FEN1 酶介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器的研究進(jìn)展

孫雨閣 李宸葳 杜再慧 許文濤，2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

生物傳感器（Biosensors）是將生物活性物質(zhì)和物理化學(xué)檢測(cè)器相結(jié)合的設(shè)備，由固定化的生物敏感材料作為識(shí)別元件對(duì)生物活性物質(zhì)進(jìn)行特異性的識(shí)別，然后將生化信號(hào)轉(zhuǎn)換為物理化學(xué)信號(hào)，再將信號(hào)進(jìn)行輸出的一類可以用于測(cè)定各種生物物質(zhì)及濃度的設(shè)備。至今已有50 多年的發(fā)展歷史。生物傳感器根據(jù)其識(shí)別元件即敏感元件的不同，可分為7類：酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、?xì)胞傳感器、組織傳感器、免疫傳感器、核酸傳感器及分子印跡生物傳感器［1］。酶?jìng)鞲衅魇亲钤绯霈F(xiàn)的生物傳感器，因?yàn)榫哂懈哽`敏度和高特異性，并且操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)溫度一般在30-60℃之間，因此在生化分析及臨床應(yīng)用中得到了較大的發(fā)展。

FEN1 酶是一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，只識(shí)別特異性的結(jié)構(gòu)而不依賴序列，并且有著高效穩(wěn)定的切割效率，已被廣泛應(yīng)用于生物傳感器中靶物質(zhì)的信號(hào)循環(huán)放大過(guò)程中。在FEN1酶所介導(dǎo)的生物傳感器中，對(duì)三堿基重疊結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別，再通過(guò)搭載不同的信號(hào)循環(huán)和信號(hào)放大方式，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶物質(zhì)的精準(zhǔn)檢測(cè)。本文首先對(duì)FEN1 酶的發(fā)現(xiàn)過(guò)程、性質(zhì)及作用進(jìn)行介紹，再根據(jù)靶物質(zhì)的不同對(duì)FEN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器進(jìn)行分類綜述。此外，還對(duì)FEN1 酶在體內(nèi)的成像和治療進(jìn)行了介紹，旨在使人們更多的了解FEN1 酶在生物傳感器上的應(yīng)用及發(fā)展現(xiàn)狀，為今后所用。

1 FEN1 酶的簡(jiǎn)介

1.1 FEN1酶的發(fā)現(xiàn)

瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶-1（Flap endonuclease 1，F(xiàn)EN1）是1994 年Harrington 和Libber［2］根據(jù)底物的形狀特征進(jìn)行命名的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶。其發(fā)現(xiàn)可以追溯到1968 年，首先由Klett 等［3］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌聚合酶具有5'-3'外切酶活性；次年，Kelly 等［4］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌聚合酶同時(shí)具有內(nèi)切酶活性，并且可以切除由于輻射損傷造成的多聚胸腺區(qū)域的錯(cuò)配序列；同年，Lindahl 等［5］從兔子組織中分離得到一種能降解雙鏈DNA 的外切酶DNase Ⅳ，分子量約為42 000，并且DNase Ⅳ降解合成多核苷酸的速度遠(yuǎn)快于天然多核苷酸DNA，與大腸桿菌聚合酶有著共同特性；1971 年，Setlow 等［6］報(bào)道大腸桿菌DNA聚合酶在體外可被水解成兩個(gè)酶活性結(jié)構(gòu)域，較大片段（分子量為76 kD）具有聚合酶和3'-5'外切酶活性，較小片段（分子量為36 kD）具有5'-3'核酸外切酶活性；Masamune 和Richardson［7］推測(cè)大腸桿菌聚合酶在DNA 單鏈斷裂，合成新的序列過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的DNA 分枝；到1982 年，Lundquist 和Olivera［8］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌聚合酶的外切酶活性中最理想的底物為分枝結(jié)構(gòu)單鏈。

1.2 FEN1酶的性質(zhì)

FEN1 酶是一種金屬核酸酶，需要二價(jià)陽(yáng)離子鎂（Mg2+）和錳（Mn2+）的參與才能執(zhí)行功能。在Mg2+濃度為1 mmol/L-10 mmol/L 時(shí)，F(xiàn)EN1 酶可以發(fā)揮最佳的切割能力［2］。除此之外，F(xiàn)EN1 酶的切割效率會(huì)受到鹽離子的影響，如當(dāng)氯化鈉濃度為50 mmol/L 時(shí)，F(xiàn)EN1 酶的切割效率受到大大抑制［2］。FEN1 酶在25-85℃具有切割活性，哺乳動(dòng)物FEN1酶在37℃下活性最強(qiáng)［9］。

FEN1 酶具有5'分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶活性（Flap endonucleases，F(xiàn)EN）、缺口依賴性核酸內(nèi)切酶活性（Gap endonuclease，GEN） 和5'外切酶活 性（Exonuclease，EXO）。

FEN1 酶5'分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶活性（FEN）的最佳底物結(jié)構(gòu)（圖1）為雙分枝DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)（Double Flap），并且FEN1 上有一疏水口袋恰好容納3'分枝結(jié)構(gòu)［10］。分枝結(jié)構(gòu)核苷酸在20 個(gè)以內(nèi)可以被FEN1酶快速有效剪切，但超過(guò)20 個(gè)核苷酸時(shí)，F(xiàn)EN1酶的剪切活性迅速降低，并且分枝結(jié)構(gòu)上結(jié)合了DNA 雙鏈或者大分子結(jié)構(gòu)也會(huì)抑制FEN1 酶的剪切 活性［11］。

圖1 分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶（FEN1）活性底物

FEN1 酶缺口依賴性內(nèi)切酶活性底物結(jié)構(gòu)（圖2）包括Y 型DNA 結(jié)構(gòu)、氣泡狀結(jié)構(gòu)（Bubble）等。其活性相較于分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶活性較低［12］。

FEN1 酶核酸外切酶活性底物結(jié)構(gòu)（圖3）包括缺刻結(jié)構(gòu)（Nick）、缺口結(jié)構(gòu)（Gap）、平末端雙鏈DNA（Blunt）、霍利迪連接體（Holiday junction）等結(jié)構(gòu)［12］。

圖2 缺口依賴性內(nèi)切酶（GEN）活性底物

圖3 核酸外切酶活性（EXO）底物

FEN1 酶在體外行使其活性使DNA 雙鏈斷裂的過(guò)程［12］：首先FEN1 酶識(shí)別5'Flap 片段并對(duì)其切割產(chǎn)生刻痕，當(dāng)DNA 雙鏈上出現(xiàn)缺口時(shí)，F(xiàn)EN1 酶可以從5'端移除一些核苷酸，然后在模板鏈上裂解，使最終得雙鏈DNA 斷裂（圖4）。

圖4 FEN1 酶體外切割DNA 雙鏈過(guò)程

1.3 FEN1酶的作用

FEN1 酶在生物細(xì)胞的DNA 代謝中扮演重要角色，參與DNA 復(fù)制過(guò)程和損傷修復(fù)過(guò)程，不僅如此，F(xiàn)EN1 酶在多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，并且通過(guò)不同的調(diào)控機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)展及耐藥。

FEN1 酶在DNA 復(fù)制過(guò)程中主要參與岡崎片段的RNA 引物的過(guò)程降解，主要有兩種切除方式。第一種方式為在RNA 酶H（RNase H）切除大部分的RNA 引物后，在DNA-RNA 交匯處留下一個(gè)RNA殘基，此時(shí)FEN1 酶行使外切酶活性將其切除。第二種方式是RNA 引物發(fā)生移位，形成一個(gè)5'Flap結(jié)構(gòu)，此時(shí)FEN1 酶行使分枝結(jié)構(gòu)內(nèi)切酶活性將其 切除［13-15］。

DNA 損傷可根據(jù)來(lái)源分為兩類，一類源于體內(nèi)代謝產(chǎn)物的損傷［2］；另一類為體外環(huán)境及某些分子化合物的攻擊。而DNA 損傷的修復(fù)通路有光復(fù)活修復(fù)、堿基切除修復(fù)、重組修復(fù)以及SOS 緊急修復(fù)等。FEN1 酶目前闡述最清楚的是堿基切除修復(fù)過(guò)程。

FEN1 酶多態(tài)性改變和基因突變與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)多肽位點(diǎn)69G →A 和4150G →T 與肺癌、乳腺癌及消化道腫瘤有關(guān)，并且這兩種多肽位點(diǎn)的改變與FEN1mRNA 表達(dá)下降有關(guān)［16-17］，因此這兩種多肽位點(diǎn)的改變可以用做癌癥的檢測(cè)。而改變FEN1 酶和Mg2+的結(jié)合位點(diǎn)，使得突變頻繁發(fā)生，無(wú)法進(jìn)行外源性DNA 損傷修復(fù)，使得小鼠患慢性炎癥和癌癥［18］。

FEN1 酶的表達(dá)改變也與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。當(dāng)單倍體量不足時(shí)，F(xiàn)EN1 酶的活性降低，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Singh 等［19］發(fā)現(xiàn)FEN1 在乳腺癌、子宮癌、腎癌、卵巢癌及結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高。研究發(fā)現(xiàn)FEN1 蛋白水平幾乎在所有腫瘤中都有所增加，并且FEN1 蛋白在大部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)也升高。

2 基于不同物質(zhì)與核酸作用的FEN1 酶生物傳感器

FEN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器多采用核酸侵入反應(yīng)（Invader assay）來(lái)進(jìn)行核酸的信號(hào)放大。該方法的檢測(cè)原理是基于FEN1 酶所具有的結(jié)構(gòu)特異性對(duì)錯(cuò)配的序列的高度敏感性。反應(yīng)過(guò)程為FEN1 酶識(shí)別寡核苷酸與目標(biāo)DNA 形成三堿基的重疊結(jié)構(gòu)，并切割相應(yīng)的寡核苷酸，將產(chǎn)生的Flaps 片段作為識(shí)別信號(hào)，再通過(guò)二次裂解熒光共振轉(zhuǎn)移發(fā)卡探針（FRET probe）等方法進(jìn)行信號(hào)放大檢測(cè)（圖5）［20］。

2.1 單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)

圖5 核酸侵入反應(yīng)原理圖［20］

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是人類基因組DNA 序列中最常見的變異形式，指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA 序列多態(tài)性，包括置換、顛換、缺失和插入。在過(guò)去的幾年中，許多大規(guī)模的工作已經(jīng)確定了大量的SNP，并且到目前為止，用于這些多態(tài)性的公共存儲(chǔ)庫(kù)db- SNP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP）包含了大約1 000 萬(wàn)個(gè)SNP 的信息［21］。

Hall 等［22］將兩種侵入性裂解反應(yīng)結(jié)合成單一均勻試驗(yàn)的分析方法，解決了初始侵入者分析方法的困難。如圖6 所示，這種連續(xù)入侵信號(hào)放大反應(yīng)（Serial invasive signal amplification reaction，SISAR）為目前使用的大多數(shù)入侵檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。該方法最初應(yīng)用于單核苷酸反應(yīng)，要求在單獨(dú)的反應(yīng)中研究每個(gè)SNP 等位基因。隨后，使用兩個(gè)單獨(dú)的FRET 盒式寡核苷酸將該實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化為單管雙重檢驗(yàn)，可以得到兩個(gè)SNP 等位基因的熒光信號(hào)。

圖6 連續(xù)入侵信號(hào)放大反應(yīng)（SISAR）原理圖［22］

2.2 甲基化檢測(cè)

現(xiàn)代DNA 甲基化作為最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，是指由S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）將其胞嘧啶催化為 5-甲基胞嘧啶的過(guò)程［23］。

2012 年，臨床化學(xué)上刊登了對(duì)糞便中結(jié)直腸癌相關(guān)甲基化基因的檢測(cè)方法（圖7），QuARTS 法（Quantitative allele-specific real-time target andsignal amplification），該方法將實(shí)時(shí)熒光 PCR 與核酸侵入信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合，利用核酸侵入反應(yīng)序列識(shí)別的高特異性和 PCR 擴(kuò)增的高靈敏性提高了檢測(cè)的特異性。該方法分為3 個(gè)部分，首先先對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，隨后利用FEN1 酶的對(duì)所形成三堿基結(jié)構(gòu)進(jìn)行切割釋放Flaps 片段，最后再通過(guò)熒光能量共振轉(zhuǎn)移的方法獲得信號(hào)。QuARTS 法檢測(cè)甲基化標(biāo)記物可檢測(cè)出大多數(shù)大腸癌和腺瘤，特異性閾值高達(dá)95%［24］。

圖7 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)PCR 定量檢測(cè)DNA 甲基化水平（QuARTS）的原理圖［24］

2.3 基因型檢測(cè)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，人類疾病都直接或間接地與基因有關(guān)，利用P53 基因來(lái)診斷癌癥等都表明檢測(cè)基因型對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要性。

FEN1 酶所介導(dǎo)的核酸生物傳感器是一種快速、精確的對(duì)基因型進(jìn)行檢測(cè)的方法，具有巨大的醫(yī)療價(jià)值。為降低FRET 的檢測(cè)成本，促進(jìn)其更好的被利用，可以采用以下兩種方法對(duì)其進(jìn)行替代：第1種方法是采用檢測(cè)偏振光的變化［25］，熒光分子可以被平面偏振光激發(fā)產(chǎn)生熒光偏振（Fluorescence polarization FP），而熒光偏振依賴于染料分子的分子量。Hsu 等［25］在使用FP 進(jìn)行檢測(cè)中使用兩個(gè)不同熒光體的信號(hào)探針，熒光素和羧基四甲基羅丹明（Carboxytetramethylrhodamine TAMRA）。因此，可以在一個(gè)反應(yīng)中測(cè)定每個(gè)樣品，從而節(jié)省時(shí)間和減少基因型雜合。第2 種方法是使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）的方式進(jìn)行替代［26］。MALDI-TOF 質(zhì)譜法可以對(duì)短DNA 探針進(jìn)行溫和分析并且具有較高靈敏度的方法，同時(shí)飛行時(shí)間（TOF）探測(cè)器提供了很好的分辨率。并且在該方法中，混合物的每一組分在質(zhì)譜上幾乎都有一個(gè)單峰。MALDI-TOF 質(zhì)譜法成為分析復(fù)雜混合物的一種選擇方法，并且近年來(lái)，此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于DNA、PNA 和抗生素的定量分析中［27］。因此，采用MALDI-TOF MS 檢測(cè)反應(yīng)中產(chǎn)生的Flap 分子，可對(duì)多個(gè)基因同時(shí)分型檢測(cè)。

不僅如此，美國(guó)Third Wave Technologies 公司（Madison，WI）開發(fā)了一種新的基于微滴度板的測(cè)定方法［28］，稱為InvaderTM，可用于基因型的檢測(cè)。該方法將核酸侵入反應(yīng)與和使用微滴度板相結(jié)合，在發(fā)生裂解之后可以采用微滴度板檢測(cè)熒光標(biāo)記的產(chǎn)品，基因型由凈野生型/突變信號(hào)比決定。2000 年，Hessner 等［29］對(duì)1 369 個(gè)個(gè)體進(jìn)行導(dǎo)致活化蛋白C（Activated protein C，APC）耐藥的突變因子（FactorVleiden，F(xiàn)VL）進(jìn)行基因分型，分型結(jié)果與樣本結(jié)果一致，因此此方法被認(rèn)為是一種對(duì)FVL 進(jìn)行基因分型的快速、可靠的方法。

2.4 RNA檢測(cè)

RNA 定量在醫(yī)學(xué)研究上發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。例如，病毒RNA 的定量可以預(yù)測(cè)疾病的進(jìn)展和治療效果，RNA 幾乎密切參與所有的細(xì)胞生理機(jī)制，隨著人類基因組計(jì)劃的重點(diǎn)轉(zhuǎn)向基因表達(dá)分析，該領(lǐng)域?qū)⑿枰环N靈活的RNA 分析技術(shù)，能夠定量檢測(cè)多種形式的交替轉(zhuǎn)錄或處理過(guò)的RNA。

2001 年，Eis 等［30］利用核酸侵入原理來(lái)對(duì)總RNA 和細(xì)胞裂解樣品中的RNA 進(jìn)行檢測(cè)。利用此種方法可以對(duì)高度同源的RNA 進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)分為兩部分。在初級(jí)反應(yīng)中（圖8-A），侵入性寡核苷酸和探針特異性地與它們各自的RNA 靶標(biāo)形成重疊結(jié)構(gòu)，隨后進(jìn)行切割、退火。初級(jí)反應(yīng)完成后，裂解的5'-Flap 然后在第二反應(yīng)中充當(dāng)侵入性寡核苷酸（圖8-B），與二級(jí)反應(yīng)模板（Secondary-reaction template，SRT）結(jié)合，所形成的5'-Flap-SRT 復(fù)合物切割多個(gè)FRET 脫氧寡核苷酸時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。

圖8 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)PCR 定量檢測(cè)RNA 的原理圖［30］

RNA 侵入性切割測(cè)定的形式與用于基因組DNA檢測(cè)的主要有以下幾點(diǎn)不同。首先，RNA 侵入切割測(cè)定需要兩個(gè)寡核苷酸（FRET 和STR），DNA 檢測(cè)中只需要一種寡核苷酸。其次，因?yàn)镽NA 侵入切割測(cè)定是一種依賴于靶物質(zhì)和時(shí)間的線性擴(kuò)增信號(hào)，所以在測(cè)定過(guò)程中要注意兩個(gè)反應(yīng)的順序操作，以防止形成X-結(jié)構(gòu)。而對(duì)基因組DNA 的檢測(cè)是兩個(gè)反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，并將信號(hào)放大作為目標(biāo)水平［22］。

MicroRNA（miRNA）是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA 分子，大概由21-25 個(gè)核苷酸組成，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近年來(lái)研究表明，miRNA 參與包括發(fā)育，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，脂肪代謝，激素分泌和腫瘤發(fā)展等過(guò)程［31］。所以可以通過(guò)開發(fā)研究期新方法，促進(jìn)人們對(duì)miRNA 的理解。

Allawi 等［32］及其同事對(duì)核酸侵入反應(yīng)進(jìn)行改進(jìn)，新開發(fā)出一種用于miRNA 敏感性和特異性的方法，命名為Invader miRNA。該方法是對(duì)先前設(shè)計(jì)的Invader mRNA 的擴(kuò)展應(yīng)用［30，33］。在Invader mRNA中使用Cleavase 酶對(duì)形成的三堿基重疊結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪切并釋放5'Flap 片段，而Cleavase 酶是FEN1 酶家族中的一員［34］。而miRNA 因?yàn)槠漭^小所以需要對(duì)入侵結(jié)構(gòu)和探針進(jìn)行一些修飾。設(shè)計(jì)入侵結(jié)構(gòu)和探針在5'和3'末端含有自身互補(bǔ)序列（圖9-C），使miRNA 靶特異性區(qū)域（Target specific region，TSR）的兩側(cè)都形成側(cè)翼發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些側(cè)翼結(jié)構(gòu)通過(guò)促進(jìn)三堿基重疊結(jié)合的形成，以達(dá)到穩(wěn)定miRNA 靶序列與探針系統(tǒng)的作用，并且還提高Cleavase 酶反應(yīng)的效率。待Cleavase 酶切割后，與mRNA 測(cè)定一樣，然后釋放的5'Flap 片段可以結(jié)合二級(jí)反應(yīng)模板再次切割反應(yīng)以產(chǎn)生熒光信號(hào)。（圖9-B）。

圖9 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)PCR 檢測(cè)mRNA 及miRNAD 的原理圖［32］

Chenna 和Tian 等［35］通過(guò)對(duì)Invader mRNA 方法的進(jìn)一步改進(jìn)，使其達(dá)到多通量檢測(cè)mRNA 的目的。該方法描述了一種使用電泳標(biāo)記（Electrophoretic tags，eTag）來(lái)編碼和量化mRNA 目標(biāo)的多路復(fù)用方法，eTag 是一種小熒光分子庫(kù)，它們具有相同的熒光性質(zhì)，但又具有不同的電荷質(zhì)量比，通過(guò)激光誘導(dǎo)熒光（Laser-induced fluorescence，LIF）作用后產(chǎn)生預(yù)定義的電泳特性。首先將兩個(gè)目標(biāo)特異性的探針與mRNA 三堿基重疊結(jié)構(gòu)，信號(hào)探針在其5'末端的堿基處連接一個(gè)eTag 分子（圖10-A）。然后利用Cleavase 酶將5'Flap 片段與eTag 分子一起裂解，釋放，再通過(guò)激發(fā)誘導(dǎo)熒光以及毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA 的檢測(cè)（圖10-B）。多路復(fù)用是通過(guò)將不同的eTag 分子分配給多個(gè)目標(biāo)特異性信號(hào)探針來(lái)實(shí)現(xiàn)的。采用LIF 結(jié)合 CE 的方式大大提高了反應(yīng)的靈敏度，并且因?yàn)镃E 的檢測(cè)限（Limit of detection，LOD）一般在亞皮摩爾范圍，因此只需進(jìn)行一次Invader mRNA 便可以直接測(cè)定粗裂解液中的mRNA，在eTag 多重檢測(cè)mRNA 系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了前所未有的基因表達(dá)簡(jiǎn)化分析。

2.5 病毒檢測(cè)

丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）感染是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球HCV 的感染率約為3%，每年約有3.5 萬(wàn)新發(fā)HCV 感染病例［36］。在我國(guó)，HCV 感染病例約2 000 萬(wàn)例，HCV 感染在我國(guó)是繼乙型肝炎、肺結(jié)核、痢疾之后第四大常見的感染性疾?。?7］。HCV 感染可能導(dǎo)致慢性肝炎，甚至發(fā)展成潛在的致命性肝硬化和肝細(xì)胞癌。因此，可以對(duì)HCV 進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。

2013 年，Kenichi 等［38］采用實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)核酸侵入反應(yīng)（Q-Invader 法）對(duì)HCV-1b 核心區(qū)域中70/91 位的突變進(jìn)行檢測(cè)。侵入反應(yīng)對(duì)于檢測(cè)基因組DNA 或PCR 產(chǎn)物中的單核苷酸差異具有較高的特異性，再通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR 可以獲得高靈敏度的定量分析。通過(guò)對(duì)上述兩個(gè)位置（70 和91）的野生型/突變序列標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，對(duì)123 名患者進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示Q-Invader 法可以對(duì)突變體變體的檢測(cè)低至總量的1%。

2018 年，Kenichi Tadokoro 團(tuán)隊(duì)［39］再次利用Q-Invader 法與直接測(cè)序法比較測(cè)定了HCV 感染中的Y93H 突變。結(jié)果顯示Q-Invader 測(cè)定的靈敏度與用于HCV 檢測(cè)的直接測(cè)序分析的靈敏度相同，并且Q-Invader 測(cè)定可以檢測(cè)通過(guò)直接測(cè)序分析無(wú)法檢測(cè)的次要菌株。因此，Q-Invader 測(cè)定可以用于臨床環(huán)境中對(duì)HCV 患者的檢測(cè)。

圖10 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)eTag 多重檢測(cè)mRNA 的原理圖［35］

2.6 腫瘤檢測(cè)

大腸癌是消化道惡性腫瘤中常見的一種癌，發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌，死亡率在惡性腫瘤中占第3-6 位。大腸癌早期并沒(méi)有明顯癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)便血等癥狀，病程已經(jīng)達(dá)到中晚期。而手術(shù)效果與患病階段有密切關(guān)系：早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行手術(shù)患者存活率可高達(dá)90%以上；晚期癌即使手術(shù)，存活率也不足10%。因此，早期發(fā)現(xiàn)，早期治療是防治大腸癌的關(guān)鍵。

而大腸癌的發(fā)生發(fā)展與多個(gè)基因的甲基化密切相關(guān)，而核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián) PCR 定量檢測(cè) DNA 甲基化水平為大腸癌的檢測(cè)提供了一種新思路?；騿?dòng)子區(qū)超甲基化造成骨形態(tài)發(fā)生蛋白3（Bone morphogenetic protein 3，BMP3）基因表達(dá)下調(diào)，是引發(fā)結(jié)直腸癌的重要機(jī)制之一［40-42］。NDRG4 基因也與2014 年被美國(guó)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)作為大腸癌糞便檢測(cè)的其中一種靶標(biāo)［42］。

嚴(yán)志進(jìn)等［43］對(duì) QuARTS 法進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)△CT 法［44］進(jìn)行甲基化定量。反應(yīng)中以 NDRG4 為目的基因，引入ACTB 作為參比基因，對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行優(yōu)化，使兩基因的擴(kuò)增效率均接近 100%，通過(guò)測(cè)定目的基因與參比基因的 CT 值的差值，計(jì)算出甲基化基因的相對(duì)甲基化水平，以此來(lái)對(duì)甲基化進(jìn)行定量。劉琳琳［40］等采用相同的核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián) PCR 定量檢測(cè) DNA 甲基化水平的方法對(duì)BMP3基因進(jìn)行了定量檢測(cè)（圖11）。該方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)低至 0. 01%的DNA 甲基化。并且該方法避免了使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)目的基因片段測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，在低豐度甲基化基因的臨床定量檢測(cè)中有著巨大的應(yīng)用前景。

肺癌是當(dāng)今癌癥死亡的主要原因，根據(jù)《中國(guó)腫瘤年報(bào)2015》的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年肺癌發(fā)病78.1 萬(wàn)例，死亡病例約62.6 萬(wàn)［45］。非小型細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中的主要類型，約占肺癌中的80%-85%，通過(guò)大規(guī)模的基因測(cè)序工程后發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）的突變與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，EGFR 突變已被報(bào)道為非小型細(xì)胞肺癌治療中一個(gè)非常重要的因素［46］。

圖11 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián) PCR 定量檢測(cè) DNA 甲基化水平的原理圖［40］

Naoki 等［47］通過(guò)核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)PCR 的過(guò)程對(duì)非小型細(xì)胞肺癌中的EGFR 突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)（圖12），可以檢測(cè)稀釋100-1 000 倍的肺癌細(xì)胞系的已知EGFR 突變，顯現(xiàn)了較高的靈敏度，在臨床檢測(cè)上具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

2.7 微生物檢測(cè)

細(xì)菌（Bacteria）是生物的主要類群之一，也是所有生物中數(shù)量最多的一類。細(xì)菌對(duì)人類活動(dòng)產(chǎn)生較大的影響，一方面，細(xì)菌是許多疾病的病原體：另一方面，人類也利用細(xì)菌進(jìn)行酸奶的制造和部分抗生素的制造。實(shí)時(shí)PCR 是最常用的細(xì)菌定量分析方法之一，但是不管是采用熒光探針或者插入熒光染料，都使得對(duì)細(xì)菌成本的檢測(cè)較高。針對(duì)以上狀況，Kenichi 等［48］改進(jìn)了對(duì)病毒進(jìn)行對(duì)皰疹病毒的定量的Invader PLUS 法，使其用于多種細(xì)菌類型，稱為m-Invader PLUS（Modification of the invader PLUS）法（圖13）。反應(yīng)過(guò)程中，PCR 和核酸侵入反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，變性PCR 產(chǎn)物結(jié)合侵入初級(jí)探針和延伸引物形成侵入性復(fù)合物，釋放的5'-Flap（第一反應(yīng)的產(chǎn)物）促進(jìn)第二反應(yīng)中通用FRET 盒的裂解。隨后對(duì)唾液樣品進(jìn)行的6 種牙周炎相關(guān)細(xì)菌測(cè)定中，m-Invader PLUS 與實(shí)時(shí)PCR 具有良好的相關(guān)性。

圖12 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián) PCR 定量檢測(cè) EGFR 突變的原理圖［47］

圖13 m-Invader PLUS 測(cè)定的兩個(gè)反應(yīng)的示意圖［48］

分枝桿菌是一大類細(xì)菌菌種，其中的一些細(xì)菌會(huì)引起人類疾病，如結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致人類罹患結(jié)核病，麻風(fēng)分枝桿菌會(huì)引起麻風(fēng)病等［49］。在臨床檢測(cè)中，急需一種快速、準(zhǔn)確的分枝桿菌感染診斷方法。Ichimura 等［50］將BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)與入侵檢測(cè)方法的結(jié)合來(lái)對(duì)分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)。其中使用BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)可以極大的縮短分枝桿菌檢測(cè)時(shí)間，使用核酸侵入反應(yīng)不僅具有極高的準(zhǔn)確性和特異性，還需要事先進(jìn)行目標(biāo)擴(kuò)增就可以直接在基因組DNA 上進(jìn)行檢測(cè)。隨后他們對(duì)122 株陽(yáng)性液體培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，檢出率達(dá)到95.1%，說(shuō)明該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，是分枝桿菌感染診斷的有效方法。

2.8 FEN1酶介導(dǎo)的其他生物傳感器

流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種靈敏、定量的測(cè)量顆粒或細(xì)胞熒光或光散射的方法，它在配體結(jié)合和酶動(dòng)力學(xué)、藥物篩選、可溶性試劑診斷和檢測(cè)、DNA 序列檢測(cè)或分析等領(lǐng)域都有所應(yīng)用［51］。因此可以運(yùn)用此種方法測(cè)定FEN1 酶的核酸內(nèi)切酶活性（圖14）。在鏈霉親和素包覆的微球上固定熒光標(biāo)記的DNA 底物，用FEN-I 測(cè)定DNA 的裂解，然后通過(guò)快速的動(dòng)力學(xué)儀器和計(jì)算機(jī)建?？梢源_定這種相互作用的基本速率常數(shù)。此方法提供了一種連續(xù)測(cè)量底物解離的新方式［52］。

鏈置換反應(yīng)是指某些DNA 聚合酶在延伸新鏈的過(guò)程中如果遇到下游DNA 鏈，可以繼續(xù)延伸反應(yīng)并同時(shí)將下游雙鏈剝離而產(chǎn)生游離的單鏈［53］。2015年，Zou 等［54］提出了一種新的策略，將入侵反應(yīng)與鏈置換信號(hào)擴(kuò)增耦合（Invasive reaction assisted strand-displacement signal amplification，IRASA），進(jìn)行目標(biāo)DNA 檢測(cè)。首先用兩個(gè)序列特異性探針進(jìn)行侵入反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)DNA，然后用鏈置換反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)DNA，用此種方法可以檢測(cè)低至0.2 pmol/L 的目標(biāo)DNA。并且由于二次放大對(duì)任何目標(biāo)都是通用的，因此該方法有效的降低的檢測(cè)成本，并且該方法可以區(qū)分目標(biāo)DNA 之間的單個(gè)堿基差異。

FEN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器除了在動(dòng)物DNA基因分型上被使用，在植物基因分型上也有所利用。跨國(guó)種子公司正轉(zhuǎn)向新的DNA 標(biāo)記技術(shù)，以加快植物育種和作物改良的速度。為此，Zec 等［55］開發(fā)了一種可編程的、基于微流體的玉米基因組DNA 基因分型裝置（圖15）。微流控平臺(tái)的一個(gè)獨(dú)特功能是納米樣本處理器，它允許設(shè)備僅使用兩個(gè)輸入端連續(xù)加載數(shù)量不受限制的唯一DNA 樣本，克服了當(dāng)前由于設(shè)備占用空間小而對(duì)樣本輸入數(shù)量的限制。并且所需樣本量小，可以在50 nL 的液滴中完成基因分型，大大降低了每次反應(yīng)的試劑消耗。Helen 等進(jìn)行了240 次入侵反應(yīng)（針對(duì)10 個(gè)SNP 標(biāo)記檢測(cè)8個(gè)DNA 樣本），在單滴實(shí)驗(yàn)中對(duì)植物DNA 樣本進(jìn)行SNP 調(diào)用的準(zhǔn)確率超過(guò)93%。

圖14 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FEN1 核酸內(nèi)切酶活性［52］

圖15 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)微流體分型植物基因原理圖［55］

2.9 納米材料結(jié)合檢測(cè)

FEN1 酶與納米材料的結(jié)合多是通過(guò)納米金探針的方式。核酸納米金探針是將寡核苷酸片段修飾在納米金表面而形成的納米顆粒，表面的寡核苷酸片段可與待測(cè)靶核酸進(jìn)行特異性雜交，使納米金顆粒發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致納米粒子光散射性質(zhì)發(fā)生改變，造成肉眼可見的顏色變化［56］。

將切口核酸內(nèi)切酶輔助擴(kuò)增與基于納米顆粒的傳感器結(jié)合用于DNA 檢測(cè)（Novel nicking endonuclease-assisted nanoparticle amplification，NEANA）［57］。但在該方法中，切口核酸內(nèi)切酶（Nicking endonuclease，NEase）只識(shí)別雙鏈DNA 的特定核苷酸序列，因此，NEANA 無(wú)法檢測(cè)到?jīng)]有識(shí)別序列的目標(biāo)。為了提高NEANA 檢測(cè)各種序列的真實(shí)生物樣本的可行性，Zou 等［58］提出了通過(guò)將核酸侵入反應(yīng)與NEANA 偶聯(lián)進(jìn)行比色DNA 檢測(cè)（Invasive reaction with NEANA，IR-NEANA）。靶DNA 可通過(guò)核酸侵入反應(yīng)產(chǎn)生許多的Flap 片段，然后將Flap 片段與5'磷酸化的寡核苷酸連接以產(chǎn)生NEANA 的模板，隨后進(jìn)行NEANA 反應(yīng)（圖16）。因?yàn)榍秩胄苑磻?yīng)僅依賴于通過(guò)上游探針和下游探針與靶DNA 的特異性結(jié)合形成的重疊結(jié)構(gòu)，與常規(guī)NEANA 不同，任何DNA 序列都可以通過(guò)IR-NEANA 檢測(cè)。

圖16 核酸侵入反應(yīng)偶聯(lián)納米金探針可視化檢測(cè)法原理［58］

除了使用PCR 進(jìn)行擴(kuò)增外，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)并不斷完善的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）也是一種高靈敏DNA 擴(kuò)增技術(shù)。其反應(yīng)過(guò)程始終維持在恒定的溫度下，通過(guò)添加不同活性的酶和引物來(lái)達(dá)到快速擴(kuò)增核酸的目的［59］。為能對(duì)LAMP 擴(kuò)增子進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)（Point-of-care test，POST），Lu 等［60］提 出LAMP 基因分型結(jié)合核酸侵入，再通過(guò)金納米粒子的顯色實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)（圖17）。由于侵入性反應(yīng)是高特異性的，因此可以準(zhǔn)確區(qū)分復(fù)雜LAMP 擴(kuò)增子中的一個(gè)堿基差異，并且進(jìn)行核酸擴(kuò)增過(guò)程是在恒定溫度下進(jìn)行的，只需要一個(gè)簡(jiǎn)單的溫度控制器，操作更為簡(jiǎn)便。陳銀等［61］也利用此種方法快速檢測(cè)腦膜炎奈瑟菌。

圖17 LAMP 基因分型結(jié)合核酸侵入反應(yīng)和雜交誘導(dǎo) AuNP 聚集的原理圖［60］

核酸侵入反應(yīng)與納米材料的結(jié)合在對(duì)蛋白的檢測(cè)中也表現(xiàn)出巨大潛力。Song 等［62］開發(fā)了一種核酸侵入反應(yīng)結(jié)合AuNPs 輔助酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)方法（圖18），將該方法命名為iaELISA（Invader assisted ELISA）。該方法可以用于疾病生物標(biāo)志物檢測(cè)。首先對(duì)DNA 片段修飾了針對(duì)靶向抗原的抗體，然后結(jié)合AuNPs 進(jìn)行核酸侵入反應(yīng)，最后通過(guò)金納米粒子的顯色實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。并且該方法在對(duì)HBV 檢測(cè)中體現(xiàn)了較好的特異性。

流感病毒主要通過(guò)其在全世界引起急性呼吸道疾病的能力對(duì)人類健康構(gòu)成持續(xù)威脅。并且流感病毒的不斷變異和高速的傳播，是發(fā)病率和死亡率的最常見原因之一［63］。目前，多采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）對(duì)流感病毒感染分子進(jìn)行檢測(cè)［64］。相比較而言，LAMP 法更適合用于資源有限的區(qū)域或用于現(xiàn)場(chǎng)使用。Ge 等［65］開發(fā)了一種多重逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合使用納米顆粒作為傳感器的級(jí)聯(lián)核酸侵入反應(yīng)（Multiplex reverse transcription LAMP with cascade invasive reaction using nanoparticles，mRT-LAMP-CIRN）的新方法（ 圖19），用于同時(shí)擴(kuò)增3 種亞型流感病毒（甲型流感/ H1N1pdm09，A/H3 和乙型流感），可適用于現(xiàn)場(chǎng)使用和低設(shè)備設(shè)置實(shí)驗(yàn)室使用。

圖18 iaELISA 反應(yīng)原理圖［62］

2.10 FEN1酶體內(nèi)成像和治療

盡管FEN 通常被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，但是癌癥的發(fā)生及癌基因復(fù)制過(guò)程中FEN1 高表達(dá)，并且許多研究表明FEN1 酶在癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖擴(kuò)散中起到一定作用［66］。FEN1 在前列腺癌［67］、胰腺癌［68］、胃癌［69］、肺癌［70］及神經(jīng)母細(xì)胞瘤［71］等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，因此FEN1 酶可以作為某些癌細(xì)胞的潛在生物標(biāo)記物。

正因?yàn)镕EN1 酶與癌癥聯(lián)系的密切性，實(shí)驗(yàn)可以利用合成致死方式來(lái)利用FEN1 合成抗癌藥。合成致死（圖20），簡(jiǎn)單地說(shuō)就是指在兩個(gè)非致死基因中，若僅其中的一個(gè)基因發(fā)生了變異，細(xì)胞仍會(huì)存活，若兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生變異，則將引起細(xì)胞死亡，這兩個(gè)基因則構(gòu)成合成致死搭檔（partner）。如果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中某個(gè)基因失活或者用藥物抑制某個(gè)基因，與之構(gòu)成合成致死搭檔的另外的一個(gè)基因就有可能成為潛在的靶基因，那么對(duì)這個(gè)靶基因進(jìn)行抑制就能夠特異性的殺死癌細(xì)胞，并且不會(huì)影響正常細(xì)胞的存活（圖21）［72］。

圖19 級(jí)聯(lián)核酸侵入反應(yīng)和AuNP 信號(hào)檢測(cè)原理的示意圖［65］

圖20 合成致死原理［72］

圖21 合成致死方法在抗腫瘤藥物研究中可能的應(yīng)用［72］

而FEN1 酶可以和近20 種蛋白發(fā)生交互作用進(jìn)行體內(nèi)調(diào)控，因此認(rèn)為FEN1 可能與DNA 損傷修復(fù)過(guò)程中的多個(gè)基因形成合成致死搭檔，通過(guò)抑制FEN1 酶的表達(dá)就可以達(dá)到合成致死目的。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠在蛋白表達(dá)水平上下調(diào)FEN1 的表達(dá)，這可能是姜黃素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一［73］。中藥鐵筷子中分離的一種強(qiáng)心苷類成分HTF-1 能劑量依賴性地下調(diào)FEN1 的表達(dá)，這也是此化合物能夠抑制癌細(xì)胞的原因之一［74］。通過(guò)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)一種名為JFD00950 萘類化合物具有FEN1 催化抑制活性［75］。N-羥基脲類化合物也可作為FEN1 的抑制劑。［76］

3 總結(jié)和展望

綜上，F(xiàn)EN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器已經(jīng)應(yīng)用于各個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域，主要優(yōu)勢(shì)FEN1 酶對(duì)結(jié)構(gòu)的特異性識(shí)別，提高了檢測(cè)的靈敏度。其次，F(xiàn)EN1 酶的活度范圍廣，在較大的溫度區(qū)間內(nèi)均具有活性，并且FEN1 酶可以與多種信號(hào)輸出方式相結(jié)合（熒光法、微電流法等）以及新興的納米材料技術(shù)相結(jié)合，體現(xiàn)了其良好的兼容性。同時(shí)，F(xiàn)EN1 酶可以將不同種類的靶物質(zhì)轉(zhuǎn)換為核酸信號(hào)，并進(jìn)行FEN1 酶介導(dǎo)的信號(hào)放大，體現(xiàn)了其檢測(cè)的廣泛性。

目前，F(xiàn)EN1 酶所介導(dǎo)的生物傳感器主要用于DNA、RNA、病毒和細(xì)菌檢測(cè)等方面，但在實(shí)際應(yīng)用中多用于對(duì)疾病生物標(biāo)志物的檢測(cè)。未來(lái)對(duì)FEN1酶研究的發(fā)展趨勢(shì)可能為：（1）體內(nèi)作用研究：FEN1 酶在體內(nèi)不僅具有核酸酶活性，還與多種蛋白發(fā)生交互作用，可通過(guò)對(duì)FEN1 酶的進(jìn)一步研究更深入的了解人類的身體密碼。（2）生物傳感器的進(jìn)一步開發(fā)：生物傳感器的最終目的是進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用，爭(zhēng)取用最短的時(shí)間最低的成本實(shí)現(xiàn)利益的最大化，而FEN1 酶作為一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，所使用的范圍大，活度范圍廣，并且價(jià)格低廉，體現(xiàn)了其巨大的使用優(yōu)勢(shì)。（3）納米材料的多樣化搭載：納米材料因?yàn)槠洫?dú)特的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)使得檢測(cè)的靈敏度大幅提高，并且檢測(cè)時(shí)間大大縮短，目前FEN1 酶與納米材料的研究多集中在與納米金粒子的結(jié)合上，未來(lái)在水凝膠、磁珠上可以有更廣泛的應(yīng)用。（4）抗腫瘤藥物的研發(fā)：FEN1 酶在多種腫瘤中的高表達(dá)體現(xiàn)了其在抗腫瘤藥物研發(fā)中的潛力，可以通過(guò)利用合成致死原理合成特異性的抗腫瘤 藥物。