MPTP誘導(dǎo)帕金森模型大鼠的血液學(xué)及臨床病理評(píng)價(jià)*

曾朝蓉，岳 冬，孫 偉，胡力文，石 真，符 杰，龔玉來，姚曉梅，熊義英，陳正禮△，胡延春△

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬四川省八一康復(fù)中心(成都 611135)；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院(成都 611130)

帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是繼阿爾茲海默癥后的第二常見的神經(jīng)退行性疾病。PD的主要臨床特征為運(yùn)動(dòng)障礙，其中包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)減少、遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢步伐不協(xié)調(diào)等[1-2]。主要病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元細(xì)胞的變性死亡，導(dǎo)致黑質(zhì)-紋狀體通路退化，從而使紋狀體內(nèi)的多巴胺含量明顯減少，黑質(zhì)殘存的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，即路易小體(Lewy body, LB)[3-6]。

隨著對PD發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究，人們逐漸對PD有所認(rèn)識(shí)，PD動(dòng)物模型的研究也在不斷發(fā)展。最常用的方法是利用神經(jīng)毒素MPTP建立PD動(dòng)物模型，其無論是在神經(jīng)病理特征或運(yùn)動(dòng)行為方面都與人類PD酷似[7]。MPTP不具有神經(jīng)毒性，使用后出現(xiàn)PD癥狀的原因是MPTP在B型單胺氧化酶(MAO-B)的作用下轉(zhuǎn)化為MPP+，隨后由多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter, DAT)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，在神經(jīng)細(xì)胞中形成自由基對黑質(zhì)紋狀體進(jìn)行破壞，導(dǎo)致多巴胺(DA)含量減少[8-9]。因此，本研究利用MPTP建立PD大鼠模型，期望能從血液學(xué)及病理學(xué)角度揭示PD發(fā)病機(jī)制，為臨床診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重280～320 g，10～12周齡[成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030]。

1.1.2 儀器及試劑 主要儀器：RM2235石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)、DM1000徠卡顯微成像系統(tǒng)(德國Leica公司)。主要試劑：1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(北京諾其雅盛生物科技有限公司)、乙醚(上海展云化工有限公司)、蘇木素染液、兔抗大鼠酪氨酸羥化酶(中國Boster公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及PD模型制作 挑選出爬桿試驗(yàn)得分為0分的大鼠16只進(jìn)行試驗(yàn)，隨機(jī)抽取6只作為對照組，10只作為模型組。將MPTP用生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為30 g/L的溶液，以30 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，1次/d，連續(xù)注射 7 d，第7天注射結(jié)束1 h后立即用爬桿實(shí)驗(yàn)的方法對大鼠進(jìn)行篩選，評(píng)分在 1.5～2.0分的視為PD模型制作成功的大鼠，并在第14天再次進(jìn)行行為學(xué)檢測，判斷模型穩(wěn)定性。

1.2.2 行為學(xué)檢測 1)曠場試驗(yàn)：將大鼠放置在開闊箱的正中格內(nèi)，5 min內(nèi)觀察大鼠的活動(dòng)行為。測定的指標(biāo)包括：①方格間穿行次數(shù)(3只爪以上跨入鄰格的次數(shù))；②豎起次數(shù)(兩前肢離地 1 cm 以上的次數(shù))； 2)爬桿試驗(yàn)：爬桿試驗(yàn)使用直徑為35 mm、高1 000 mm 的光滑不銹鋼管，將不銹鋼管垂直豎立，使大鼠頭向下放置在不銹鋼管桿的頂部，讓大鼠從金屬桿頂部沿著桿自然爬至桿底，在大鼠下行時(shí)觀察其行為，按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)分，每只大鼠爬桿兩次，最終計(jì)算平均分。爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：四肢并用，一次順利從桿上爬下為 0 分；一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行為的為0.5 分；上桿后間歇停頓數(shù)次后趴下，但可抱緊金屬桿為1分；滑行后掉落為1.5分；不能抓桿，直接掉落為2.0分。

1.2.3 樣品采集 對大鼠禁食8 h，不禁水。乙醚麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，隨后斷頸取腦，放入4%多聚甲醛固定1周。

1.2.4 血液學(xué)檢測 用采集的血液處理后進(jìn)行血生化和血常規(guī)指標(biāo)測定。

1.2.5 大鼠黑質(zhì)病理檢測 1)HE 染色：石蠟包埋后切片，選黑質(zhì)部組織切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素和伊紅染色，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。2)免疫組化檢測：選黑質(zhì)部組織切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)后用山羊血清封閉，滴加一抗后4 ℃過夜。次日，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗 3 次后滴加二抗，PBS 洗后使用 DAB 試劑盒顯色；最后蘇木素復(fù)染、脫水、透明及封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果

通過曠場試驗(yàn)和爬桿試驗(yàn)分別檢測了各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能的變化。曠場試驗(yàn)顯示，MPTP模型組大鼠第7天與第14天，與對照組相比，方格間穿行的次數(shù)和豎立次數(shù)均明顯性下降(P<0.05)；爬桿試驗(yàn)顯示，MPTP模型組大鼠第7天與第14天，與對照組相比，爬桿得分明顯增加 (P<0.05)(表1～2)。

表1 各組大鼠爬桿試驗(yàn)評(píng)分(分)

注：與同時(shí)間對照組相比，*P<0.05；與給藥前MPTP模型組相比，#P<0.05

表2 各組大鼠曠場試驗(yàn)運(yùn)動(dòng)變化

注：與同時(shí)間對照組相比，*P<0.05；與給藥前MPTP模型組相比，#P<0.05

2.2 血液學(xué)結(jié)果

血生化結(jié)果顯示，與對照組相比，MPTP模型組大鼠的直接膽紅素明顯降低(P<0.05)；血常規(guī)結(jié)果顯示，各組各項(xiàng)血常規(guī)檢測指標(biāo)均未超出正常值范圍，但模型組的血紅蛋白、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)均明顯或極明顯高于對照組(P<0.05，P<0.01)。其他血液指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3～4)。

表3 各組大鼠血生化指標(biāo)

注：與對照組相比，*P<0.05

表4 各組大鼠血常規(guī)指標(biāo)

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 中腦黑質(zhì)病理檢測結(jié)果

2.3.1 中腦黑質(zhì)病理改變 對照組多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、分布均勻，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量未見明顯的改變。MPTP模型組多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核固縮濃染，細(xì)胞周圍間隙增寬(圖1)。

2.3.2 中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞表達(dá) 對照組黑質(zhì)區(qū)的TH陽性細(xì)胞表達(dá)無明顯變化，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，平均光密度值為0.26±0.06。與對照組比較，MPTP模型組黑質(zhì)中TH陽性細(xì)胞表達(dá)明顯降低，平均光密度值明顯降低0.02±0.01(P<0.05) (圖2)。

3 討論

PD是一種神經(jīng)內(nèi)科運(yùn)動(dòng)障礙疾病，其主要表現(xiàn)為錐體外系運(yùn)動(dòng)障礙，如肌僵直、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩及步態(tài)異常等[10-11]。在行為學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，利用MPTP誘導(dǎo)的大鼠均出現(xiàn)后肢無力、震顫、被毛豎立、尾僵直、暴躁等典型PD臨床癥狀，其運(yùn)動(dòng)行為明顯減少。在爬桿試驗(yàn)中大鼠抱桿能力變差，評(píng)分明顯增高。這與狄榮科等[12-13]得出的結(jié)果相同。且本研究在注射MPTP后觀察到隨著時(shí)間的變化其行為學(xué)數(shù)據(jù)前后無差異，說明PD模型穩(wěn)定。PD病理變化最基本的核心為中樞神經(jīng)多巴胺能神經(jīng)元丟失，而DA能神經(jīng)元主要集中在大腦黑質(zhì)致密部[14]。有研究[15]表明，MPTP可通過血腦屏障進(jìn)入腦中形成MPP+，形成的MPP+與DA高度親和，隨后被DAT轉(zhuǎn)運(yùn)到DA能神經(jīng)元從而選擇性破壞黑質(zhì)DA能神經(jīng)元。通過中腦黑質(zhì)組織 HE 染色，可看到神經(jīng)元細(xì)胞皺縮、數(shù)量減少、核濃縮、部分膠質(zhì)細(xì)胞增生。因此，筆者認(rèn)為連續(xù)7 d腹腔注射MPTP會(huì)對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元造成慢性不可逆損傷。TH是多巴胺合成過程中重要的限速酶，有研究[16-17]表明，PD患者黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中TH蛋白表達(dá)減少，其(hTH1～hTH4) mRNA的表達(dá)也明顯減少。本研究結(jié)果也印證了這一點(diǎn)，在MPTP誘導(dǎo)的PD模型大鼠其TH神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，因此TH 陽性神經(jīng)元的含量可能與 PD 病情呈正相關(guān)。

目前PD只能通過病史、臨床癥狀進(jìn)行診斷，Doty等[18]發(fā)現(xiàn)，由于嗅覺功能障礙是特發(fā)性PD的首發(fā)癥狀之一，因此嗅覺測試也可以作為早期這種疾病的診斷。華鍵等[19]對PD患者進(jìn)行血生化指標(biāo)的評(píng)估發(fā)現(xiàn)，PD患者的尿酸、總膽紅素、低密度脂蛋白膽固醇均有所下降與PD的發(fā)生呈獨(dú)立相關(guān)。本研究中，MPTP模型組大鼠尿酸含量與總膽固醇含量與對照組相比雖有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。模型組直接膽紅素含量相對于對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。有研究[20]表明，PD患者會(huì)出現(xiàn)肝腎陰虛的非運(yùn)動(dòng)癥狀，因此直接膽紅素降低可能與PD對肝臟的損傷有一定關(guān)系。Barcia等[21]研究發(fā)現(xiàn)，PD的改變與炎癥有關(guān)。PD患者黑質(zhì)部的活化小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)，損傷多巴胺能神經(jīng)元，促炎細(xì)胞因子進(jìn)而在紋狀體內(nèi)表達(dá)，從而誘發(fā)PD。在本研究試驗(yàn)中MPTP模型組大鼠白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，且從HE染色病理切片結(jié)果看出確有部分膠質(zhì)細(xì)胞增生出現(xiàn)，推測應(yīng)與PD的炎癥反應(yīng)有一定關(guān)系。綜上所述，腹腔注射MPTP可使大鼠出現(xiàn)PD運(yùn)動(dòng)障礙，行為學(xué)試驗(yàn)證實(shí)了模型復(fù)制成功，血液學(xué)及病理學(xué)診斷結(jié)果也為判定早期PD提供了理論基礎(chǔ)。