HPLC-CAD法測定濃維磷糖漿中果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量

石蓉，粟貴，趙勇，謝瑩瑩

(湖南省藥品檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410001)

濃維磷糖漿(Concentrated Divitamins and Sodium Phosphate Syrup，曾用名：維磷補(bǔ)汁)為復(fù)方制劑，是我國獨(dú)有品種。本品用于自主神經(jīng)功能紊亂引起的頭暈?zāi)垦?、精神疲倦以及低磷血癥。濃維磷糖漿現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為WS-10001-(HD-1215)-2013，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定蔗糖含量為60%(處方1)或45%(處方2)。蔗糖屬于雙糖類，其水溶液較穩(wěn)定，但在酸環(huán)境下，加熱后易水解生成葡萄糖與果糖。蔗糖在糖漿劑中主要是作為矯味劑以改善口味，高濃度的蔗糖還能起到抑菌作用。濃維磷糖漿劑中蔗糖成本占比較大，可能存在企業(yè)為降低成本而進(jìn)行低量投料或替代投料，有研究發(fā)現(xiàn)部分企業(yè)采用麥芽糖代替蔗糖進(jìn)行投樣，或者將蔗糖與麥芽糖混合進(jìn)行投樣。而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅依靠相對密度法控制蔗糖含量，該方法專屬性低，既不能區(qū)分糖的類別，更不能準(zhǔn)確判斷蔗糖的投料情況，存在一定的質(zhì)量與監(jiān)管風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。

糖類化合物分子極性較強(qiáng)，因結(jié)構(gòu)中缺乏生色官能團(tuán)，紫外吸收較弱，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中常采用高效液相示差折光檢測器(RID)、電噴霧檢測器(CAD)和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)進(jìn)行檢測，由于RID靈敏度較低，易受溫度和流動(dòng)相的影響，無法進(jìn)行梯度洗脫，在進(jìn)行多組分分析時(shí)效果不理想[3-4]。而CAD 是一種通用型質(zhì)量檢測器，它基于霧化氣溶膠原理，液相系統(tǒng)流出的洗脫液經(jīng)霧化后形成顆粒，經(jīng)過干燥后與帶電氮?dú)馀鲎?，將電荷轉(zhuǎn)移至分析物顆粒表面，最后通過靜電計(jì)測定分析物表面的電荷量[5-6]。該檢測器相對RID和ELSD檢測器，靈敏度更高、重現(xiàn)性更好，且具有對不同化合物響應(yīng)一致的特點(diǎn)，用于分析測定單糖和二糖等低聚糖時(shí)有較好的效果[7-10]。

本研究采用高效液相色譜串聯(lián)電噴霧檢測器(HPLC-CAD)法測定濃維磷糖漿中果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量，通過分析測定結(jié)果，來評(píng)估濃維磷糖漿中蔗糖含量是否符合要求，對濃維磷糖漿的質(zhì)量控制提供一定參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex Ultimate 3000 型高效液相色譜儀；Corona Veo 電噴霧檢測器(美國 Thermo Fisher Scientific 公司)；LC Solution色譜數(shù)據(jù)工作站(Chromeleon 7.2)；MS205 DU電子分析天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 試藥 乙腈(德國默克公司)為色譜純，水為超純水。果糖對照品(批號(hào)：100231-201606，純度：99.7%)、葡萄糖對照品(批號(hào)：10833-201506，純度：99.9%)、麥芽糖對照品(批號(hào)：100287-201303純度：94.3%)、蔗糖對照品(批號(hào)：111507-201303，純度：99.8%)，以上對照品均來自中國食品藥品檢定研究院。3批濃維磷糖漿分別來自A(批號(hào)：171101，長沙東風(fēng)藥業(yè)有限公司)、B(批號(hào)：1711182，湖北康源藥業(yè)有限公司)、C(批號(hào)：20180913，湖北盛通藥業(yè)有限公司)等3個(gè)廠家，均為自購樣品。

2 方法

2.1 混合對照品溶液制備 分別精密稱取果糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖對照品適量，置同一量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(溶液中含果糖5.081 mg·mL-1,葡萄糖5.084 mg·mL-1,麥芽糖2.653 mg·mL-1,蔗糖7.828 mg·mL-1)。

2.2 供試品溶液制備 取本品0.1 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 采用Alltech chrom Prevail carbohydrate ES 5u色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(75∶25)，流速為1.0 mL· min-1，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。Corona 電噴霧檢測器:采集頻率為10 Hz，濾光片為5 s，溫度為35 ℃。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取對照品溶液(果糖和葡萄糖濃度約為0.5 mg·mL-1,蔗糖濃度約為0.75 mg·mL-1,麥芽糖濃度約為0.25 mg·mL-1)、供試品溶液以及空白溶劑各10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，結(jié)果顯示空白溶液對樣品測定無干擾，對照品和供試品溶液中各組分離良好，詳見圖1。

A.對照品；B.供試品 1.果糖(fructose);2.葡萄糖(glucose);3.蔗糖(sucrose);4.麥芽糖(maltose)圖1 HPLC色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取混合對照品溶液適量，用水定量稀釋成系列測定溶液(其中果糖和葡萄糖濃度約為0.5、1、2、3、4、5 mg·mL-1；蔗糖濃度約為0.75、1.5、3、4.5、6、7.5 mg·mL-1；麥芽糖濃度約為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1)，各精密量取10 μL，注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖。

分別以各組分濃度為X軸，對應(yīng)的峰面積為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果詳見表1標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果表 。

2.6 檢測限與定量限 取“2.5”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線最小濃度溶液稀釋合適倍數(shù)后進(jìn)樣，按信噪比(S/N)為3∶1計(jì)算，果糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖的方法檢測限分別為0.08、0.10、0.13、0.21 μg·g-1。按按信噪比(S/N)為10:1計(jì)算，以上組分的方法定量限分別為0.26、0.33、0.45、0.71 μg·g-1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果表

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液(其中果糖和葡萄糖濃度約為2 mg·mL-1,蔗糖濃度約為3 mg·mL-1,麥芽糖濃度約為1.0 mg·mL-1)，注入液相色譜儀測定，連續(xù)進(jìn)樣6次(n=6)，依法測定，以峰面積為考察指標(biāo)，測得果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖峰面積RSD分別為1.5%、1.0%、0.6%、1.1%，說明進(jìn)樣精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品T9(批號(hào)：20180913)適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，測得果糖、葡萄糖和蔗糖的平均含量分別為 9.31%、9.54%、25.70%，RSD分別為1.78%、2.09%、1.91%。麥芽糖均未檢出。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品T9適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積RSD分別為1.9%、1.5%、2.4%。說明供試品溶液24 h穩(wěn)定性良好。

2.10 回收率試驗(yàn) 取樣品T9適量，精密稱定6份，分別置10 mL量瓶中，分別精密加入果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對照品適量，用水稀釋至刻度，搖勻，依法測定，計(jì)算回收率，結(jié)果詳見表2。

2.11 樣品含量測定 取3批不同廠家樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組分含量，結(jié)果詳見表3 樣品測定結(jié)果比較。

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本文采用乙腈-水作為流動(dòng)相，當(dāng)提高水相比例時(shí)有利于糖類的溶解，峰形比較尖銳，但不利于各組分的分離。而增加有機(jī)相會(huì)使峰形變寬，分析時(shí)間延長，通過分別采用乙腈-水(80∶20、75∶25、70∶30)3種比例流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)乙腈-水比例為 75∶25時(shí)，各組分完全分離，峰寬較小，分析時(shí)間適中，因此選擇流動(dòng)相比例為乙腈-水 (75∶25)進(jìn)行試驗(yàn)。除此還分別考察了不同流速、柱溫對試驗(yàn)結(jié)果的影響。分別采用0.8、1.0、1.2 mL·min-13種流速和 30、35、40 ℃ 3種柱溫來考察其對試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示當(dāng)流速為1.0 mL·min-1保留時(shí)間合適，分離度較好，因此選擇流速為1.0 mL·min-1。而柱溫對保留時(shí)間、峰寬和分離度影響相對不大，為了進(jìn)一步減少溫差引起的波動(dòng)，故選擇檢測器的溫度(35 ℃)作為柱溫。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果表

表3 樣品測定結(jié)果比較

3.2 樣品測定結(jié)果分析 3批不同廠家樣品中，均未檢測出麥芽糖，蔗糖含量分別為31.34%、30.15%、25.70%，均遠(yuǎn)低于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)處方中蔗糖的含量(60%或45%)。除此，3批樣品中均檢測出葡萄糖和果糖，且葡萄糖和果糖含量相當(dāng)，考慮可能是蔗糖的水解產(chǎn)物。蔗糖在酸環(huán)境下，加熱后易水解生成單糖(葡萄糖與果糖)[11]。濃維磷糖漿劑的pH在4～6范圍內(nèi)，隨放置時(shí)間的長短，此兩種單糖在糖漿劑中都或多或少存在。單糖具有還原性，可延緩某些易氧化藥物的氧化變質(zhì)。但單糖過多對糖漿劑的穩(wěn)定性也有一定影響。故對濃維磷糖漿劑在考察其蔗糖含量的同時(shí)，也應(yīng)考察儲(chǔ)存條件的影響，減少單糖的產(chǎn)生，保證其藥品質(zhì)量。