組：肝細胞形態(tài)規(guī)則、結構清晰，肝細胞索圍繞中央靜脈呈輻射狀排列，可見數個肝單、雙核細胞，未見明顯細胞變性及壞死。模型組：肝細胞形態(tài)不規(guī)則，肝細胞核固縮明顯，細胞內有明顯脂肪空泡(脂滴)和氣球樣變，肝細胞索排列紊亂。陽性組：肝細胞治療效果較明顯，個別肝細胞可見脂肪空泡(脂滴)和氣球樣變，可見數個肝單、雙核細胞，肝細胞形態(tài)規(guī)則，肝細胞索呈輻射狀排列，無明顯細胞變性及壞死。低劑量組：肝細胞無明顯修復，治療效果不明顯，肝細胞核固縮明顯，細胞內有明顯脂肪空泡和氣球樣變，肝細胞形態(tài)不規(guī)則，肝細胞索排列紊亂。中劑量組：肝細胞得到一定修復，但治療效果不太明顯，可見壞死肝細胞，肝細胞核固縮明顯，可見細胞內有明顯脂肪空泡(脂滴)，肝細胞形態(tài)規(guī)則，肝細胞索呈輻射狀排列。高劑量組：肝細胞治療效果明顯，細胞內無明顯脂肪空泡(脂滴)和氣球樣變，可見數個肝雙核細胞，肝細胞形態(tài)規(guī)則，肝細胞索呈輻射狀排列，無明顯細胞變性及壞死，提示玉米黑粉菌多糖可減輕肝損傷(圖2)。

3 討論

急性酒精肝損傷的動物模型，肝細胞膜的完整性被破壞，使細胞質中ALT、AST流出，因此血清ALT、AST升高被認為是判斷急性肝損傷嚴重程度的重要指標[19]；AKP也是反映肝功能的酶，在各種肝病診斷中有較高應用價值[20]。本研究中，因聯(lián)苯雙酯保肝降酶效果明顯，具有穩(wěn)定肝細胞膜、增強對肝細胞損傷的修復、改善肝組織病理損害的功能[21]，所以選擇聯(lián)苯雙酯為陽性對照觀察保肝作用，保證實驗準確性。陽性對照組和高糖組小鼠血清中ALT、AST、AKP含量明顯比模型組低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但中糖組、低糖組含量與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明玉米黑粉菌多糖發(fā)揮護肝作用可能需達到一定濃度(400 mg/kg)才可，濃度太低(200 mg/kg或100 mg/kg)沒有護肝作用。病理切片的結果和各指標的測定結果相符，提示玉米黑粉菌多糖可有效保護肝細胞，降低酒精對肝細胞的損傷。

自然界存在著種類繁多的天然活性多糖，有細菌多糖、植物多糖、藻類多糖、動物多糖和真菌多糖等[22]。真菌多糖是從天然真菌里面提取的一類由醛基和酮基通過糖苷鍵連接起來而形成的高分子聚合物。由于真菌多糖在真菌菌絲體的細胞質和細胞壁含量較多，其他部分含量相對較少，故提取真菌多糖主要從真菌菌絲體的細胞質和細胞壁中提取。真菌多糖的提取方法有水提醇沉法、超聲波輔助法、酶提取法、微波提取法等[23]，本研究采用最傳統(tǒng)的水提醇沉法提取玉米黑粉菌多糖，雖操作簡單，但時間長，得率不高，還須進一步研究提取方法，增加得率。

玉米黑粉菌多糖是一類重要的生理活性物質，也是玉米黑粉菌功效成分之一[24]，但關于玉米黑粉菌多糖的活性研究鮮見報道。本實驗率先研究了玉米黑粉菌多糖對小鼠急性酒精肝損傷的保護作用，為研究其抗腫瘤、抗氧化、抑菌等活性提供基礎，為玉米黑粉菌多糖的開發(fā)利用提供依據。