ELISA法檢測中藥材及中藥飲片真菌毒素的探討

柯 穎，徐昕怡，洪小栩*

(1 中國藥科大學(xué)，南京 210009；2 國家藥典委員會(huì)，北京 100061)

隨著我國中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，中藥材與飲片使用人群范圍日益擴(kuò)大，市場需求不斷增長。由于產(chǎn)地分布廣、加工企業(yè)多、制備工藝各異及成分復(fù)雜多變等，給中藥材與飲片的質(zhì)量控制帶來極大的挑戰(zhàn)，保障中藥材與飲片安全性顯得尤為重要。中藥材與飲片的安全性問題，涉及內(nèi)源性有毒成分和外源性有毒有害物質(zhì)污染。內(nèi)源性安全考慮主要針對中藥自身含有的毒性成分，如生物堿類、苷類、萜類、金屬元素類等，可引起肝損傷、腎毒性、呼吸系統(tǒng)損害等不良反應(yīng)。有毒中藥材與飲片治療窗較窄，在臨床用藥方面有一定的風(fēng)險(xiǎn)，需要嚴(yán)格控制這些已知毒性成分的含量。外源性污染主要涉及重金屬及有毒有害元素、農(nóng)藥殘留，特別是有機(jī)氯類農(nóng)藥，此類物質(zhì)可在人體內(nèi)累積，對人體的正常功能造成傷害。中藥材與飲片微生物污染問題也不容忽視，特別是在生產(chǎn)以及加工儲(chǔ)運(yùn)過程中，如不采取有效措施加以控制，極易造成外源微生物的污染，其中可能存大量致病菌和某些真菌毒素，導(dǎo)致中藥材與飲片存在一定的安全性風(fēng)險(xiǎn)隱患，給臨床使用帶來安全性問題。

1 真菌毒素污染控制

中藥材與飲片的種植、采收、炮制、運(yùn)輸、貯藏等各環(huán)節(jié)都有可能引入或加重真菌毒素的污染。研究發(fā)現(xiàn)，目前存在150余種真菌，可產(chǎn)生的真菌毒素約有400種，其中約有200種可對人和動(dòng)物造成危害[1]。這些真菌毒素一般表現(xiàn)為慢性毒性和協(xié)同性，毒素在人體內(nèi)能夠累積，造成DNA損傷，具有致癌性、致突變性或致畸性等，一旦攝入將嚴(yán)重威脅到人類生命健康[2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將黃曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)認(rèn)定為 ⅠA 級(jí)危險(xiǎn)物，其中毒性最強(qiáng)的黃曲霉毒素B1(AFB1)半數(shù)致死量為0.36 mg/kg體重[3]。根據(jù)聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)(JECFA)規(guī)定的每日耐受攝入量[tolerable daily intake, TDI，μg/(kg·d)]，玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)、伏馬毒素(Fumonisins, FB)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)的TDI分別為0.2、2.0、17.1和1.0 μg/(kg·d)[4]。

為保障中藥材、飲片或植物藥使用安全，各國都極其重視對真菌毒素污染的控制。中國、日本和歐洲等藥典均對易霉變的中藥材與飲片制定了相應(yīng)真菌毒素檢測方法和限量標(biāo)準(zhǔn)，在控制種類上主要是針對真菌毒素中毒性較大、危害性較高的AFT、ZEN、FB、OTA和DON等(見表1)。

表1 國內(nèi)外藥典對真菌毒素檢測的收載情況

①:AFs=AFB1+AFB2+AFG1+AFG2；
②：*、**、***和****分別表示測定相應(yīng)品種AFT、ZEN、FB和OTA的含量。

目前，國內(nèi)外普遍采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS)檢測毒素(見表2)?！吨袊幍洹?015年版在采用HPLC法基礎(chǔ)上，增加HPLC-MS檢測技術(shù)，進(jìn)一步強(qiáng)化檢測手段，提升檢測能力，可檢測60余種真菌毒素。

表2 中藥材真菌毒素檢測方法比較

2 真菌毒素的檢測(ELISA法)

酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法是基于免疫學(xué)建立的檢測技術(shù)。其原理是抗原與抗體的特異性結(jié)合。將抗原或抗體吸附在固相載體表面，抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶形成酶結(jié)合物，根據(jù)加入底物顯色程度進(jìn)行結(jié)果判定[5]。ELISA法由于靈敏度高，特異性好，大分子蛋白質(zhì)類物質(zhì)可作為抗原免疫動(dòng)物來獲得特異性抗體，因此在生物藥檢測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。ELISA法可分為6種類型(見表3)，其中常用的是雙抗原夾心法和間接法。一般小分子物質(zhì)不具有免疫原性，不適宜ELISA法建立。真菌毒素相對分子質(zhì)量低且僅含單個(gè)抗原決定簇，屬于半抗原。但將真菌毒素通過共價(jià)鍵與大分子載體蛋白偶聯(lián)[6]，可形成全抗原，用于制備高特異性的單克隆抗體，使得ELISA法用于真菌毒素的檢測成為可能。

表3 ELISA法的檢測方法分類

ELISA法檢測靈敏度可達(dá)到pg級(jí)別，具有操作簡便、檢測時(shí)間短、檢測通量大、對檢測環(huán)境和設(shè)備要求不高的特點(diǎn)，更適合中藥材與飲片中真菌毒素檢測的實(shí)際需求[7]。

3 ELISA法與HPLC法比較

HPLC法是各國藥典普遍采用的真菌毒素檢測方法。其原理是以高壓條件下的液體為流動(dòng)相，并采用固相萃取柱的色譜分離技術(shù)，以反向高效液相色譜法最為常用[8]。通過計(jì)算色譜峰的面積來確定其含量。近年來，HPLC-MS或LC-MS/MS檢測由于具有極強(qiáng)的特異性已被用于多種真菌毒素的檢測[9]。

ELISA法與HPLC法在前處理和檢測過程中對供試品的處理和操作不同，對測定結(jié)果的影響程度也有所差別。針對真菌毒素檢測方法的應(yīng)用，目前也有不少研究機(jī)構(gòu)采用ELISA法檢測試劑盒與HPLC法進(jìn)行比對，以進(jìn)一步對ELSIA法在真菌毒素檢測的適用性進(jìn)行評估。

3.1 供試品的前處理

合理的前處理過程是檢測可靠性的前提。由于真菌毒素殘留水平較低，中藥材與飲片種類繁多，基質(zhì)復(fù)雜，且其來源及生產(chǎn)企業(yè)加工處理方式各異，無論采用哪種檢測方法，無疑都將面臨極大的挑戰(zhàn)。前處理技術(shù)主要包括真菌毒素的提取、純化、富集等過程。提取溶劑的選擇主要取決于待測毒素的種類、性質(zhì)以及待測毒素在提取溶劑中的溶解度和非測定成分在提取溶劑中的分配系數(shù)，以便最大限度地提取目標(biāo)毒素。真菌毒素一般在酸性或中性條件下穩(wěn)定，所以通常需要提高溶劑體系中水相的pH值。常見的提取方法有一步提取法、QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)法、加速溶劑萃取法等。一步提取法具有操作簡單、成本低等特點(diǎn)，但是易引入雜質(zhì)，適用于靈敏度較高、對供試品前處理要求較低的質(zhì)譜檢測方法。QuEChERS法是近年來國際上最新開發(fā)的一種農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù),其有機(jī)試劑用量少，準(zhǔn)確度和精密度高，可實(shí)現(xiàn)對中藥材與飲片多種真菌毒素的同時(shí)提取和凈化，適用于同一藥材多種真菌毒素的同時(shí)檢測。

純化與富集過程是為了獲得更高的選擇性和靈敏度，除去干擾雜質(zhì)(如脂類、蛋白質(zhì)、色素等)，保留待測組分。目前常用的純化方法有免疫親和柱凈化法、固相萃取柱凈化法及柱色譜法等，其中免疫親和柱法凈化特異性強(qiáng)，純化效果好，因此應(yīng)用最為廣泛[10]。ELISA法與HPLC法前處理過程的比較見表4。

表4 ELISA與HPLC兩種方法在供試品前處理過程的比較

3.2 方法比較

已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，采用ELISA法和HPLC法對加標(biāo)檢測供試品中真菌毒素的含量進(jìn)行測定，通過供試品回收率統(tǒng)計(jì)結(jié)果比對，對兩個(gè)方法的準(zhǔn)確性和抗干擾性進(jìn)行綜合評估(見表5)。

表5 ELISA法與HPLC法測定真菌毒素回收率結(jié)果的對比[11-16]

從發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果看，對于某些藥材，ELISA法的回收率和精密度結(jié)果與HPLC法檢測結(jié)果基本接近，有些檢測供試品的回收率甚至高于HPLC法，說明ELISA法具有較好的特異性?；厥章屎蜋z測偏差總體均在可接受范圍之內(nèi)，可用于中藥材與飲片真菌毒素的檢測。

ELISA法存在的供試品回收率超過100%的情況，表明供試品在前處理和分析過程中損失較少，也有可能存在供試品內(nèi)源性和外源性物質(zhì)干擾，或者存在一定程度的同類型毒素免疫交叉反應(yīng)。HPLC法的回收率偏低可能是由于供試品提取液經(jīng)免疫親和柱純化后有損失，或者是柱后洗脫時(shí)，沒有處理好控制流速，造成洗脫不完全[17]。在結(jié)果準(zhǔn)確度的比較上，總體上，HPLC法的精密度比ELISA法高，說明HPLC法的重復(fù)性好，準(zhǔn)確度較高，穩(wěn)定性好。

3.3 應(yīng)用的考慮

針對檢測供試品干擾因素的不確定性，ELISA法應(yīng)建立適用性評估技術(shù)要求，以保障檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。一是，建立適用性評估方法，供試品在檢測前應(yīng)通過檢測加標(biāo)回收率，確定干擾是否可接受的范圍，對供試品的方法適用性進(jìn)行確認(rèn)。對內(nèi)源性或外源性物質(zhì)干擾較大的供試品，可能存在不適用的問題。二是，為進(jìn)一步加強(qiáng)檢測結(jié)果的可靠性，可根據(jù)每次檢測供試品加標(biāo)回收率，建立相應(yīng)的干擾影響系數(shù)，對檢測結(jié)果進(jìn)行糾偏，排除干擾。三是，進(jìn)一步完善和優(yōu)化供試品前處理，包括采用固相萃取柱，并優(yōu)化洗脫條件及相關(guān)參數(shù)設(shè)置。四是，規(guī)范正確的操作，減少人為誤差，保障結(jié)果的可靠性。

4 應(yīng)用前景

隨著當(dāng)前藥品全生產(chǎn)鏈條、全生命周期管理的理念的發(fā)展，加強(qiáng)源頭和生產(chǎn)過程的檢測，最大程度避免和降低中藥材與飲片中真菌毒素的殘留至關(guān)重要。建立簡便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、成本低廉的檢測方法顯得尤為必要。雖然目前中藥材與飲片真菌毒素的檢查還是以色譜法為主，但是這些分析方法操作復(fù)雜，設(shè)備昂貴，檢測環(huán)境要求高，檢測效率低，檢測成本高，而且檢測人員要熟悉儀器的操作，不適于大量樣品的篩查及快速檢測，制約了真菌毒素控制的實(shí)際應(yīng)用?！吨袊幍洹?020年版擬納入真菌毒素檢測ELISA法，為有效控制中藥材與飲片真菌毒素污染又提供了一種技術(shù)選擇。

ELISA法的應(yīng)用為未來中藥材與飲片真菌毒素快檢和篩查提供了廣闊的發(fā)展前景。免疫膠體金技術(shù)是近年來在酶聯(lián)免疫法的技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型快速檢測技術(shù)[18]。膠體金技術(shù)包括膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫技術(shù)和固相層析技術(shù)[19]。當(dāng)免疫膠體金顆粒遇到相應(yīng)的真菌毒素抗原時(shí)會(huì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生聚集，在適宜的條件下達(dá)到一定的密度，可產(chǎn)生肉眼可見的顏色[20]。免疫膠體金技術(shù)適用于現(xiàn)場大通量快速檢測，樣品處理簡單，5～10分鐘就可以看到檢測結(jié)果。膠體金試紙條作為定性檢測，操作簡便、快捷，無須昂貴設(shè)備，操作人員不需要進(jìn)行特殊培訓(xùn)、檢測成本更加低廉，可應(yīng)用于中藥材及中藥飲片真菌毒素的初篩檢測，極大方便了基層的實(shí)際應(yīng)用和質(zhì)量控制[21]，在實(shí)際監(jiān)測中更具實(shí)用價(jià)值。

5 小結(jié)

我國的中藥材與中藥飲片市場急需進(jìn)行規(guī)范管理，制定嚴(yán)格、完善的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也刻不容緩。要實(shí)現(xiàn)中藥產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展，必須從源頭抓起，首先要提高中藥材質(zhì)量。ELISA技術(shù)運(yùn)用于中藥材質(zhì)量檢測的發(fā)展，為中藥材質(zhì)量檢測提供了一種重要手段。ELISA法簡便、快速，檢測覆蓋面大，節(jié)約了大量的人工成本，常用于定性分析和前期的大量初篩；免疫膠體金技術(shù)以其特異性強(qiáng)，檢測高效，作為高通量檢測方法，可用于現(xiàn)場篩選大量樣品，在中藥材及中藥飲片質(zhì)量控制領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)可根據(jù)實(shí)際需要，采用新手段對中藥材與飲片進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。