基于抗氧化能力檢測(cè)白藜蘆醇產(chǎn)品中反式異構(gòu)體含量的方法

王思淵，郭 彬，陳 蓉，郝 剛*，梅建鳳

(1 蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215000；2 浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，杭州 310014)

白藜蘆醇是一種作用廣泛的天然多酚類化合物，是在植物遭受外界脅迫時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素，主要存在于葡萄等漿果類植物中，目前已在100種植物中被發(fā)現(xiàn)。近年來的研究表明，白藜蘆醇具有多種生物活性和藥理作用，尤其在抗氧化、抗腫瘤和治療心血管疾病方面有非常顯著的作用，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品和保健品等領(lǐng)域[1-2]。白藜蘆醇能夠通過與自由基反應(yīng)來降低自由基活性，阻止自由基的進(jìn)一步鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達(dá)到清除自由基的效果[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇的強(qiáng)抗過氧化作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，由于反式結(jié)構(gòu)分子都位于一個(gè)平面，捕捉自由基后，表現(xiàn)出更加穩(wěn)定的狀態(tài)，反式構(gòu)型比順式構(gòu)型對(duì)Cu2+鰲合能力強(qiáng)，抑制誘導(dǎo)的低密度脂蛋白氧化作用也更為明顯[5]。在生物合成和應(yīng)用的產(chǎn)品中，白藜蘆醇往往以順式構(gòu)型和反式構(gòu)型混合的形式存在，因此，產(chǎn)品中反式構(gòu)型的含量檢測(cè)就變得尤為重要[6]。目前市售白藜蘆醇產(chǎn)品多不區(qū)分順反式異構(gòu)體，僅表述為白藜蘆醇純度?，F(xiàn)有順反式構(gòu)型分析的方法主要以特殊色譜條件下的高效液相色譜法為主，存在耗時(shí)長(zhǎng)、耗材昂貴等缺點(diǎn)[7-8]，目前尚無快速高通量分析方法的報(bào)導(dǎo)。本文利用白藜蘆醇順反式異構(gòu)體間抗氧化能力的差異，建立ABTS+·清除率法測(cè)定白藜蘆醇產(chǎn)品反式構(gòu)型的含量，為白藜蘆醇的推廣利用提供快速有效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Spectra Max Plus 384型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；XSE205型分析天平(梅特勒-托利多國際有限公司)；反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC純度均≥99%，Cayman Chemical有限公司)；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(ABTS法，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(ABTS法，西安赫特生物科技有限公司)；抗氧化檢測(cè)試劑盒(西格瑪試劑)；其余試劑均為市售分析純；5批次不同白藜蘆醇原料藥采購自市場(chǎng)。

1.2 溶液的配制

將ABTS溶液與氧化劑溶液等體積混合均勻，配制ABTS母液。ABTS母液室溫避光存放16 h后，以80%乙醇稀釋至A734為(0.7±0.05)，制成ABTS工作液。精密稱定反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶于80%的乙醇中制成對(duì)照品溶液。精密稱定5批次不同白藜蘆醇原料藥溶于80%的乙醇，配制成0.1 mmol/L的溶液，作為供試品。

1.3 白藜蘆醇順反式異構(gòu)體抗氧化能力測(cè)定

參照Miller等[9]和Rice-Evans等[10]的研究方法，分別精密稱取反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶于80%的乙醇，配制成0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L的溶液。在96孔板上加入 200 μl 的ABTS工作液，加入10 μl樣品后，輕輕搖勻。室溫孵育6 min后，測(cè)定白藜蘆醇順反式異構(gòu)體各濃度A734，并按公式(1)計(jì)算ABTS+·清除率。

(1)

式(1)中：A1為樣品+ABTS 試劑的A734；A2為80%乙醇+ABTS 試劑的A734；A3為樣品+80%乙醇的A734。

1.4 白藜蘆醇異構(gòu)體含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與方法學(xué)研究

以0.1 mmol/L的反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制成體積比為0∶100、20∶80、50∶50、80∶20和100∶0的混合溶液，即混合溶液中反式白藜蘆醇含量比例分別為0%、20%、50%、80%和100%。按“1.3”所述方法測(cè)定各比例溶液ABTS+·清除率，以反式白藜蘆含量比例為橫坐標(biāo)，ABTS+·清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。以80%反式白藜蘆醇混合溶液作為樣品進(jìn)行方法學(xué)研究，考察反應(yīng)溶液的穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性。

1.5 白藜蘆醇產(chǎn)品含量檢測(cè)

將采購獲得的5批不同廠家的原料藥白藜蘆醇，精密配制成濃度為0.1 mmol/L的溶液，測(cè)定樣品的ABTS+·清除率，依據(jù)“1.3”中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由清除率計(jì)算出反式白藜蘆醇的濃度比例，再將比例乘以0.1 mmol/L，即可計(jì)算出樣品反式白藜蘆醇的含量。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇順反式異構(gòu)體抗氧化能力比較

不同濃度的順反構(gòu)型白藜蘆醇異構(gòu)體的ABTS+·清除率如圖1所示。在低濃度條件下，由于酶標(biāo)儀檢測(cè)限與試劑盒靈敏度的影響，測(cè)得的順反式白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率差異不大。隨著2種白藜蘆醇異構(gòu)體濃度的增加，測(cè)得的順反式白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率差異顯著，在濃度為0.1 mmol/L時(shí)，順式白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率為13.2%，反式白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率為81.5%，是前者的6.17倍。但隨著溶液濃度的進(jìn)一步提升，由于試劑盒反應(yīng)能力飽和，超出線性范圍，測(cè)得的順反構(gòu)型白藜蘆醇溶液ABTS+·清除率差異開始變小。故選定濃度為0.1 mmol/L的反式白藜蘆醇/順式白藜蘆醇混合溶液，構(gòu)建白藜蘆醇異構(gòu)體含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 白藜蘆醇順反異構(gòu)體的ABTS+·清除率曲線

2.2 白藜蘆醇異構(gòu)體含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按前文所述方法，測(cè)定濃度為0.1 mmol/L時(shí)，反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇混合液中不同反式異構(gòu)體含量比例溶液的ABTS+·清除率，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 不同含量比例的反式白藜蘆醇的ABTS+·清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2得出的反式白藜蘆醇含量比例與ABTS+·清除率之間的回歸方程為y=0.677x+11.26，R2=0.9943，說明兩者在反式白藜蘆醇含量比例0%～100%之間線性關(guān)系良好。依據(jù)這個(gè)回歸方程，只要測(cè)定白藜蘆醇樣品在濃度為0.1 mmol/L時(shí)的ABTS+·清除率，即可計(jì)算出反式白藜蘆醇的含量比例，比例乘以0.1 mmol/L，即可得到樣品中反式白藜蘆醇含量。如果樣品的ABTS+·清除率小于11.26%(橫坐標(biāo)為零時(shí)的縱坐標(biāo)值)，不適用本快速檢測(cè)方法測(cè)定。

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1溶液穩(wěn)定性考察

將配制好的ABTS工作母液與ABTS工作液室溫避光存放12、24、36和48 h，考察反應(yīng)溶液的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)配制好的ABTS工作母液室溫避光存放，在48 h內(nèi)穩(wěn)定。制成的ABTS工作液室溫避光存放，在24 h內(nèi)穩(wěn)定。由于白藜蘆醇順反式異構(gòu)體在光照條件下存在可逆互變反應(yīng)，建議供試品溶液臨用現(xiàn)配并避光保存。

2.3.2重復(fù)性試驗(yàn)

取80%反式白藜蘆醇混合溶液6份，按“2.1”所述方法測(cè)定，考察重復(fù)性。測(cè)得反式白藜蘆醇含量均值為79.5%，相對(duì)偏差為0.52%(n=6)。結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3耐用性考察

取80%反式白藜蘆醇混合溶液為供試品，用3種不同品牌試劑盒測(cè)定，考察方法耐用性。測(cè)得反式白藜蘆醇含量均值為79.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.77%，結(jié)果見表2，表明該方法耐用性良好。

表2 耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 白藜蘆醇產(chǎn)品中反式異構(gòu)體含量的檢測(cè)

按前文所述方法，測(cè)定了5個(gè)白藜蘆醇原料藥中反式白藜蘆醇的含量，結(jié)果見表3。從表3數(shù)據(jù)可以看出，測(cè)得的5個(gè)白藜蘆醇原料藥樣品中反式異構(gòu)體含量為其標(biāo)示量差值百分比均小于1%，說明通過測(cè)定白藜蘆醇產(chǎn)品的抗氧化能力，計(jì)算反式白藜蘆醇的含量的方法可行，可應(yīng)用于白藜蘆醇相關(guān)產(chǎn)品中反式構(gòu)型含量的檢測(cè)。

表3 白藜蘆醇原料藥中反式異構(gòu)體的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

現(xiàn)有的白藜蘆醇順反式構(gòu)型分析的方法主要以特殊色譜條件下的高效液相色譜法為主，存在耗時(shí)長(zhǎng)、耗材昂貴等缺點(diǎn)。由于白藜蘆醇順反式異構(gòu)體存在可逆互變反應(yīng)，耗時(shí)長(zhǎng)的分析方法不利于結(jié)果的準(zhǔn)確性，需建立快速高通量的分析方法。本文利用反式白藜蘆醇ABTS+·清除率與順式白藜蘆醇之間的差異性，建立了濃度均為0.1 mmol/L條件下，兩者混合溶液中反式異構(gòu)體含量比例與ABTS+·清除率之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。只要測(cè)定樣品在濃度為0.1 mmol/L時(shí)的ABTS+·清除率，再由回歸方程計(jì)算出反式白藜蘆醇的含量比例，比例乘以0.1 mmol/L，即可得到樣品中反式白藜蘆醇含量。結(jié)果表明，本研究建立的方法具有較高的穩(wěn)定性、重復(fù)性和耐用性。用該方法測(cè)定了5個(gè)白藜蘆醇原料藥產(chǎn)品，結(jié)果與它們標(biāo)示量的差值百分比均小于1%，說明該方法能夠快速可靠、重復(fù)性好地測(cè)定白藜蘆醇產(chǎn)品反式異構(gòu)體的含量。因此，本研究為白藜蘆醇反式異構(gòu)體快速檢測(cè)方法的建立提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。