基于蛋白質(zhì)組學對螺旋藻砷脅迫響應機制的研究

孟麗娜 彭春瑩 李鐵棟 李博生，2

（1. 北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京 100083；2. 北京林業(yè)大學螺旋藻研究所，北京 100083）

螺旋藻（Spirulina）是一種光合自養(yǎng)原核浮游植物［1］，能夠產(chǎn)業(yè)化的藻種營養(yǎng)豐富，蛋白含量高達60%-70%［2］，還含有其他多種活性物質(zhì)，用途十分廣泛，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦為“21 世紀最佳食品”［3］。當養(yǎng)殖條件適宜，螺旋藻生長十分迅速，產(chǎn)量高。然而，螺旋藻粉質(zhì)量要求嚴格，其中重金屬含量是質(zhì)量檢測的重要方面，藻粉砷含量是其中指標之一。螺旋藻細胞本身具有吸收和積累重金屬的特性［4-5］，易在養(yǎng)殖過程中造成砷積累，造成藻粉砷含量升高或超標，導致藻粉質(zhì)量下降。王志忠等［6］研究表明藻粉中砷含量與養(yǎng)殖用水砷含量呈正相關(guān)；Guo 等［7］和Uppal 等［8］及王淑［9］研究表明砷在螺旋藻細胞內(nèi)主要通過砷的吸收、還原或氧化和甲基化過程進行砷解毒；盡管穆文靜［10］和烏達巴拉［11］研究了砷（AsⅢ）脅迫下螺旋藻光合色素、藻藍蛋白、抗氧化酶活性的變化，表明砷對螺旋藻物質(zhì)代謝有影響，但迄今為止，在生理指標變化研究的基礎(chǔ)上，關(guān)于砷對螺旋藻分子水平的影響并未見報道。因此，本研究對螺旋藻砷脅迫的蛋白組學水平展開研究，以在蛋白組水平上探索螺旋藻細胞對砷脅迫的應對機制，為在螺旋藻養(yǎng)殖過程中調(diào)控砷吸收和積累提供理論依據(jù)和實際應用指導。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用藻種為北京林業(yè)大學螺旋藻研究所提供的鈍頂螺旋藻（Spirulinaplatensissp.）。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻培養(yǎng)條件 采用Zarrouk 培養(yǎng)基于28℃，光照強度60 μmol· m-2·s-1，搖床100 r/min培養(yǎng)，光照周期12 h∶12 h。

1.2.2 螺旋藻砷離子脅迫培養(yǎng) 將處于對數(shù)生長期的藻種分別接種于不同濃度（0 ppm、1 ppm和2 ppm）的100 mL 含砷培養(yǎng)液中，于28℃，光照60 μmol· m-2·s-1，光暗比12 h∶12 h，搖床100 r/min下培養(yǎng)。

1.2.3 光合放氧測定 取經(jīng)過砷離子脅迫10 min 后的藻液，控制測定溫度31℃，光強60 μmol· m-2·s-1，使用Chlorolab-2 液相氧電極（Hansatech Ltd.，UK）測定各組藻液的光合放氧速率，每個樣品重復測定3 次。

1.2.4 紫外-可見吸收光譜全波段掃描 收集24 h培養(yǎng)后的藻泥，蒸餾水沖洗至pH 值7 左右，凍干。取0.04g凍干藻粉于試管中，加入5 mL PBS 磷酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 值7.0），攪勻，溶脹4h后超聲震蕩10 min（冰水?。?，離心（6 000 r/min，4℃，15 min），收集離心上清液定容至10 mL，用紫外-可見分光光度計進行200-800 nm 全波長掃描。每個樣品重復測定3 次。

1.2.5 SDS-PAGE 電泳 取培養(yǎng)7d后經(jīng)過凍干的螺旋藻樣品，在液氮中磨碎，加入25 mL 10%的三氯乙酸丙酮溶液和65 mmol/L DTT，-20℃沉淀1 h，10 000 r/min 離心45 min，取沉淀。向沉淀中加入25 mL 無水丙酮溶液，再次靜止沉淀、離心。離心沉淀干燥后在-80℃下保存。取干燥蛋白樣品40 μg，以上樣比例5∶1（V/V）加入6×上樣緩沖液，沸水浴反應5 min，14 000 r/min 離心10 min，取上清液進行12.5% 的SDS-PAGE 電泳。電泳條件為：恒流：14 mA，電泳時間90 min。使用考馬斯亮藍來染色，每個樣品進行3 次，以獲得穩(wěn)定的差異蛋白圖譜。

1.2.6 質(zhì)譜樣品的制備 將存在顯著差異的蛋白質(zhì)條帶從整張凝膠圖譜中取出，放入裝有1 mL 水的離心管內(nèi)，清洗10 min，除去水后重復此操作一次。向樣品中加入1 mL 酶內(nèi)消化脫色液（50%乙腈，25 mmol/L 碳酸氫銨）清洗10 min，除去脫色液，重復此操作一次。向離心管中加入乙腈至樣品完全變白，真空抽去乙腈后加入10 mmol/L DTT，56℃水浴鍋內(nèi)孵育1 h。移除DTT 后加入55 mmol/L IAM，室溫下于暗室孵育45 min。移除IAM 后加入25 mmol/L碳酸氫銨清洗10 min，除去碳酸氫銨加入脫色液清洗10 min，重復清洗一次。加入乙腈脫水至樣品完全變白，真空抽去乙腈。用25 mmol/L 碳酸氫銨將1 μg/L 的酶儲液稀釋15 倍后加入樣品中，使樣品充分吸收，繼續(xù)加入25 mmol/L 碳酸氫銨沒過樣品，37℃水浴過夜。過夜后向樣品中加入終濃度為0.1%的TFA 終止消化。取10 μL 樣品上質(zhì)譜儀檢測。

1.2.7 質(zhì)譜分析 使用的液相系統(tǒng)為ultimate3000 納升液相，流動相分別為A：0.1% FA 水溶液和B：0.1% FA 乙腈。樣品在2 μL/min 流速下通100% A相完成上樣，在ChromXP C18 預柱上（360 μm×0.5 mm，3 μm，C18-CL，120 A）富集，之后在0.4 μL/min 的流速下，通過一個65 min 的梯度在AcclaimTMPepMapTM100 C18 液相色譜柱（75 μm×2 cm，3 μm-C18）上分離。使用的梯度為：0-40 min，B 相由0線性升至30%；40-48 min，B 相由30%線性升至100%；48-65 minB相保持為100%。經(jīng)過液相分離后的肽段進入Q Exactive 質(zhì)譜儀檢測。

1.2.8 數(shù)據(jù)庫檢索 使用MASCOT 引擎（2.2 版本）建立了螺旋藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合UniProt（Release-201707）微藻蛋白庫進行綜合比對。質(zhì)譜定量到的蛋白質(zhì)以3 次對的生物學重復和3 次技術(shù)重復結(jié)果的平均值作為基礎(chǔ)，以Ratio＞1.2 且Pvalue＜0.05 作為標準篩選差異蛋白，查庫搜索MS/MS質(zhì)譜檢測肽段。

1.2.9 生物信息學分析 利用Blast2GO（Version 2.7.2）鑒定所獲得的差異蛋白，對定量到蛋白的比對序列行使代謝途徑追蹤功能，分別提取與其所有關(guān)聯(lián)的GO 功能條目。用GO 注釋進行蛋白質(zhì)的功能分析，根據(jù)其生物學過程、分子功能對蛋白質(zhì)進行分類，并對差異蛋白進行KEGG 通路注釋。

2 結(jié)果

2.1 砷離子對螺旋藻光合放氧速率的影響

由圖1 可以看出，螺旋藻受到外液1 ppm 砷離子脅迫時，與對照相比光合放氧速率就出現(xiàn)明顯降低，光合放氧速率下降了21.2%；當其砷離子濃度增加為2 ppm 時，光合放氧速率下降了27.7%，但兩者濃度之間差異并不大。

圖1 砷離子濃度對藻細胞光合放氧速率的影響

2.2 砷離子對螺旋藻細胞主要物質(zhì)的影響

由紫外-可見吸收光譜（圖2）可以看出，處理組與對照組特征峰趨勢一致，但砷處理組特征峰明顯低于對照。在200-800 nm 紫外-可見光范圍共有3 個吸收光譜帶200-400 nm，400-500 nm 和600-800 nm。在200-400 nm 的特征吸收峰位于254 nm；400-500 nm 紫外-可見光范圍有3 個吸收峰，吸收峰波長分別是440 nm、490 nm 和500 nm；600-800 nm 紫外-可見光范圍內(nèi)分別出現(xiàn)620 nm、680 nm 吸收峰。

2.3 砷脅迫螺旋藻蛋白質(zhì)的SDS-PAGE

圖2 砷離子脅迫下螺旋藻提取液紫外-可見吸收光譜圖

由凝膠電泳（圖3）可以看出，與對照樣品相比，經(jīng)過2 ppm 砷離子處理后的樣品蛋白質(zhì)分子段在30 kD-55 kD 和70 kD-90 kD 范圍內(nèi)存在極顯著的差異，蛋白條帶顏色較深且密集。可見砷離子濃度增加到2 ppm，蛋白條帶變化更為顯著，且主要差異蛋白集中在上述兩個分子量范圍內(nèi)。因此，選擇2 ppm 砷脅迫差異蛋白條帶進行后續(xù)分析。

圖3 不同濃度砷離子處理的螺旋藻蛋白電泳圖譜

2.4 差異表達蛋白的鑒定和功能分類

采用質(zhì)譜分析和Mascot 查庫對差異蛋白進行分析，以PFD ≤0.01 過濾篩選后去除反相數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，得到唯一肽段的數(shù)目為5 783，蛋白質(zhì)組數(shù)目為721，3 個通道皆有定量信息的蛋白質(zhì)組數(shù)是596個，其中上調(diào)蛋白為28 個，下調(diào)蛋白47 個（P＜0.05） （表1）。

GO 功能分析表明，這些差異蛋白參與的細胞組成主要有功能酶活性（47.6%），結(jié)合（38.1%）以及氧化還原酶活性（7.6%）（圖4）；生物過程主要包括生物合成過程（46.2%），代謝過程（23.1%），光合過程（7.7%）與運輸過程（7.7%）（圖5）。

圖4 差異性蛋白GO 功能注釋統(tǒng)計（分子功能）

圖5 白GO 功能注釋統(tǒng)計（生物過程）

KEGG 通路注釋分析表明，差異蛋白主要涉及光合作用、硝酸鹽代謝、氧化磷酸化、氨基酸的從頭代謝和氮代謝等信號/代謝通路。

根據(jù)GO 功能注釋結(jié)果，按參與生物代謝過程，這些差異蛋白主要可以分成5 大類：能量代謝（33.3%），蛋白質(zhì)合成與折疊（8%），活性氧清除與防御（8%），離子運輸和膜轉(zhuǎn)運（6%），以及氨基酸合成（17.4%）（表1）。

3 討論

3.1 砷離子對螺旋藻光合放氧及其細胞內(nèi)容物的影響

螺旋藻光合作用是決定其生長和產(chǎn)量的重要生理過程，砷離子濃度較低時（1 ppm-2 ppm），螺旋藻光合放氧速率就會受到顯著的抑制。砷含量小于1 ppm 是飼料級螺旋藻粉的國家標準。因此，控制砷離子濃度，對防止螺旋藻粉砷超標及其穩(wěn)產(chǎn)都具有重要意義。

砷離子在較低濃度時就影響了螺旋藻的光合作用進程，也一定會影響螺旋藻活性物質(zhì)的代謝。圖2 結(jié)果表明，砷離子明顯抑制了螺旋藻細胞的物質(zhì)積累。254 nm 為金屬硫蛋白的吸收峰［12］，金屬硫蛋白是細胞內(nèi)金屬結(jié)合蛋白的總稱，可以被包括砷在內(nèi)的許多離子和化合物誘導，使細胞對重金屬的毒害有一定的抗性［13-14］，金屬硫蛋白相對含量的下降表明砷離子抑制了其在螺旋藻細胞內(nèi)的積累且增加了其消耗。400-500 nm 一般為葉綠素與類胡蘿卜素吸收峰［15-18］。620 nm 與680 nm 分別為藻藍蛋白和別藻藍蛋白的特征吸收峰［19］。葉綠素和類胡蘿卜素通常與蛋白質(zhì)結(jié)合成色素蛋白，構(gòu)成螺旋藻的天線色素蛋白［20］，藻膽蛋白更是螺旋藻重要的捕光色素蛋白［21］。幾種捕光色素蛋白的降低，表明螺旋藻光合作用可能受到嚴重影響。穆文靜等［10］研究也表明砷離子（AsⅢ）會導致螺旋藻葉綠素、類胡蘿卜素以及藻膽蛋白含量的降低。光合速率降低，抗氧化作用啟動，一定引起藻生理作用的改變。

3.2 螺旋藻砷脅迫蛋白質(zhì)組學

3.2.1 能量代謝與光合作用相關(guān)蛋白 砷脅迫使ATP 合酶β 亞基（ATP synthase subunit beta）的數(shù)量下調(diào)，表明螺旋藻在砷脅迫下能量供應系統(tǒng)可能受到了影響。Pandey 等［22］發(fā)現(xiàn)在40 mmol/L As（Na2HAsO4·7H2O）處理下。魚腥藻中該酶數(shù)量也呈下調(diào)趨勢。同樣的結(jié)果也在杜氏鹽藻［23］中出現(xiàn)。光合系統(tǒng)對于不同金屬污染物的損傷十分敏感。在呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達的蛋白中也可以發(fā)現(xiàn)。藻細胞的光合作用受到了顯著的影響。與光合作用、氧化磷酸化以及電子傳遞相關(guān)的蛋白均呈現(xiàn)下調(diào)表達。鎂原卟啉IX 螯合酶（Mg-protoporphyrin IX chelatase）作為合成葉綠素的重要酶呈現(xiàn)出顯著的下調(diào)性表達，這種酶是參與卟啉和葉綠素代謝的最重要的酶之一［24-25］；光系統(tǒng)Ⅰ P700 葉綠素a 載脂蛋白A2（PhotosystemIP700 chlorophyllaapoprotein A2） 也呈現(xiàn)顯著性的下調(diào)表達，兩種葉綠素相關(guān)蛋白的下調(diào)標志著葉綠素合成減緩或分解加速［26］。葉綠素作為電子傳遞鏈中吸收光子并傳遞電子的組分［27］，其分解影響了電子傳遞，從而抑制光合作用。同時，作為電子傳遞鏈中最大最復雜的一種酶NAD（P）H-醌氧化還原酶亞基H（NAD（P）H-quinone oxidoreductase subunit H），其下調(diào)也會影響電子傳遞過程，導致氧原子積累、葉綠素降解，從而影響光合作用［28］。

表1 砷離子脅迫下螺旋藻細胞差異表達蛋白

表1 續(xù)表

絲氨酸/蘇氨酸激酶（Serine/Threonine protein kinase with FHA domain modulation）、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶（Succinyldiaminopimelate transaminase）等蛋白的降低，表明光合作用產(chǎn)生能量的過程受到影響時，螺旋藻細胞無法通過氧化磷酸化的過程進行能量補充。乙酰輔酶A 合成酶（AcetylcoenzymeAsynthetase）的下調(diào)直接影響了乙酰輔酶（Acetyl-CoA）的合成，乙酰輔酶的主要作用是將乙酰基傳遞給TCA，使其被氧化從而產(chǎn)生能量。碳酸脫水酶（Carbonate dehydratase，CA），又稱carbonic anhydrase［29］，能夠促進CO2在藻細胞中的固定［30］，對維持水溶CO2從質(zhì)膜到Rubisco 位點的穩(wěn)定流量，避免CO2從胞內(nèi)CO2庫向外流失起關(guān)鍵作用［31］。CA 數(shù)量的下調(diào)表明螺旋藻胞外固定CO2的能力已被抑制。另外，磷酸核酮糖激酶（Phosphoribulokinase，Prk）作為卡爾文循環(huán)最后一步的催化酶同樣被抑制，表明砷損害了螺旋藻對CO2的固定。Ge 等［23］發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻在11.2 mg/L As（Ⅴ）處理下，CA 與Prk均下調(diào)，其CO2固定過程也被抑制。

3.2.2 蛋白質(zhì)合成與折疊相關(guān)蛋白 由于光合作用的降低，導致ATP 和NADPH 無法正常合成，故而，依賴ATP 和NADPH 進行的跨膜運動、酶促反應和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形成受到了不同程度的影響。包括硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白鐵氧蛋白亞硝酸合酶（Ferredoxin-nitrite reductase）的降低，直接導致藻細胞對培養(yǎng)液中氮源吸收的降低，進而影響蛋白質(zhì)的合成［32-35］。同時，與氨基酸、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的下調(diào)，如苯丙氨酸t(yī)RNA 連接酶β 亞基（Phenylalanine-tRNA ligase beta subunit），也表明了蛋白質(zhì)合成過程的受阻。

ClpP 是一種高度保守的絲氨酸蛋白酶［36-37］，完整的Clp 蛋白酶復合物具有一個桶裝結(jié)構(gòu)，其中ClpX 是夾在其中的具有ATPase 活性的子單元［38］。這些ClpX 可用于識別、展開并將蛋白質(zhì)底物轉(zhuǎn)移到核心位置的功能［39］。在本研究中，ClpX 的降低大大影響了Clp 蛋白酶與底物結(jié)合的效率，導致蛋白質(zhì)合成受損。

砷會干擾蛋白質(zhì)的折疊，造成蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集［40］。雖然螺旋藻蛋白質(zhì)合成過程受阻，但在砷脅迫下，一些伴侶分子蛋白呈現(xiàn)上調(diào)。這說明藻細胞雖無法完全抵抗砷離子帶來的傷害，但其細胞內(nèi)部依然對砷離子的影響作出了明顯的響應，重點保護蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。33 kD 伴侶蛋白（33 kD chaperonin）主要涉及蛋白質(zhì)的折疊，此伴侶蛋白幫助組蛋白折疊形成核小體，它涉及了將折疊的子單元組裝成寡聚結(jié)構(gòu)［41-42］。并且這類蛋白的一個主要功能是放置新合成的多肽鏈和聚集的亞單位聚合成非功能區(qū)域［43］，同時為合成功能性區(qū)域保留必需的能量來源，這種伴侶蛋白的顯著上調(diào)在能量供給不足的情況下顯得尤為重要。延長因子T（Elongation factor T）主要行使分子伴侶蛋白功能，此蛋白上調(diào)可保護其他蛋白免于聚集和降解。Anabaenasp. PPC 7120 在砷處理后也出現(xiàn)了相同的結(jié)果［22］。核糖體結(jié)合分子伴侶（Trigger factor）能與新生多肽鏈結(jié)合，是幫助新合成蛋白折疊的主要伴侶蛋白［44］，此類蛋白的上調(diào)也是螺旋藻為保護蛋白結(jié)構(gòu)對砷脅迫作出的響應。

有3 個核糖體蛋白表達出現(xiàn)明顯的變化，其中兩個上調(diào)一個下調(diào)。然而，這些蛋白在砷代謝中的功能還需要進一步研究。

3.2.3 活性氧清除與防御相關(guān)蛋白 砷酸鹽會引發(fā)細胞過氧化，對DNA、脂質(zhì)以及蛋白等大分子物質(zhì)造成氧化損傷［45］。砷處理下螺旋藻細胞中與氧化應激相關(guān)的某些蛋白出現(xiàn)上調(diào)，包括谷胱甘肽合成酶（Glutathione synthetase，GSH），氧化還原酶結(jié)構(gòu)域蛋白（Oxidoreductase domain protein），醛酮還原酶（Aldo/keto reductase）。

目前已確定谷胱甘肽（GSH）是植物防御系統(tǒng)抵御各種脅迫的核心組成部分之一［46］，GSH 通過捕獲自由基和催化還原過氧化氫來保護細胞［47-48］。螺旋藻內(nèi)GSH 的上調(diào)表明其對細胞內(nèi)氧化損傷作出積極應答，此結(jié)果與杜氏鹽藻砷脅迫結(jié)果相同。當杜氏鹽藻暴露于砷溶液時，會誘導細胞內(nèi)的GSH 合成，在砷積累過程中作用顯著［49-50］。重金屬會引起細胞的強烈脂質(zhì)過氧化反應，產(chǎn)生多種醛類物質(zhì)。Aldo/keto reductase（醛酮還原酶）在生物體內(nèi)能將多種有毒醛還原為毒性較小或沒有毒性的相應醇類物質(zhì)，是有毒醛的一個重要的代謝和解毒途徑［51］。螺旋藻中醛酮還原酶的上調(diào)表達也是對砷引起的脂質(zhì)過氧化的應激反應，同樣的現(xiàn)象在水稻中也有出現(xiàn)，泰國香米水稻中的AKR 在活性醛解毒途徑也有著獨特的作用［52］。

乙醇脫氫酶（Alcohol desydrogenase，zinc binding，ADH）是一種含鋅酶，屬于脫氫酶/還原酶（Dehydrogenase/reductase，MDR）蛋白基因超家族的成員［53］，可將乙醛和乙醇相互轉(zhuǎn)換。螺旋藻細胞內(nèi)ADH 的上調(diào)可能會起到清除活性醛的作用，以此來對抗砷離子引起的的細胞過氧化。在梁燕等［54］研究也發(fā)現(xiàn)，水稻中的ADH 具有保護膜結(jié)構(gòu)功能的完整性，延長細胞壽命的功能。

3.2.4 磷酸鹽轉(zhuǎn)運與跨膜相關(guān)蛋白P和As 屬同族元素，由于兩者化學結(jié)構(gòu)相似，As（Ⅴ）可通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運通道被浮游植物吸收［9，55］。螺旋藻培養(yǎng)液中添加砷離子不可避免會影響磷代謝，磷信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)（Regulator）下調(diào)表明其跨膜運輸受到干擾，同時磷酸結(jié)合蛋白（Phosphate-binding protein）通過上調(diào)以結(jié)合補充磷。谷氨酰胺合成酶的上調(diào)很有可能是因為砷離子干擾磷代謝造成的。谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase）通過催化谷氨酸鹽與銨生成谷氨酰胺，此反應消耗一個ATP 的同時釋放焦磷酸鹽，后者可被降解為無機磷酸鹽，補充砷脅迫下減少攝入的磷。杜氏鹽藻在砷脅迫與鹽脅迫下均出現(xiàn)磷酸鹽吸收降低的現(xiàn)象，同時谷氨酰胺酶都呈現(xiàn)上調(diào)［23，30］，與砷處理下的螺旋藻表現(xiàn)出相同的結(jié)果。

4 結(jié)論

螺旋藻細胞對砷離子脅迫十分敏感，當外液砷離子濃度達到1 ppm 時，螺旋藻細胞就有明顯的響應；當外液砷離子濃度達到2 ppm 時，就對螺旋藻細胞光合放氧產(chǎn)生顯著的影響，并對螺旋藻光合色素相關(guān)蛋白產(chǎn)生抑制作用。砷離子在藻細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化觸發(fā)了螺旋藻的氧化應激反應，產(chǎn)生了一系列活性氧清除與防御過程，75 種差異蛋白指示了這些變化過程也涉及到能量代謝、蛋白質(zhì)合成與折疊、磷酸鹽轉(zhuǎn)運等途徑。因此，在實際應用中，螺旋藻養(yǎng)殖培養(yǎng)液砷離子濃度一定要控制在1 ppm 以下，才可能避免其較大的影響，確保不會因此減產(chǎn)，從而獲得合格的藻粉和較高的產(chǎn)量。