脂聯(lián)素對高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤生長的影響

何 珊 鄧 露 蔡志福 張潔清 李 力

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科；422000 邵陽 2邵陽市中心醫(yī)院影像科

子宮內(nèi)膜癌是全球第六大常見惡性腫瘤，位列女性癌癥死亡的第14位，近年來發(fā)病呈年輕化趨勢［1］。子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗是增加子宮內(nèi)膜癌發(fā)病風(fēng)險的重要分子機(jī)制之一，而肥胖不僅可引起胰島素抵抗，也可誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生［2-3］。脂聯(lián)素（adiponectin，APN）是由脂肪細(xì)胞特異分泌的一種生物活性分子，與肥胖、胰島素抵抗等多種疾病有關(guān)，是胰島素的增敏劑［4］。近年來，研究報道脂聯(lián)素可能通過改變激素和細(xì)胞因子水平間接影響與肥胖相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、白血病與結(jié)直腸癌等，其中循環(huán)中脂聯(lián)素水平與血清中的胰島素濃度呈負(fù)相關(guān)，從而增加患癌風(fēng)險［5-6］。但是脂聯(lián)素對存在胰島素抵抗的子宮內(nèi)膜癌的作用尚不明確。本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)裸鼠胰島素抵抗后在體內(nèi)接種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，構(gòu)建胰島素抵抗及子宮內(nèi)膜癌移植瘤雙重動物模型，探討脂聯(lián)素對裸鼠移植瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1B由北京大學(xué)人民醫(yī)院饋贈，接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。40只SPF級BALB/C雌性裸鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物中心，3～4周齡，體重11～12 g。飼養(yǎng)于SPF級動物房，實驗程序由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素購自碧云天公司；脂肪供能占45.0%的高脂飼料（high-fat diet，HFD）購自北京博泰宏達(dá)飼料有限公司；脂肪供能占12.9%的普通飼料（normal diet，ND）購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；鼠脂聯(lián)素購自Biovendor Technology公司；生物合成人胰島素注射液購自巴西諾和諾德公司；小鼠甘油三脂ELISA試劑盒、小鼠胰島素ELISA試劑盒、小鼠總膽固醇ELISA試劑盒均購自上海華壹生物有限公司；小鼠血脂聯(lián)素ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 雙重裸鼠模型的建立及分組

40只裸鼠普食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為高脂組和普食組，每組20只，繼續(xù)喂養(yǎng)HFD和ND，其余條件保持一致。每日記錄裸鼠的平均進(jìn)食量和平均能量攝入量，每周記錄裸鼠體重變化情況。第11周，將處于對數(shù)生長期的0.2 mL HEC-1B細(xì)胞懸液（5×107/mL）接種于裸鼠左腹皮下。瘤體長至0.5 cm時，將高脂組荷瘤裸鼠隨機(jī)分為HFD+APN組和HFD組，普食組荷瘤裸鼠隨機(jī)分為ND+APN組和ND組，每組均為10只。HFD+APN組和ND+APN組荷瘤裸鼠以 25 μg·kg-1·d-1劑量腹腔注射脂聯(lián)素，ND 組和 HFD組荷瘤裸鼠以1.25 mL·kg-1·d-1劑量注射0.9%氯化鈉，連續(xù)給藥2周，隔日1次。每3 d測量裸鼠體重和移植瘤的長徑（a）和短徑（b），繪制腫瘤體積（V=0.5×a×b2）生長曲線。14周后以摘眼球取血法處死裸鼠，分離瘤體，稱重，測量移植瘤體積。

1.3 糖代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測

高脂組和普食組喂養(yǎng)10周后，禁食6 h，尾靜脈取血檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），兩組分別隨機(jī)抽取10只裸鼠，測定空腹血胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）。采用穩(wěn)態(tài)模型評估法評估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），計算方法：HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。然后依次腹腔注射50%葡萄糖注射液（按2 g葡萄糖/kg劑量）和人胰島素注射液（按0.75 U/kg劑量），進(jìn)行糖耐量試驗和胰島素耐量試驗，分別于0 min、30 min、60 min、90 min、120 min 測定裸鼠血糖值并繪制血糖曲線。14周后，按照ELISA試劑盒操作方法測定HFD+APN組、HFD組、ND+APN組和ND組荷瘤裸鼠的FBG、FINS、血清甘油三脂（triglyceride，TG）、血清總膽固醇（total cholesterol，TC）和血清脂聯(lián)素水平，同時計算HOMA-IR。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey檢驗。以雙則P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般情況

40只裸鼠普食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，高脂組和普食組裸鼠平均體重比較無統(tǒng)計學(xué)差異［（11.54±0.67）g vs（11.55±0.61）g，t=0.074，P=0.941］。分別予以 HFD 和ND喂養(yǎng)10周后，高脂組裸鼠日平均進(jìn)食量明顯低于普食組［（2.78±0.50）g vs（3.12±0.41）g，t=3.589，P=0.001］，但日平均能量攝入量高于普食組［（54.78±9.77）kJ vs（45.57±6.05）kJ，t=5.550，P＜0.001］。與普食組比較，高脂組裸鼠平均體重較大［（22.16±1.14）g vs（24.41±1.00）g，t=6.627，P＜0.001］，且高脂組裸鼠體長稍大于普食組，體形較大，皮下脂肪豐滿。見圖1。

圖1 高脂組和普食組裸鼠的生長情況Fig.1 Growth of nude mice in the high-fat diet group and the normal diet group

隨后兩組裸鼠接種子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞，5 d后均可觸及綠豆大小邊界清晰的結(jié)節(jié)樣腫物并逐漸增大，成瘤率均為100%，表明成功構(gòu)建裸鼠人子宮內(nèi)膜癌移植瘤模型。

2.2 高脂飲食對裸鼠胰島素抵抗的影響

10周后，高脂組裸鼠的FBG、FINS和HOMA-IR均明顯高于普食組［（4.92±0.67）mmol/L vs（3.67±0.66） mmol/L，t=4.209，P=0.001；（24.03±3.28） mU/L vs（18.98±1.75）mU/L，t=4.296，P=0.001；5.28±1.16 vs 3.10±0.68，t=5.127，P＜0.001］。腹腔注射葡萄糖 30 min、60 min、90 min、120 min后，高脂組裸鼠的血糖水平均明顯高于普食組（均P＜0.05），且在30 min時血糖達(dá)高峰，120 min后仍高于正常水平，血糖曲線下面積（AUC）大于普食組（t=11.401，P＜0.001），見圖 2A；腹腔注射胰島素 30 min、60 min、90 min、120 min 后，高脂組的血糖水平均明顯高于普食組（均P＜0.01），60 min時血糖水平較空腹時下降17.7%，普食組血糖則下降了30.7%，AUC亦大于普食組（t=12.468，P＜0.01），見圖2B。

圖2 高脂組和普食組裸鼠的胰島素抵抗情況Fig.2 Insulin resistance in nude mice of high-fat diet group and the normal diet group

2.3 脂聯(lián)素對裸鼠移植瘤生長的影響

脂聯(lián)素處理后，HFD+APN組和ND+APN組荷瘤裸鼠移植瘤平均瘤體質(zhì)量和體積增長速度均低于相應(yīng)對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

2.4 脂聯(lián)素對荷瘤裸鼠糖代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

14周后，HFD組和HFD+APN組荷瘤裸鼠的FINS、HOMA-IR、TC和TG均較ND組和ND+APN明顯升高（均 P＜0.01），且 HFD組高于HFD+APN組（均P＜0.01），而ND組和ND+APN組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。HFD+APN組和HFD組的血脂聯(lián)素水平均低于其相應(yīng)對照組（AD+APN組和ND組），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表4。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示肥胖、高血壓、糖尿病是誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌的高危因素［7-8］。一項針對早期子宮內(nèi)膜癌患者進(jìn)行的回顧性研究中，與身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）＜40 kg/m2的患者相比，病態(tài)肥胖（BMI≥40 kg/m2）患者的生存期明顯縮短，其中67%死于肥胖相關(guān)的非癌癥疾?。?］。肥胖誘發(fā)癌癥的機(jī)制主要有以下方面［10-11］：⑴改變相關(guān)脂肪因子的表達(dá)量；⑵引起胰島素抵抗；⑶產(chǎn)生大量炎性因子，誘導(dǎo)慢性低度炎癥狀態(tài)；⑷脂肪細(xì)胞增生、肥大，導(dǎo)致缺氧，加重炎癥狀態(tài)；⑸為腫瘤細(xì)胞增殖提供能量。研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食可以導(dǎo)致肥胖、高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗［12-13］，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［14］。BANDERA 等［15］報道子宮內(nèi)膜癌發(fā)生風(fēng)險增加可能與總脂肪、飽和脂肪和動物脂肪攝入有關(guān)。由此推測高脂飲食、肥胖導(dǎo)致的機(jī)體脂肪細(xì)胞因子分泌異常、胰島素抵抗可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。本研究分別采用脂肪供能占45.0%的高脂飼料和脂肪供能占12.9%的普通飼料喂養(yǎng)裸鼠10周，發(fā)現(xiàn)高脂組裸鼠的平均體重、體長和HOMA-IR均明顯大于普食組，隨后在胰島素抵抗裸鼠中皮下接種子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞，5 d后均可觸及腫物，且高脂組裸鼠移植瘤體積及質(zhì)量均高于普食組，說明本研究成功構(gòu)建了胰島素抵抗及子宮內(nèi)膜癌移植瘤雙重動物模型，且高脂飲食可誘導(dǎo)裸鼠糖耐量受損及胰島素抵抗，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞生長，與上述文獻(xiàn)報道一致。

表4 14周后各組荷瘤裸鼠糖代謝相關(guān)指標(biāo)水平Tab.4 Metabolic indicators of nude mice with endometrial cancer in each group after feeding 14 weeks

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞所分泌的若干細(xì)胞因子中含量最高的，濃度為3～30 μg/mL，約占血漿蛋白總量的0.01%［16］。脂聯(lián)素可直接通過抑制促血管生成因子或間接通過改善胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)從而影響腫瘤細(xì)胞增殖［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗小鼠可降低脂聯(lián)素受體的表達(dá)及脂聯(lián)素敏感性［5］，而低脂聯(lián)素水平會增加子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險［17］。為進(jìn)一探討脂聯(lián)素對子宮內(nèi)膜癌的影響，本研究在荷瘤裸鼠瘤體長至0.5 cm時腹腔注射脂聯(lián)素，結(jié)果ND+APN組和HFD+APN組的移植瘤體質(zhì)量和體積增長速度均明顯低于相應(yīng)對照組，進(jìn)一步比較各組中的血脂聯(lián)素水平發(fā)現(xiàn)，具有胰島素抵抗的荷瘤裸鼠血脂聯(lián)素水平較無胰島素抵裸鼠顯著降低，與上述文獻(xiàn)報道一致，提示脂聯(lián)素對子宮內(nèi)膜癌移植瘤生長具有抑制作用。此外，與HFD組比較，HFD+APN組荷瘤裸鼠空腹血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、血膽固醇和血甘油三酯的水平均下降，說明脂聯(lián)素可能通過改善裸鼠胰島素抵抗，從發(fā)揮更好的抑瘤作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建胰島素抵抗及子宮內(nèi)膜癌移植瘤雙重動物模型，脂聯(lián)素可改善高脂飲食導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗，從而抑制子宮內(nèi)膜癌移植瘤生長。因此，進(jìn)一步深入研究胰島素抵抗促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，糾正與改善胰島素抵抗，提高循環(huán)脂聯(lián)素水平，可能成為臨床防治子宮內(nèi)膜癌的新途徑。