霧化丙三醇氣液界面云暴露對人肺上皮細胞的毒性

胡 玥，馮紅敏，盛云華，夭建華，管 瑩，唐黎明

(1. 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心云南省煙草化學重點實驗室，昆明 650231；2. 上海市食品藥品檢驗所藥理毒理室/藥物安全評價中心，上海 201203; 3. 國家藥品監(jiān)督管理局化學藥品制劑質(zhì)量分析重點實驗室，上海 201203)

丙三醇又名甘油，廣泛用于食品、制藥、化妝品和煙草等行業(yè)。丙三醇是吸入藥物的輔料之一，可作為吸入噴霧劑的助溶劑[1]，干粉吸入劑的賦形劑等[2]。電子煙在世界范圍內(nèi)日漸流行，丙三醇作為電子煙中的溶劑和保濕劑，需要進一步研究以充分評估其應用的安全性[3]。

目前，吸入毒理學研究仍以應用實驗動物進行口鼻式吸入染毒或整體暴露染毒為主[4]。相較于動物試驗的周期長、成本高、種屬差異等問題，體外細胞實驗方法耗時短，實驗條件可控性高。傳統(tǒng)的浸沒式條件下考察化合物對呼吸道上皮細胞的毒性，細胞被培養(yǎng)基完全浸沒[5]。對于吸入給藥或者電子煙的抽吸而言，浸沒并不能表征實際的生理情形，在體內(nèi)化合物是以氣溶膠的形式沉積在支氣管和肺泡上皮細胞表面。越來越多的研究開始引入更加接近生理狀態(tài)的體外毒性測試方法，諸如VITROCELL?氣液界面細胞暴露云系統(tǒng)(air-liquid interface cell exposure-cloud, ALICE-CLOUD)，用于評價單次或重復暴露后納米顆粒[6-8]和化學品[9]的對呼吸道細胞的毒性，以及吸入藥物的藥效[10]和吸收動力學[11]等。暴露系統(tǒng)與氣液界面培養(yǎng)的呼吸道上皮細胞聯(lián)用，可以將氣溶膠直接遞送到細胞表面，模擬體內(nèi)呼吸道上皮細胞與氣溶膠的相互作用方式[12]。

本研究應用氣液界面細胞暴露云系統(tǒng)，將不同濃度的丙三醇溶液暴露于氣液界面培養(yǎng)的肺腺癌細胞(A549)，模擬實際吸入丙三醇的暴露方式。用熒光素鈉表征云暴露系統(tǒng)的遞送性能，考察丙三醇暴露后細胞存活率，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)釋放和促炎癥因子白介素-6(interleukin-6， IL-6)表達的情況。通過體外細胞暴露快速評價丙三醇對呼吸道可能產(chǎn)生的毒性，為丙三醇在吸入藥物輔料和電子煙產(chǎn)品中的安全應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株A549人肺腺癌細胞，獲贈于復旦大學藥學院。

1.2 試劑與儀器丙三醇(華寶食用香精香料有限公司)；熒光素鈉(Sigma，批號BCBV8193)；脂多糖(LPS，Sigma，批號028M4094V)；Triton X-100(Sigma，批號SLBT2255)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，批號2042311)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Corning，批號26318001)；胎牛血清(FBS, Hyclone，批號DBC0520); 人IL-6 ELISA 試劑盒(BD，批號9038994)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所，批號PH599)。

VITROCELL Cloud Starter Kit體外細胞暴露系統(tǒng)(德國Vitrocell公司);Heracell VIOS 160i CO2培養(yǎng)箱(德國Thermo Scientific司)；BCM-1300A層流超凈臺(Airtech公司)；Vi-cell XR細胞活力測定儀(德國Beckman counter公司); TS100-F倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司); 7020全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)；SpectraMax M5 多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)；12 mm Transwell細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1溶液的配制 丙三醇溶液：用1% PBS配制成濃度為10%、6%、4%。熒光素鈉溶液：取熒光素鈉粉末，用PBS緩沖液配制成濃度為15 mg·L-1的工作溶液。將工作溶液逐級稀釋成濃度為0.3，0.15，0.075，0.038，0.019 mg·L-1的系列標準溶液，用鋁箔包裹避光，臨用現(xiàn)配。Triton X-100溶液：用PBS稀釋成0.2%的濃度。LPS溶液：取LPS粉末，用PBS配制成濃度為1 g·L-1的LPS儲備液，分裝后于-20 ℃凍存。臨用前，用DMEM培養(yǎng)基稀釋成1 mg·L-1。

1.3.2云暴露系統(tǒng)遞送效率測定 云暴露系統(tǒng)主要由暴露室、霧化頭、暴露底座和溫控水浴四部分組成(Fig 1)，其利用云沉降原理將液滴快速、有效和均勻地沉積到暴露室的底部。通過測定將200 μL熒光素納溶液(15 mg·L-1)遞送至12 mm Transwell小室中的量來表征云暴露系統(tǒng)的遞送效率。暴露前，在每個Transwell小室中加入400 μL PBS，用于收集霧化的熒光素鈉溶液。將暴露室安裝在暴露底座上，同時將霧化頭裝在暴露室的頂端。取200 μL熒光素鈉工作溶液至霧化頭中，啟動霧化器，記錄完全霧化200 μL所需的時間。霧化完成后，關閉霧化器，等待5 min使氣溶膠沉降完全。打開暴露室，用移液器輕輕吹打混合小室中的液體，取混合后的液體與熒光素鈉系列標準溶液，分別加入黑色96孔板中，50 μL/孔，n=4。采用熒光分光光度法(激發(fā)波長：483 nm;發(fā)射波長：525 nm)測定熒光強度。以熒光素鈉標準溶液的熒光強度值為Y軸，濃度為X軸，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線回歸，得到各小室中熒光素鈉的濃度，計算沉積在小室中的氣溶膠體積。

Vinsert=Cinsert×400 μL/15 mg·L-1

其中400 μL和15 mg·L-1分別代表小室中的PBS體積和霧化的熒光素鈉溶液的濃度。由此可以計算沉積因子fdep。

fdep=Vinsert×Abase/(200 μL×Ainsert)

Abase和Ainsert分別是暴露底座的面積(92.04 cm2)和Transwell小室的底面積(1.12 cm2)；200 μL是加入霧化頭中的熒光素鈉溶液的體積。

Fig 1 Schematic diagram of VITROCELL? Cloud Starter Kit aerosol exposure system

1.3.3細胞氣液界面培養(yǎng) A549細胞采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基， 在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至約80%時進行消化傳代。將A549細胞以8×105個/mL的密度接種至12 mm Transwell小室中，頂側為0.5 mL細胞懸液，底側加1.0 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，細胞形成了致密單層。除去細胞頂側的培養(yǎng)基，同時將底側的培養(yǎng)基減少至0.5 mL，以降低培養(yǎng)基對細胞的壓力，防止培養(yǎng)基從底側向頂側滲漏。轉換成氣-液界面培養(yǎng)，僅從底側通過Transwell的膜孔向細胞提供培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h后，進行氣液界面暴露。

1.3.4丙三醇氣液界面暴露 細胞氣液界面暴露條件與遞送效率測定類似，將云暴露系統(tǒng)放置在生物安全柜中，并用75%乙醇滅菌，所有步驟均在無菌條件下操作。暴露前將細胞用PBS洗2次，放入暴露底座。將200 μL陰性對照溶液(1% PBS)和不同濃度的丙三醇溶液(4%，6%和10%)分別加入霧化頭中，霧化約持續(xù)25 s, 等待5 min讓氣溶膠在暴露室中逐漸沉降至細胞表面(n=4)。取出細胞，轉移到新的預先加好0.5 mL無血清培養(yǎng)基的12孔板中，37 ℃下繼續(xù)孵育24 h。

1.3.5CCK-8法測定細胞存活率 使用CCK-8試劑盒測定細胞存活率。將CCK-8溶液與無血清培養(yǎng)基混合(1 ∶10)，并加入Transwell小室的頂側，200 μL/孔。在37 ℃孵育20 min后，加入96孔板，100 μL/孔，用酶標儀測定450 nm處的吸光度，計算細胞存活率。

1.3.6LDH細胞毒性試驗 通過檢測細胞培養(yǎng)基中LDH來評估細胞毒性，收集培養(yǎng)液，4 000 r·min-1離心10 min, 上清液用全自動生化儀測定LDH濃度。 用0.2%的Triton X-100處理15 min的細胞作為LDH最大釋放量的對照(100%)。LDH相對釋放量代表樣品的細胞毒性，低于10%認為無細胞毒性。

1.3.7ELISA測定培養(yǎng)基中的IL-6 在Transwell頂側加入200 μL 1 mg·L-1LPS溶液，孵育24 h，作為陽性對照。ELISA測試前，陰性對照組和丙三醇各劑量暴露組分別在小室頂側加入200 μL PBS。將各組小室頂側與底側的液體混合后取出，4 000 r·min-1離心10 min, 取上清液按ELISA試劑盒說明書中的步驟測定培養(yǎng)基中釋放的促炎癥細胞因子IL-6的含量, 用酶標儀在450/570 nm處測定。

2 結果

2.1 云暴露系統(tǒng)的遞送效率通過將200 μL的熒光素鈉溶液霧化至Transwell小室中，分析暴露系統(tǒng)遞送的性能，以下是基于3次霧化的結果。霧化頭將200 μL溶液完全霧化約25 s，輸出速率為0.48 mL·min-1。在每個小室中平均沉積1.3 μL的溶液(Fig 2)，相當于厚度11.6 μm的液膜，兩個孔之間差異為5.2%。2個小室共沉積2.6 μL，考慮到小室僅覆蓋暴露室底部表面積的2.4%(=1.12 cm2×2/92.04 cm2×100%)，通過底面積換算，沉降至暴露底座的溶液體積占所有霧化溶液體積的53.4%，因此平均沉積因子為(0.534±14.8)%(Fig 3)，其中14.8%代表遞送重復性。暴露后靜置5 min沉降完全，即釋放速率為0.2 μL/cm2·min-1(=1.3 μL/1.12 cm2/5 min)(Tab 1)。

Tab 1 Characteristic parameters of deposition doses

2.2 細胞存活率結果顯示，用0.2% Triton X-100裂解細胞作為陽性對照，與對照組相比存活率顯著降低(P<0.05)。暴露4%、6%和10%的丙三醇后細胞存活率均高于100%，與對照組相比差異均無顯著性，且隨著劑量增加有逐漸升高的趨勢(Fig 4)。在本試驗條件下，3種濃度的丙三醇氣溶膠均對氣液界面培養(yǎng)的A549的存活率無影響。

Fig 2 Deposition volume in each s,n=3)

Fig 3 Deposition factor of each insert(n=3)

Fig 4 Cell viability of A549 cells after aerosolized delivery of glycerol at ALI *P<0.05 vs control

2.3 細胞毒性用0.2% Triton X-100裂解細胞作為陽性對照，與對照組相比LDH的釋放顯著增加(P<0.05)。與對照組相比，暴露4%，6%和10%的丙三醇LDH釋放量差異無顯著性(P>0.05)，且均低于5% (Fig 5)。因此，在本試驗條件下，3種濃度的丙三醇氣溶膠均對氣液界面培養(yǎng)的A549均無顯著的細胞毒性。

Fig 5 Cytotoxicity of glycerol aerosol in ALI *P<0.05 vs control

2.4 IL-6釋放量在頂側加入LPS(1 mg·L-1)作為陽性對照。用云暴露系統(tǒng)分別將4%，6%和10%的丙三醇溶液霧化至細胞表面，培養(yǎng)基中的IL-6釋放量有隨劑量逐漸升高的趨勢，但與對照組相比差異均無顯著性(P>0.05)。陽性對照組的IL-6釋放量明顯增加(P<0.05)(Fig 6)。

Fig 6 Effect of aerosolized glycerol on expression of IL-6 in A549 *P<0.05 vs control

3 討論

迄今為止，大部分體外細胞毒性試驗均是在傳統(tǒng)的浸沒式培養(yǎng)條件下開展的，化合物以溶液或混懸液的形式直接加入培養(yǎng)基中，使細胞浸沒在液體環(huán)境中[5]。但對于研究可吸入物質(zhì)對呼吸道的不良反應而言，需要模擬呼吸道細胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境，再將細胞暴露于化合物氣溶膠中。而細胞氣液界面培養(yǎng)，進而通過暴露裝置進行氣液界面暴露的方式更加接近實際體內(nèi)呼吸道細胞暴露于化合物氣溶膠的狀態(tài)[13,14]。人肺腺癌上皮細胞株A549具有肺泡II型上皮細胞的特征，是體外研究可吸入化合物生物效應的經(jīng)典模型細胞[15]。

本研究首次應用Vitrocell 云暴露系統(tǒng)，將A549細胞氣液界面暴露于丙三醇氣溶膠中。細胞在多孔膜上生長，僅從底側的培養(yǎng)基中獲得營養(yǎng)。試驗過程中，丙三醇溶液霧化形成的氣溶膠直接與細胞表面接觸，模擬吸入藥物給藥或電子煙抽吸的方式，評估丙三醇氣溶膠的細胞暴露安全性。云暴露系統(tǒng)操作簡單，暴露劑量準確，能夠?qū)⒈既芤红F化后的氣溶膠有效遞送至細胞表面。遞送效率高(每次暴露僅5 min)，沉積率為53.4%，重復性(14.8%)和孔間差異(5.2%)等性能良好。

在全面表征系統(tǒng)的遞送性能后，通過CCK-8法考察丙三醇暴露后對細胞存活率的影響，CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物(formazan)，生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶標儀在450 nm波長處測定光吸收值，可以間接反映活細胞數(shù)量。通過暴露后24 h測定釋放至底側培養(yǎng)基中的LDH來評估霧化丙三醇對氣液界面培養(yǎng)的A549細胞的毒性，該酶從細胞質(zhì)滲出是細胞膜損傷的標志。在本研究的試驗條件下，除陽性對照0.2% Triton X-100外，所有濃度的丙三醇溶液霧化后均未引起顯著的細胞毒性。炎癥因子是吸入安全性評價的生物學終點之一，介導慢性炎癥性肺病的發(fā)生。其中IL-6是急性和慢性炎癥重要的標志物之一，在全身性炎癥和慢阻肺(COPD)的發(fā)病機理中起著重要的作用[16]。本研究在暴露后24 h收集培養(yǎng)基并進行ELISA分析，測定促炎癥細胞因子IL-6的釋放，LPS作為陽性對照，來研究暴露丙三醇氣溶膠后氣液界面培養(yǎng)的A549的炎癥反應。在丙三醇暴露后的細胞培養(yǎng)基中，IL-6隨劑量的增加略有上升的趨勢，但于陰性對照相比，差異無統(tǒng)計學意義。

丙三醇暴露后，A549細胞的存活率、細胞毒性、促炎癥細胞因子IL-6等指標變化不顯著，可能是由于本研究的暴露時間較短，僅考察細胞單次暴露之后24 h的毒性反應，屬于丙三醇暴露后的急性反應。因此，后續(xù)研究將進一步開展丙三醇體外細胞重復暴露毒性研究，以期更全面的評估丙三醇吸入暴露的安全性。