Ficoll分離法富集臍帶血自然殺傷細胞的實驗條件分析*

曹 倩，冉鳳萍，孫 海，蒙 露，陳 巧，段 曦，鄭武燕，劉佳慧，李 華，鄒 強△

1.成都醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院(成都 610500)； 2.成都醫(yī)學院 科研實驗中心(成都 610500)； 3.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 產(chǎn)科(成都 610500)；4.西安海棠職業(yè)學院(西安 710038)； 5.成都中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院(成都 610075)； 6.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 腫瘤科(成都 610083)

自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)不受主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)限制，能直接殺傷腫瘤細胞，具有高效快速的抗腫瘤作用，因此已成為腫瘤免疫細胞治療研發(fā)中一種重要的細胞藥物?；诋愺wNK治療各類血液腫瘤和實體瘤的臨床試驗正在展開，已有結(jié)果[1-4]表明，NK具有一定的抗腫瘤臨床療效。而且在異體NK移植給人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)Ⅰ類殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)配體缺失受者的HLA半相合造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)試驗中還發(fā)現(xiàn)，同種反應性NK不僅具有抗白血病細胞效應，而且對移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)具有保護作用，臨床上可減少復發(fā)，延長急性髓細胞性白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者生存時間[5-6]。特別是將嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)分子表達于NK上的CAR-NK抗腫瘤研究[7-11]被認為有望突破CAR-T治療實體瘤的瓶頸，僅在美國clinicaltrials網(wǎng)站(https://clinicaltrials.gov)注冊的CAR-NK臨床試驗就已有10項。

NK可通過NK株、骨髓造血干細胞、外周血和臍血中分離獲得。鑒于NK株的潛在致瘤性[12]、EB病毒易感性[13]以及骨髓來源NK的體外擴增培養(yǎng)技術(shù)難度[14-15]，使得目前臨床試驗多采用外周血作為NK來源。但研究[16-21]表明，臍帶血(umbilical cord blood，UCB)似乎是更理想的NK采集源：1)UCB中NK比例(30%)遠高于外周血(10%)；2)CD56brightNK比例更高；3)含有更多的祖細胞；4)表達更高水平的骨髓歸巢受體CXCR4，骨髓歸巢潛能更強；5)IL-15活化的UCB NK具有更強遷移和克隆形成能力；6)更強的殺傷腫瘤細胞能力。近年來已有越來越多的UCB NK用于臨床研究[11]。

從全血中采集NK一般采用Ficoll常規(guī)分離法。然而，UCB是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后，殘留在胎盤和臍帶中的血液，與外周血相比，因其取血量及保存條件等不可控實驗因素較多，如何從UCB中高效采集理想的NK是UCB NK臨床應用的先要問題。本研究對實際工作中常見實驗條件進行逐一探討，觀察不同實驗條件變化下，F(xiàn)icoll法富集NK的效果是否具有明顯差異，摸索最佳UCB處理條件，為UCB NK臨床應用提供技術(shù)保障。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

22～35歲健康足月正常分娩產(chǎn)婦的UCB由四川省成都市新都區(qū)成都醫(yī)學院附屬醫(yī)院產(chǎn)科提供，孕婦和家屬簽署知情同意書。UCB納入標準：1)產(chǎn)婦年齡22～35周歲；2)妊娠37～42周；3)產(chǎn)婦營養(yǎng)正常；4)無HIV、HBV、梅毒等傳染性疾??；5)無惡性腫瘤及遺傳性疾?。?)無乙型、甲型肝炎；7)無妊娠并發(fā)癥。UCB排除標準： 1)產(chǎn)婦年齡<22周歲及>35周歲；2)產(chǎn)婦營養(yǎng)不足、胎兒發(fā)育異常；3)產(chǎn)婦有傳染性疾病及嚴重遺傳性疾病。

1.2 主要材料

淋巴細胞分離液Lymphoprep TM[密度：(1.077±0.002)kg/L]購自挪威Axis-shield公司；復方泛影葡胺(密度：1.412 kg/L)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；RPM1640購自美國Hyclone公司；熒光標記的鼠抗人CD56-PE、CD3-BV711、7-AAD購于BioLegend公司；一次性塑料采血袋購自四川南格爾醫(yī)學生物有限公司。

1.3 儀器

低速離心機JW-1024購自安徽嘉文公司;流式細胞儀Novosampler Q購自比利時ACEA公司;生物安全柜購自美國Thermo公司。

1.4 方法

1.4.1 UCB保存與NK富集 含預留抗凝劑的一次性200 mL采血袋無菌采集的同1份新鮮UCB分成3組，分別存放于冷藏(4 ℃)、室溫(25 ℃)和孵育溫度(37 ℃)。考慮到實際UCB分離操作距臨床UCB采集時間多為以下4種情況：臨床UCB無菌采集后立即分離處理，約為3 h；或產(chǎn)婦生產(chǎn)結(jié)束后再回實驗室分離處理，約為7 h；或UCB保存過夜，次日早上分離，約為19 h；或次日下午分離UCB，約為26 h，因此摸索的保存時間定為3、7、19、26 h。采用常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離，操作步驟按照Axis-shield密度梯度分離液說明書進行。

1.4.2 UCB復溫 將4 ℃保存的同1份UCB分為復溫37 ℃組和4 ℃對照組，分別于0、1、2、3、4 h按常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離單核細胞。

1.4.3 不同密度淋巴細胞分離液富集NK 常規(guī)Ficoll淋巴分離液產(chǎn)品密度為1.077 kg/L，按比例加入不同體積的復方泛影葡胺(密度1.412 kg/L)配置不同密度的淋巴細胞混合分離液。混合液密度=(復方泛影葡胺密度×體積+Ficoll淋巴分離液密度×體積)/(復方泛影葡胺體積+Ficoll淋巴分離液體積)。將同1份UCB分別采用不同密度淋巴細胞分離液進行梯度離心分離單核細胞，檢測富集的NK(表1)。

表1 不同密度淋巴細胞分離液10 mL體系的配制

1.4.4 NK存活率檢測 鼠抗人CD56-PE、鼠抗人CD3-BV711和7-AAD各0.5 μL與8.5 μL 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)混合，配制10 μL熒光標記物混合液，加入20 μL待測單細胞懸液中混勻，室溫避光染色15 min，流式細胞儀檢測[22]。CD3-CD56+細胞為NK，7-AAD+細胞為死細胞，7-AAD-細胞為活細胞。流式檢測CD3-CD56+7-AAD-細胞，計數(shù)，即為NK活細胞。存活率=檢測時刻的NK活細胞數(shù)/新鮮采集UCB(0 h)的NK活細胞數(shù)×100%。

1.4.5 NK回收率檢測 流式細胞儀檢測Ficoll分離法富集前后的UCB NK絕對數(shù)，計算回收率。計算公式:NK回收率=(富集后NK密度×富集后體積/未富集UCB中的NK密度×未富集UCB體積)×100%。

1.4.6 粒細胞殘留比例檢測 根據(jù)粒細胞大小在流式前向角散射(forward scatter,FSC)和側(cè)向角散射(side scatter, SSC)散點圖中的分布特點，設門，粒細胞計數(shù)，計算粒細胞殘留比例。粒細胞殘留比例=粒細胞數(shù)量/總細胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 復溫對UCB NK富集的影響

UCB 4 ℃冷藏保存19、26 h后，分別復溫至37 ℃，1 h，再進行Ficoll法分離單核細胞。流式檢測富集后細胞懸液中UCB NK回收率：4 ℃保存19 h UCB的復溫組(97.5±2.3)%高于未復溫組(85±3.5)%；保存26 h UCB的復溫組(98.8±2.7)%高于未復溫組(72.2±3.3)%。粒細胞殘留率在19 h和26 h的復溫組與未復溫組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果提示：復溫37 ℃、1 h能夠明顯提高4 ℃冷藏保存的UCB NK回收率，且不會增加粒細胞殘留比例(圖1)。

注：A：復溫時間對NK回收率的影響；B：復溫時間對富集后細胞懸液中粒細胞殘留的影響；C：復溫對富集后細胞懸液中殘留粒細胞比例的影響；與復溫組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 不同UCB保存溫度對NK存活及富集的影響

檢測不同時刻、不同保存溫度下NK存活率，結(jié)果顯示：NK活細胞數(shù)量在4 ℃條件下，可持續(xù)保存26 h無明顯變化；25、37 ℃保存至7 h無明顯變化，但隨后NK活細胞數(shù)隨時間延長而減少，26 h時，25、37 ℃的NK存活率分別減少至3 h的(59.0±4.3)%和(42.5±3.7)%，說明對NK活性無影響的較好長時間保存溫度是4 ℃。檢測不同時刻、不同保存溫度下，F(xiàn)icoll法分離的單個核細胞懸液中NK回收率，結(jié)果顯示：4 ℃保存條件下，3、7 h的NK回收率為100%，但19、26 h的回收率呈下降趨勢，26 h的回收率下降至(72.2±3.3)%，說明4 ℃的長時間保存溫度對獲得理想NK回收率不利。25 ℃和37 ℃保存條件下，3、7、19、26 h的NK回收率無明顯變化，接近100%，說明25 ℃和37 ℃溫度保存對NK富集無影響。但UCB超過7 h保存，無論哪種保存溫度，其Ficoll分離法富集后的細胞懸液中粒細胞殘留比例隨著保存時間延長而逐漸增加。因此，綜合NK存活率、回收率，UCB只要在7 h以內(nèi)Ficoll分離，這3種保存溫度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。

注：A：不同保存溫度對臍血NK細胞存活率的影響；B：不同保存溫度對NK回收率的影響；C:不同保存溫度對Ficoll法分離后的粒細胞殘留率影響；D：流式檢測Ficoll法分離后粒細胞殘留比例

2.3 復溫時間的優(yōu)化

為進一步探究4 ℃冷藏的UCB復溫至37 ℃多長時間更有利于NK富集，分別檢測了37 ℃復溫0、1、2、3、4 h NK存活率以及常規(guī)Ficoll法富集NK回收率和粒細胞殘留比例情況，結(jié)果顯示：37 ℃復溫0～4 h各組的UCB NK活細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明37 ℃復溫4 h操作對UCB中NK活性不影響。復溫1 h可將NK細胞回收率由0 h的(65.0±3.5)%提高到(96.0±4.1)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。但2、3、4 h回收率與1 h回收率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明37 ℃復溫1 h已達回收率最高限。各時刻富集的細胞懸液中粒細胞殘留比例隨著復溫時間延長而增加，4 h可達38.15%。結(jié)果表明：對4 ℃保存的UCB放置37 ℃的最佳復溫時長為1 h(圖3)。

注：A：復溫時間對NK細胞存活率的影響；B：復溫時間對NK細胞回收率的影響；C：復溫時間對Ficoll分離法所獲得的細胞懸液中粒細胞殘留比例的影響；D：流式檢測不同復溫時間分離的單個核細胞懸液中粒細胞殘留比例；與復溫0 h比較，***P<0.001

2.4 Ficoll密度對4 ℃保存的UCB NK富集的影響

為探討提高分離液密度是否有助于低溫保存UCB的NK富集，檢測了不同密度分離液分離4 ℃保存19、26 h UCB的富集效果，結(jié)果顯示：19 h和26 h的兩組UCB NK回收率均隨分離液密度升高而提高，但分離后細胞懸液中的粒細胞殘留量也隨分離液密度升高而有所增加。結(jié)果表明：提高分離液密度可提高低溫保存UCB NK回收率，但粒細胞殘留比例也隨之增加(圖4)。

注：A：不同密度分離液分離UCB獲得的NK回收率；B：不同密度分離液分離UCB后粒細胞殘留比例；C：流式檢測不同密度分離液分離UCB后粒細胞比例

2.5 抗凝劑含量對UCB NK存活及富集的影響

臨床常規(guī)使用一次性無菌采血袋規(guī)格為200 mL，內(nèi)含預留抗凝劑28 mL，因此，抗凝劑/UCB為0.14。而UCB臨床實際采集量通常為50～100 mL，抗凝劑與血量比例往往高于0.14理想比例。為探究高比例抗凝劑是否對NK活性及富集的影響，本實驗將同1份UCB分別與不同體積的抗凝劑混合，以抗凝劑/UCB為0.14記1×，抗凝劑/UCB為0.65記4×，分別將此兩組UCB于4 ℃保存26 h。結(jié)果顯示：1×組NK存活率與4×組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，1×組NK回收率高于4×組(P<0.05)。兩組的粒細胞殘留在分選前分別為(64.7±5.3 )%和(67.1±4.7) %，分選后為(29.7±3.3 )%和(25.1±4.5) %，分選前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果表明：抗凝劑比例變大雖然不影響NK存活率，但會降低Ficoll分離的NK回收率，對粒細胞清除效果無影響(圖5)。

注：A：抗凝劑比例對細胞存活率影響；B：抗凝劑比例對細胞回收率影響；C：抗凝劑比例對NK分離過程粒細胞去除效果的影響；D：抗凝劑比例對NK分離過程粒細胞去除效果影響的流式結(jié)果；與1×組比較，*P<0.05；與分選前比較，**P<0.001

3 討論

UCB NK因其具有腫瘤殺傷能力強、免疫源性低、體外擴增速度快等優(yōu)點,被廣泛用于腫瘤細胞治療研究。無論從臨床新鮮采集UCB進行研究，還是UCB庫的建立，都面臨如何從UCB中有效富集更多NK活細胞這一技術(shù)問題。Ficoll密度梯度離心分離法是分離全血單個核細胞的常規(guī)方法。Ficoll液去除紅細胞和粒細胞，達到富集淋巴細胞目的。與外周血采集不同，UCB采集時間、采集量、處理時間等諸多實驗因素不可控，這些波動因素對NK富集的影響未知，因此分析實際工作中遇到的這些波動因素對Ficoll富集NK的影響以及探索優(yōu)化方案顯得尤為重要。本研究著重探究了保存溫度、保存時間、分離液密度以及抗凝劑比例對NK存活與Ficoll分離的影響，并探索了解決問題的優(yōu)化方案。

臨床采集的UCB可選擇冷藏(4 ℃)、室溫保存(25 ℃)或者接近體溫的37 ℃保存。同時根據(jù)實際工作流程的時間安排方面，UCB分離距采集時間多為3、7、19、26 h，因此同時也摸索了這4個保存時間對UCB分離的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，冷藏會降低NK的Ficoll分離回收率，而室溫和37 ℃保存的樣品能更好確保NK回收率。但是，冷藏能夠更好保持NK細胞活力，即使保存26 h，UCB中存活的NK活細胞數(shù)未見明顯減少；而在室溫25 ℃和37 ℃保存條件下，UCB保存7 h后其NK活細胞數(shù)開始逐漸減少，保存26 h后活細胞數(shù)減少至保存前50%。因此，如何提高4 ℃保存UCB的NK回收率尤為重要。在分離前，將4 ℃保存的UCB復溫至37 ℃，能夠有效增加NK回收率?？s短復溫時間的處理不僅可提高回收率，而且能確保低比例粒細胞的殘留。此外，溫度可能導致分離體系密度的變化，也可以通過提高Ficoll密度得到矯正，向標準密度1.077 kg/L的Ficoll液中添加泛影葡胺以提高分離液密度，可有效提高NK回收率。

此外，由于通常臨床采用200 mL規(guī)格含抗凝劑的血袋采集UCB，但臨床采集UCB血量隨采集方法、醫(yī)生采血習慣及產(chǎn)婦差異而不同，統(tǒng)計數(shù)據(jù)[12]顯示，臨床平均采血量為75 mL。因此，200 mL規(guī)格血袋采集的UCB往往含過量抗凝劑。為探索高比例抗凝劑是否影響NK存活與富集，對比了4倍比例與正常比例的兩組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示：高于正常4倍的抗凝劑含量雖不影響NK存活，但會明顯降低Ficoll法富集NK的回收率。提示，在實際工作中，在較少采血量的情況下，應注意選擇小規(guī)格采血袋或適當減小采血袋中預留的抗凝劑量，才能有效提高后續(xù)Ficoll法富集NK的回收率。

源于臨床的UCB樣品存在諸多變量，其中就包括UCB保存條件、保存時間以及抗凝劑與UCB體積比例等，探究這些變量對UCB NK獲取的影響，有利于實際工作中獲得理想的NK回收率，為后續(xù)研究及應用提供足夠研究材料。