痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中IL-1β/Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的作用研究*

石 嬌，吳東明，李 靜，許 穎

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科(成都610500)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于體內(nèi)尿酸代謝異常引起的高尿酸癥，過(guò)多的尿酸鈉(monosodium urate, MSU)晶體沉積于關(guān)節(jié)腔、滑膜、軟骨等關(guān)節(jié)組織而導(dǎo)致炎性病變[1]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，生活方式和飲食習(xí)慣發(fā)生變化，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和患病率在全球范圍內(nèi)快速增長(zhǎng)且有年輕化趨勢(shì)，目前我國(guó)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的患病率約為1%～3%[2-3]。

近幾年研究[4]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡在心血管、內(nèi)分泌、感染性等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中均有參與。細(xì)胞焦亡是一種有別于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的炎癥性程序性死亡模式，細(xì)胞焦亡過(guò)程中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerizatiin domain, NOD)樣受體(NOD-like receptor, NLR)炎性小體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)等蛋白質(zhì)和復(fù)合物發(fā)揮著重要作用[5]。目前，細(xì)胞焦亡是否參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)研究，因此本研究擬通過(guò)檢測(cè)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清中白細(xì)胞介素1β(Interleuin-1beta, IL-1β)和PBMCs(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中IL-1β及caspase-1的表達(dá)水平，探討細(xì)胞焦亡與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為疾病的診斷、治療及防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年8月至2019年3月于成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診就診的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者40例，正常對(duì)照組選取體檢中心實(shí)驗(yàn)指標(biāo)正常的健康體檢人群40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者均符合1977年美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)(American college of rheumatology, ACR)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的分類標(biāo)準(zhǔn)；發(fā)病后未服用糖皮質(zhì)激素、秋水仙堿等藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心腦血管疾病、腎臟系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、感染性及自身免疫相關(guān)疾病。40例急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者(acute gout, AG)和健康對(duì)照者(healthy controls, HC)分別為AG組、HC組。

1.2 材料

IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司；樣本密度分離液購(gòu)自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自江蘇長(zhǎng)星醫(yī)療科技有限公司；MD-AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美德太平洋(天津)生物科技股份有限公司；IL-1β抗體、caspase-1購(gòu)自Abcom公司；生化試劑購(gòu)自邁克生物有限公司；其余試劑、耗材購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 標(biāo)本采集及處理

分別采集AG組和HC組肝素抗凝全血5 mL，用樣本密度分離液分離全血中的PBMCs，將分離得到的PBMCs中加入MD-AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)基300 μL吹打混勻后備用。采用全自動(dòng)血球分析儀(希森美康XS-500i)進(jìn)行 PBMCs的純度驗(yàn)證。采用免疫印跡法檢測(cè)PBMCs中IL-1β、caspase-1的蛋白水平：對(duì)收集備用的PBMCs于4 ℃下以12 000 r/min離 心10 min后，通過(guò)調(diào)整蛋白濃度至6 mg/L后進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)，記錄并進(jìn)行灰度值分析，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)灰度值比較，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

同時(shí)分別采集AG組和HC組靜脈血4 mL，3 500 r/min離心5 min后，分離血清備用。采用全自動(dòng)生化分析儀(日立式7600型)檢測(cè)血清中尿酸(uric acid, UA)、肌酐(creatinine, CREA)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alaninetransaminase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase, AST)、總蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)、前白蛋白(prealbumin, PA)的含量。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中IL-1β表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PBMCs的驗(yàn)證結(jié)果

PBMCs是外周血單個(gè)核細(xì)胞，其包括淋巴細(xì)胞(lymphocyte, LYMP)和單核細(xì)胞(monocyte, MONO)。AG組和HC組全血分離的細(xì)胞主要為PBMCs，純度達(dá)(94.91±2.40)%(表1、圖1)。

表1 AG組與HC組 PBMCs驗(yàn)證結(jié)果

2.2 兩組PBMCs中IL-1β和caspase-1的免疫印跡法分析結(jié)果

兩組PBMCs中IL-1β和caspase-1的免疫印跡法分析結(jié)果提示，AG組較HC組IL-1β和caspase-1表達(dá)水平增強(qiáng)(圖2)。

2.3 兩組UA、CREA、BUN、PA、ALT、AST、TP、ALB的檢測(cè)結(jié)果

AG組與HC組年齡、TP和ALB差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AST、ALT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，UA、CREA、BUN、PA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

表2 AG組與HC 組一般臨床資料

2.4 AG組與HC組血清中IL-1β檢測(cè)結(jié)果

GA組的IL-1β的表達(dá)比HC組明顯升高，GA組IL-1β表達(dá)量為(1.08±0.79) μg/L，HC組IL-1β表達(dá)量為(0.30±0.08)μg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.036,P<0.001)(圖3)。

2.5 AG組UA、BUN、CREA與IL-1β相關(guān)性比較

血清UA與IL-1β呈正相關(guān)性(r=0.501,P=0.004)，血清BUN、CREA與IL-1β無(wú)相關(guān)性(圖4)。

3 討論

近年來(lái)，由于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎對(duì)組織器官的嚴(yán)重?fù)p害以及多樣化的并發(fā)癥使其成為困擾人類健康的一大難題。目前痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查[3]。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)主要有血清中尿酸含量檢測(cè)和關(guān)節(jié)炎發(fā)作時(shí)關(guān)節(jié)液微生物培養(yǎng)情況，但關(guān)節(jié)液的采集比較困難且微生物培養(yǎng)周期用時(shí)長(zhǎng)，不利于作為常規(guī)檢查開展，因此需尋找更多有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的早期診斷及鑒別診斷，以及為監(jiān)測(cè)患者治療期間的變化提供有效的幫助。在本研究中，除UA在AG組較HC組升高，還可見BUN、CREA、PA、ALT、AST等指標(biāo)呈增加趨勢(shì)，這是因?yàn)樵谕达L(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)展過(guò)程中，體內(nèi)尿酸的生成增多，而腎臟排泄減少，加重體內(nèi)腎臟和肝臟代謝負(fù)擔(dān)，從而出現(xiàn)肝功能和腎功能的指標(biāo)異常變化。血清中BUN、CREA、PA、ALT、AST的含量變化可用作評(píng)估急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的伴隨癥狀。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理生理不僅與高尿酸血癥有關(guān)，還涉及炎癥小體的激活。炎癥反應(yīng)是參與介導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)重要過(guò)程，本研究中可見，血清中IL-1β在AG組的表達(dá)較HC組有明顯升高，Ma等[5-6]也證實(shí)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)與炎性因子IL-1β的表達(dá)增加有關(guān)。IL-1β屬于IL-1的分泌型，是血液循環(huán)中主要存在的形式，也是MSU晶體誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，IL-1β參與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥的發(fā)生發(fā)展，可作為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作指標(biāo)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PBMCs中IL-1β和caspase-1蛋白水平的表達(dá)，AG組IL-1β和caspase-1蛋白水平明顯高于HC組。caspase-1蛋白水平的表達(dá)增加與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLR family, Pyrin domain containing 3, NLRP3)炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路有關(guān)[7-9]。細(xì)胞焦亡經(jīng)典激活途徑主要表現(xiàn)為caspase-1的活化，NLRP3炎癥小體激活，導(dǎo)致炎性因子的釋放,從而誘發(fā)級(jí)聯(lián)放大的炎性反應(yīng)，對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程是由于關(guān)節(jié)腔內(nèi)尿酸鹽濃度急劇增加，導(dǎo)致MSU晶體的不斷形成，MSU晶體作為內(nèi)源性損傷相關(guān)因子激活NLRP3炎癥小體組裝，活化的NLRP3炎性小體剪切caspase-1前體形成成熟的caspase-1，caspase-1繼而切割I(lǐng)L-1β前體，促進(jìn)IL-1β的成熟及分泌，最終導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)[12]。房樹標(biāo)等[12]研究采用IL-1β的抑制劑后發(fā)現(xiàn)，caspase-1表達(dá)減少，NLRP3炎性小體的信號(hào)通路降低，進(jìn)一步證實(shí)了IL-1β的產(chǎn)生與caspase-1介導(dǎo)的NLRP3信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，IL-1β和caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。但caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡過(guò)程中除有IL-1β釋放，還有白細(xì)胞介素18(Interleuin-18, IL-18)等炎性因子釋放，后續(xù)的研究中將繼續(xù)檢測(cè)更多的焦亡指標(biāo)，進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞焦亡在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的作用。