miR-381-3p靶向特異性蛋白1抑制mTOR/p70s6k信號(hào)通路調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡*

木亞林，岳 愷，李 明

南陽(yáng)市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科 (南陽(yáng) 473000)

食管癌(esophageal carcinoma， EC)是世界上最常見(jiàn)和致命的惡性腫瘤之一，發(fā)病率排名第八，死亡率高居第六，每年有30 萬(wàn)人死于食道癌[1]。雖然診斷和治療技術(shù)均有所改善，但由于預(yù)后不良和復(fù)發(fā)，食管癌仍然很難痊愈，5年生存率約為10%[2]。因此，迫切需要探索食管癌的分子機(jī)制和食管癌早期診斷的生物標(biāo)志物，為改善EC患者的長(zhǎng)期生存提供新的治療策略。已有研究表明miR-381 能夠抑制宮頸癌[3]、甲狀腺乳頭狀癌[4]、口腔鱗癌[5]等多種腫瘤的增殖、遷移和侵襲，但是其對(duì)食管癌的作用尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是磷酸肌醇3激酶相關(guān)激酶家族的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可通過(guò)激活核糖體激酶來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和侵襲轉(zhuǎn)移[6]。p70s6激酶(the p70s6 kinase，p70s6k)是mTOR/p70s6k信號(hào)通路下游mTOR的主要效應(yīng)器[7]。mTOR/p70s6k信號(hào)通路調(diào)控許多腫瘤的存活和細(xì)胞增殖，在包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤中普遍被激活[8]。特異性蛋白1(specificity protein 1，SP1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移中發(fā)揮重要作用。已有研究[9]表明SP1在食管癌中高表達(dá)，且與預(yù)后不良有關(guān)。本文主要探討miR-381-3p靶向SP1抑制mTOR/p70s6k信號(hào)通路對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)購(gòu)自上海善然生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司；miR-381-3p mimic 質(zhì)粒、miR-control質(zhì)粒、SP1質(zhì)粒及各引物均由上?；蛑扑幱邢薰驹O(shè)計(jì)并合成；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司；QIAzol裂解試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司； SYBR-Green PCR試劑盒購(gòu)自上海賽默飛世爾科技公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司； RIPA裂解緩沖液購(gòu)自南京?？藸柹锟萍加邢薰?； BCA試劑盒購(gòu)自上海易色醫(yī)療科技有限公司； MTT試劑盒購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(WL02809)購(gòu)自上海萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司； Ki67抗體(AF1738)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic acid protease 3，Caspase-3)抗體(AC031-2)、B淋巴細(xì)胞瘤2(b-celllymphoma，Bcl-2)抗體(AB112-1)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所； Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(ml120073)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體(ab2732)、p-mTOR抗體(ab8440)購(gòu)自上海艾博抗生物科技有限公司；p70s6激酶(the p70s6 kinase，p70s6k)抗體(SPC-1039D-A565)購(gòu)自廈門(mén)研科生物技術(shù)有限公司；p-p70s6k抗體(AP0540)購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，雷帕霉素購(gòu)自上海愛(ài)必信生物科技有限公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及標(biāo)本來(lái)源 正常食管細(xì)胞(HEEC)和食管癌細(xì)胞(EC109、EC9706、TE1、KYSE450、KYSE790)購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所，將細(xì)胞于含10% 胎牛血清、100 U/ mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)。收集患者術(shù)后新鮮食管癌組織及其癌旁正常組織( 距癌組織邊緣≥2 cm) 作為檢測(cè)樣本，置于-80 ℃的冰箱中保存待檢。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于6孔板每孔(1×106個(gè)/mL)。當(dāng)達(dá)到80% 融合，根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)將100 nmol/L 的miR-381-3p mimic 質(zhì)粒、miR-control質(zhì)粒、SP1質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入EC9706細(xì)胞。

1.2.2 RT-qPCR 采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR采用SYBR-Green PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。U6作為內(nèi)參，使用2-ΔΔc t方法計(jì)算。miR-381-3p 的上游引物序列為：5′-CCAGUGCA CCGACCCUUGAG ACUGC-3′， miR-381-3p的下游引物序列為：5′-AGCCUAAACUCGGUCCAA GCAUC-3′； U6的上游引物序列：5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′， U6的下游引物序列：5′-AACGC TTCACGAATTT GCGT-3′； SP1 的上游引物序列： 5′-TGGTGGGC AGTATGTTGT-3′，SP1 的下游引物序列： 5′-GC TATTGGCATTGGTGAA-3′。

1.2.3 靶基因預(yù)測(cè) 運(yùn)用基因預(yù)測(cè)軟件：TargetScan (http://www.targetscan.org)預(yù)測(cè)miR-381-3p的靶基因。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)靶向關(guān)系 〗收集對(duì)數(shù)期的EC9706細(xì)胞鋪于96孔板，每孔約4×103個(gè)細(xì)胞，24 h后，分別轉(zhuǎn)染miR-control+SP1 WT、miR-control+SP1 MUT 、miR-381-3p mimic+SP1 WT、miR-381-3p mimic +SP1 MUT，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定，用螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對(duì)活性。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 根據(jù)MTT試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作：取對(duì)數(shù)期EC9706 細(xì)胞100 μL加入96孔板(1×104個(gè)/孔)，轉(zhuǎn)染后在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加入10 μL溶液A，再培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)基，加入溶液B，于搖床上低速振蕩10 min，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24 h后離心， 按1×106個(gè)/mL的細(xì)胞濃度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白V和5 μL碘化丙啶，在黑暗的房間里孵化15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot) 收集各組EC9706細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，然后經(jīng) 12% SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至硝酸纖維素膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入一抗(Ki67 1∶1 000、PCNA 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶1 000、Caspase-3 1∶1 000、mTOR 1∶1 000、p-mTOR 1∶2 000、p70s6k 1∶1 000、p-p70s6k 1∶1 000、SP1 1∶500)在4 ℃封閉過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，最后滴ECL曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-381-3p、SP1在食管癌組織和正常組織中的表達(dá)差異

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)正常食管組織和食管癌組織中miR-381-3p和SP1 mRNA的表達(dá)，與正常食管組織相比，食管癌組織中miR-381-3p mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，而SP1 mRNA的表達(dá)的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)正常食管細(xì)胞HEEC和食管癌細(xì)胞EC109、EC9706、TE1、KYSE450、KYSE790中miR-381-3p和SP1 mRNA的表達(dá)，與正常食管細(xì)胞HEEC相比，食管癌細(xì)胞EC109、EC9706、TE1、KYSE450、KYSE790中miR-381-3p mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，而SP1 mRNA的表達(dá)的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇EC9706細(xì)胞株進(jìn)行(圖1)。

2.2 miR-381-3p直接靶向抑制SP1表達(dá)

根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)， miR-381-3p與SP1 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-381-直接作用于SP1，進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。miR-381高表達(dá)明顯抑制了含有野生型SP1質(zhì)粒的熒光素酶活性，但對(duì)突變型SP1質(zhì)粒的熒光素酶活性無(wú)影響(P<0.01)。進(jìn)一步為了驗(yàn)證miR-381高表達(dá)對(duì)SP1的作用，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞SP1 蛋白的表達(dá)。與control組細(xì)胞相比，miR-control組細(xì)胞中SP1 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，miR-381 mimic組細(xì)胞中SP1 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，SP1組細(xì)胞中SP1 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；與miR-381 mimic組相比，miR-381 mimic+SP1組細(xì)胞中SP1 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。因此，miR-381-3p直接靶向抑制SP1表達(dá)(圖2)。

注：A：TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-381-3p與SP1 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-381-3p與SP1靶向關(guān)系；C：Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞SP1 蛋白的表達(dá)，與control組相比，**P<0.01；與miR-381-3p mimic組相比，##P<0.01

2.3 miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況可知，與Control組細(xì)胞相比，miR-control組細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化，miR-318 mimic組細(xì)胞增殖明顯降低(P<0.01)，SP1組細(xì)胞增殖明顯增高(P<0.01)；與miR-318 mimic組相比，miR-318 mimic+SP1組細(xì)胞增殖明顯增高(P<0.01)。因此，miR-318 靶向SP1抑制食管癌細(xì)胞EC9706增殖。

為了進(jìn)一步證實(shí)miR-381-3p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的作用，運(yùn)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67、PCNA的蛋白表達(dá)。與control組細(xì)胞相比，miR-control組細(xì)胞中Ki67、PCNA 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；miR-381 mimic組細(xì)胞中Ki67和PCNA蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；SP1組細(xì)胞中Ki67、PCNA 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；與miR-381 mimic組相比，miR-381 mimic+SP1組細(xì)胞中Ki67、PCNA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。證實(shí)了miR-318 靶向SP1抑制食管癌細(xì)胞EC9706增殖。

流式檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，與Control組細(xì)胞相比，miR-control組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化，miR-318 mimic組細(xì)胞凋亡率明顯降升高(P<0.01)，SP1組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)；與miR-318 mimic組相比，miR-318 mimic+SP1組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)。因此，miR-318 靶向SP1誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞EC9706凋亡。

為了進(jìn)一步證實(shí)miR-381-3p對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的作用，運(yùn)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3的表達(dá)。與control組細(xì)胞相比，miR-control組細(xì)胞中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，miR-381 mimic組細(xì)胞中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，SP1組細(xì)胞中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與miR-381 mimic組相比，miR-381 mimic+SP1組細(xì)胞中Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-318 靶向SP1誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞EC9706凋亡(圖3)。

注：A：MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，與control組相比，**P<0.01，與miR-381-3p mimic組相比，##P<0.01;B、C：Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki67和PCNA的表達(dá)水平，與control組相比，**P<0.01，與miR-381-3p mimic組相比，##P<0.01；D、E：流式檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，與control組相比，**P<0.01，與miR-381-3p mimic組相比，##P<0.01；F、G：Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白Bax/Bcl-2和Cleaved caspase-3的表達(dá)，與control組相比，**P<0.01，與miR-381-sp mimic組相比，##p<0.01

2.4 miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細(xì)胞中mTOR/p70s6k信號(hào)通路激活

mTOR/p70s6k信號(hào)通路和癌癥的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)，假設(shè)miR-381-3p靶向SP1能夠調(diào)控食管癌細(xì)胞中mTOR/p70s6k信號(hào)通路。通過(guò)Western blot檢測(cè)p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與control組細(xì)胞相比，miR-control組細(xì)胞中p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，miR-381 mimic組細(xì)胞中p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，SP1組細(xì)胞中p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；與miR-381 mimic組相比，miR-381 mimic+SP1組細(xì)胞中p-mTOR/mTOR、p-p70s6k/p70s6k蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，說(shuō)明miR-318 靶向SP1抑制食管癌細(xì)胞EC9706中mTOR/p70s6k信號(hào)通路激活(圖4)。

2.5 抑制mTOR/p70S6K信號(hào)通路抑制EC9706細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡

為了研究mTOR/p70S6K信號(hào)通路對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706增殖和凋亡的作用，用100 nmol/L的雷帕霉素處理24 h，然后使用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot評(píng)估細(xì)胞增殖、凋亡情況。與對(duì)照組相比，雷帕霉素處理組組細(xì)胞增殖明顯降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，增殖標(biāo)記蛋白Ki67表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，凋亡標(biāo)記蛋白cleaved caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，而SP1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，說(shuō)明雷帕霉素抑制mTOR/p70S6K信號(hào)通路，能夠抑制EC9706細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但不會(huì)影響SP1蛋白的表達(dá)。所有數(shù)據(jù)提示mTOR/p70s6k信號(hào)通路可能參與miR-381-3p調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡(圖5)。

注： A：MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況,與control組相比，**P<0.01；B：流式檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，**P<0.01；C：Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Ki67、Cleaved caspase-3和SP1的表達(dá)，與control組相比，**P<0.01

3 討論

miRNA是一類(lèi)小的非編碼，單鏈具有約18-25個(gè)核苷酸的RNA，通常通過(guò)與靶mRNA的3′-UTR的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)靶信使RNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平。其與多種生物功能和病理學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，包括細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡和自我更新等，在腫瘤發(fā)生中充當(dāng)啟動(dòng)子或抑制因子[10]。miR-381在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-381能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲中。例如，miR-381在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-381可通過(guò)靶向CXCR4抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[11]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，miR-381-3p在食管癌細(xì)胞EC9706中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-381-3p能夠抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果有力地表明了miR-381-3p在食管癌中的潛在腫瘤抑制作用。

SP1在腫瘤存活、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移所需的腫瘤相關(guān)基因的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如，SP1在乳腺癌中過(guò)度表達(dá)，可以調(diào)節(jié)TINCR-MIR-7-KLF4軸，從而刺激細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[12]。本課題組發(fā)現(xiàn)，在食管癌細(xì)胞中SP1表達(dá)上調(diào)。已有研究[13]發(fā)現(xiàn)SP1是各種細(xì)胞行為包括細(xì)胞周期，增殖和凋亡的中介，且在癌癥中SP1受多個(gè)miRNA調(diào)節(jié)，如，在骨肉瘤中，據(jù)報(bào)道m(xù)iR-493通過(guò)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲，因此可以開(kāi)發(fā)miR-493/SP1軸作為潛在的治療靶點(diǎn)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌細(xì)胞中，miR-381-3p與SP1 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，且miR-381-3p直接靶向抑制SP1表達(dá)，從而調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖和凋亡。

本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-381-3p后，食管癌細(xì)胞增殖明顯降低、Ki67和PCNA蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯降升高、Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；而高表達(dá)SP1可以逆轉(zhuǎn)miR-381-3p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。Ki67是細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，其表達(dá)水平越高表明處于增殖周期的細(xì)胞越多[14]。PCNA是增殖細(xì)胞核抗原，與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[15]。Bcl-2是抗細(xì)胞凋亡蛋白， Bax是促細(xì)胞凋亡蛋白，Bax/Bcl-2比值決定細(xì)胞受到凋亡刺激信號(hào)時(shí)發(fā)生凋亡還是生存[16]。cleaved Caspase-3是凋亡程序中的主要執(zhí)行者之一，是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的標(biāo)志性蛋白[17]。因此，miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。

mTOR是進(jìn)化的保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，作為調(diào)節(jié)因子參與多種細(xì)胞活動(dòng)包括細(xì)胞增殖，代謝，生長(zhǎng)和存活等過(guò)程，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和侵襲轉(zhuǎn)移[18]。p70S6K是mTOR的下游靶標(biāo)之一，其以雷帕霉素敏感的方式調(diào)節(jié)翻譯起始復(fù)合物，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑控制下的主要翻譯調(diào)節(jié)因子[19]。mTOR可以促進(jìn)p70S6K磷酸化，從而刺激翻譯細(xì)胞從周期G1到S階段所需的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[20]。已有研究[21]表明在食管癌中mTOR/p70S6K信號(hào)通路被異?；罨１狙芯堪l(fā)現(xiàn)，miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細(xì)胞中mTOR/p70s6k信號(hào)通路激活，用雷帕霉素抑制mTOR/p70S6K信號(hào)通路，能夠抑制EC9706細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示miR-381-3p靶向SP1通過(guò)抑制mTOR/p70S6K信號(hào)通路來(lái)抑制EC9706細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，在食管癌細(xì)胞中，miR-381-3p與SP1 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，且miR-381-3p直接靶向抑制SP1表達(dá)；miR-381-3p靶向SP1抑制食管癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡，抑制mTOR/p70s6k信號(hào)通路激活；同時(shí)，抑制mTOR/p70S6K信號(hào)通路能夠抑制EC9706細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡；提示miR-381-3p靶向SP1抑制mTOR/p70s6k信號(hào)通路，從而抑制食管癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這為食管癌的診斷和治療提供參考數(shù)據(jù)，其動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究。