A型鉀通道在正常大鼠小腦皮層中的表達(dá)*

王斯穎，余鑫鈺， 楊培培，劉茂雪，胡紅利，唐 新，鄧杰文，黃 成，張 潔，林友勝△

1.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院(成都 610500)

A型鉀通道屬于電壓門控型鉀通道，包括5種亞型，即Kv4.1、Kv4.2、Kv4.3、Kv3.4和Kv1.4[1-3]。由A型鉀通道介導(dǎo)的IA電流是動作電位復(fù)極化早期外向電流的主要成分，它具有快速激活、快速失活的特點(diǎn)，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元放電頻率及放電模式等方面具有重要作用[1-3]。A型鉀通道的不同亞型在各腦區(qū)的分布不同。原位雜交實(shí)驗(yàn)[3]表明，Kv4.1mRNA在各腦區(qū)表達(dá)水平低，但Kv4.2、Kv4.3mRNA表達(dá)水平較高，且具有特定的分布模式。如Kv4.2主要分布在延髓、腦橋核、尾核和殼核；而Kv4.3主要表達(dá)在杏仁核、中縫核、壓后皮層、黑質(zhì)致密部、上丘等[4]。Kv4.2、Kv4.3在有些腦區(qū)表達(dá)，但在不同細(xì)胞群的分布也有差異。例如，在嗅球，Kv4.2主要分布在顆粒細(xì)胞中，而Kv4.3主要分布在球周細(xì)胞[5]。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)鑒定成年雄性SD大鼠小腦皮層A型鉀通道的主要亞型，然后進(jìn)行免疫熒光染色，觀察小腦皮層主要A型鉀通道亞型在小腦皮層神經(jīng)元上的分布和定位，為有關(guān)A型鉀通道參與小腦功能調(diào)控的研究提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年雄性SD大鼠(250～300 g)由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，隨機(jī)抽取6只進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，6只進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

焦碳酸二乙酯(DEPC)購自美國Sigma公司；Trizol和瓊脂糖購自美國Invitrogen公司；RNALater和熒光二抗購自美國Life公司；gDNA Ereaser With PrimeScript RT reagent Kit購自大連寶生物工程有限公司；FastStart Essential Probes Master購自瑞士Roche公司；兔抗Kv4.2抗體(APC-023)、兔抗Kv4.3抗體(APC-017)和兔抗Kv3.4抗體(APC-019)購自以色列Alomone公司；戊巴比妥鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氯化鈉、無水乙醇和氯仿購自成都科龍化工試劑有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀(PIKORed 96，美國ThermoFisher儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)(NanoDrop2000，美國ThermoFisher儀器有限公司)；低溫離心機(jī)(C2500，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器廠)； KD-BM Ⅱ組織包埋機(jī)(浙江科迪儀器設(shè)備有限公司)；TC-120型組織自動脫水機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司)；顯微鏡拍攝及成像系統(tǒng)(BX41，日本Olympus 公司)。

1.4 探針和引物

使用選自瑞士Roche公司探針庫的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，擴(kuò)增所需的引物為匹配探針的特異引物，探針購自Roche公司，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針和引物序列

1.5 qRT-PCR

1.5.1 取材 腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉雄性SD成年大鼠后，斷頭取腦，迅速剝離小腦皮層，置于RNALater中4 ℃過夜后，儲存在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 總RNA提取和定量 按Trizol試劑的說明書，提取組織RNA并溶解于15 μL無RNA酶水中，用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度，OD260/280為 1.7～2.0。

1.5.3 cDNA 的合成 用gDNA Eraser去除基因組DNA后，以O(shè)ligo-dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.5.4 qRT-PCR檢測靶基因mRNA表達(dá) 10 μL定量PCR反應(yīng)體系：上、下游引物(10 μmol/L)各0.15 μL，UPL探針0.15 μL，cDNA 2 μL， FastStart Essential Probes Master 5 μL，加超純水至反應(yīng)總體積為10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，讀取熒光值，循環(huán)40次；最后40 ℃延伸30 s。用滅菌水代替模板cDNA作為陰性對照；用看家基因β-actin作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的內(nèi)參照。分別測定每個(gè)樣品目的基因和β-actin mRNA的臨界循環(huán)數(shù)(Ct)，每個(gè)樣品均作復(fù)孔以減少操作誤差?；虻谋磉_(dá)水平用Ct值表示，各樣本△Ct值是用靶基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值的相對定量法求得，表示樣本相對于內(nèi)參基因的表達(dá)水平，通過比較各靶基因的△Ct值分析基因表達(dá)的相對差異?！鰿t值越高，mRNA的量越少。

1.6 免疫熒光染色

1.6.1 灌注取材和切片 腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉成年雄性SD大鼠后，0.9%生理鹽水150～200 mL灌注至右心耳流出的液體清澈時(shí)，更換4%多聚甲醛溶液快速灌注至動物四肢抽動，再慢速灌至動物四肢變硬，然后取小腦并置于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃過夜。經(jīng)脫水、透明和包埋后，用石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，等距抽片。

1.6.2 免疫熒光染色觀察 按常規(guī)方法進(jìn)行免疫熒光染色，一抗分別用兔抗Kv3.4、兔抗Kv4.2和兔抗Kv4.3多克隆抗體，二抗用驢抗兔熒光二抗(綠色熒光Alexa488，紅色熒光Alexa647)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片，在暗室條件下進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠小腦皮層A型鉀通道亞型mRNA表達(dá)分析

在6只大鼠的所有樣品均檢出Kv4.1、Kv4.2、Kv4.3、Kv3.4和Kv1.4 mRNA表達(dá)。大鼠小腦皮層內(nèi)Kv4.3 mRNA表達(dá)豐度最高，其次為Kv4.2和Kv3.4，Kv4.3、Kv4.2和Kv3.4 mRNA表達(dá)豐度明顯高于Kv4.1和Kv1.4mRNA (P<0.01)(表2)。

表2 大鼠小腦皮層A型鉀通道亞型mRNA的相對含量

注： 與Kv4.1和Kv1.4mRNA比較，#P<0.01

2.2 Kv3.4、Kv4.2和Kv4.3蛋白在小腦皮層中的表達(dá)定位

免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Kv3.4、Kv4.2和Kv4.3蛋白在小腦皮層均有表達(dá)，主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，但這3種A型鉀通道亞型分布在不同的小腦皮層細(xì)胞群；Kv3.4表達(dá)在小腦普肯野氏細(xì)胞，在顆粒細(xì)胞未見Kv3.4陽性產(chǎn)物；Kv4.2表達(dá)在小腦顆粒細(xì)胞，在普肯野氏細(xì)胞未見Kv4.2陽性產(chǎn)物；而Kv4.3在小腦普肯野氏細(xì)胞和顆粒細(xì)胞均有表達(dá)(圖1)。

注：A、D、G：Kv3.4、Kv4.2和Kv4.3陽性神經(jīng)元；B、E、H：DAPI染的細(xì)胞核；C、F、I：Kv3.4、Kv4.2和Kv4.3與DAPI共標(biāo)

3 討論

小腦的表面覆蓋著一層灰質(zhì)即小腦皮質(zhì)，皮質(zhì)內(nèi)含有星型細(xì)胞、籃細(xì)胞、浦肯野氏細(xì)胞、高爾基細(xì)胞和顆粒細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞[6]。小腦皮層將來自大腦皮層、腦干和脊髓的傳入投射，經(jīng)精密分析與整合后，由浦肯野氏細(xì)胞發(fā)出各種輸出指令，調(diào)控機(jī)體的平衡和眼球運(yùn)動，協(xié)助大腦皮層控制隨意運(yùn)動，并參與隨意運(yùn)動的設(shè)計(jì)和編程[6]。小腦皮層主要通過攀緣纖維和苔蘚纖維傳遞外部信息，參與精細(xì)運(yùn)動的調(diào)節(jié)[6]。其中，苔蘚纖維來自脊髓和腦干的核群，傳遞產(chǎn)生感覺和協(xié)調(diào)運(yùn)動的信息，并將信息傳遞給顆粒細(xì)胞，經(jīng)顆粒細(xì)胞的平行纖維而興奮浦肯野氏細(xì)胞，參與運(yùn)動的調(diào)節(jié)[7-8]。

A型鉀通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元的放電頻率，動作電位的產(chǎn)生以及放電模式等方面具有重要作用[1]。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在6只大鼠小腦皮層均檢出Kv4.1、Kv4.2、Kv4.3、Kv3.4和Kv1.4mRNA表達(dá)，其中Kv4.3 mRNA表達(dá)豐度最高，其次為Kv4.2和Kv3.4；Kv4.3、Kv4.2和Kv3.4mRNA表達(dá)豐度明顯高于Kv1.4和Kv4.1 mRNA；提示大鼠小腦皮層主要表達(dá)Kv4.3、Kv4.2和Kv3.4 3種A型鉀通道亞型，這和臂旁外側(cè)核的A型鉀通道亞型相似[9]。采用免疫熒光染色方法觀察到這3種主要A型鉀通道亞型在小腦不同神經(jīng)細(xì)胞群上分布不同，Kv3.4表達(dá)在皮層普肯野氏細(xì)胞，在小腦顆粒細(xì)胞未見Kv3.4陽性產(chǎn)物；Kv4.2表達(dá)在小腦顆粒細(xì)胞，在小腦普肯野氏細(xì)胞未見Kv4.2陽性產(chǎn)物；而Kv4.3在小腦普肯野氏細(xì)胞和顆粒細(xì)胞均有表達(dá)。小腦皮層浦肯野氏細(xì)胞具有整合功能，接收所有其它神經(jīng)元的投射，其軸突是小腦皮層的唯一輸出通路，Kv3.4、Kv4.3在小腦普肯野氏細(xì)胞均有表達(dá)，提示Kv3.4、Kv4.3可能通過調(diào)節(jié)突觸輸入、動作電位起始和反向傳播等，參與小腦普肯野氏細(xì)胞的整合功能，調(diào)節(jié)小腦的運(yùn)動輸出。小腦皮層顆粒細(xì)胞參與外部信息傳入，調(diào)節(jié)精細(xì)運(yùn)動和運(yùn)動學(xué)習(xí)，在小腦皮層顆粒細(xì)胞表達(dá)Kv4.2、Kv4.3，表明Kv4.2與Kv4.3可能參與了小腦外部傳入信息的調(diào)控。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)正常大鼠小腦皮層中存在A型鉀通道表達(dá)，其主要亞型為Kv3.4、Kv4.2和Kv4.3，且不同亞型在小腦皮層不同神經(jīng)細(xì)胞群上分布不同，可能在小腦皮層運(yùn)動調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不同作用。