NKX6.3對食管癌細胞增殖、凋亡及侵襲的影響及作用機制

鄭銀彬 吳國俊 羅 暉 汪 華 杜宗漢

作者單位：637000 南充 南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院1胸心外科，2消化內(nèi)科

食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，在我國發(fā)生率約占所有惡性腫瘤的3.2%［1］。目前臨床上超過90%的食管癌患者確診時已進展至中晚期，傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)、放化療等綜合治療手段不斷進步，但患者預(yù)后仍較差，5年生存率低于20%［2］。近年來分子靶向治療取得一定成效，而探索有效的治療靶點成為研究的熱點之一。NKX6.3是NKX6家族蛋白一類進化上保守的轉(zhuǎn)錄因子，位于人體染色體4q21.2-q22上，其編碼的蛋白是細胞受應(yīng)激原刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種應(yīng)激蛋白，與腫瘤發(fā)生、增殖及分化有關(guān)［3］。在胃癌細胞研究中發(fā)現(xiàn)，NKX6.3基因可抑制細胞周期進程并通過死亡受體和線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，從而明顯阻止細胞增殖［4］。而NKX6.3在食管癌細胞中是否也發(fā)揮同樣作用尚未知。本研究在食管癌EC9706細胞中轉(zhuǎn)染NKX6.3后觀察其對細胞增殖、凋亡及侵襲的影響以及對活性氧的調(diào)節(jié)作用，并探討其作用機制，以期為食管癌治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

食管癌EC9706細胞購自中國科學(xué)院細胞庫；TRAIL 購自英國 Pepro Tech 公司；Caspase-3、Bcl-2、Bax抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；E-cadherin、N-cadherin、NKX6.3抗體購自Santa Cruze Biotechnology公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司；CCK-8試劑盒購自默沙克有限公司；Lip2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒購自金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司。酶聯(lián)免疫檢測儀購自北京諾亞威儀器儀表有限公司；熒光分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司；全自動生化分析儀購自日本日立公司；流式細胞儀購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

食管癌EC9706細胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素RPMI 1640培養(yǎng)基的37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，細胞匯合率達85%以上進行傳代培養(yǎng)。根據(jù)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染細胞。食管癌EC9706細胞傳三代培養(yǎng)于6孔板中，24 h后分別轉(zhuǎn)染NKX6.3（NKX6.3組）和空白質(zhì)粒（miR-NC組），并設(shè)空白對照組（Control組）。載體為pcDNA3.1-3xflag，嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法操作。用不含抗生素的培養(yǎng)基接種細胞，接種量（0.5～2.0）×105個，24 h 后待細胞生長至 80%左右匯合，按照說明書配置方法制成DNA和Lip2000稀釋液，將DNA-Lip2000復(fù)合物加入接種細胞，培養(yǎng)48 h后收集并篩選細胞，進行Western blot檢測。

1.3 RT-PCR檢測食管癌EC9706細胞NKX6.3的表達

轉(zhuǎn)染后收集各組細胞，用TRIzol試劑提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進行PCR反應(yīng)。PCR引物序列：NKX6.3的上游引物 5′-GCGAATTCATGGACGTTAATATCGCCC-3′，下游引物 5′-CGTCTAGATTCCTTCACTTGCTGATATAG-3′；以 β-actin 為參照，上游引物 5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′，下游引物 5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃、15 min；95 ℃ 15s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1s，共 40 個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.4 CCK-8法檢測食管癌EC9706細胞增殖情況

取各組對數(shù)生長期細胞，接種于96個孔板中（100 μL／孔），于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。分別于培養(yǎng) 0 h、12 h、24 h、48 h 后加入 10 μL CCK-8溶液并培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定450 nm處各孔吸光度（OD）值，計算細胞增長率。細胞增長率（%）=［（對照組OD值-實驗組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細胞儀檢測食管癌EC9706細胞凋亡、活性氧及線粒體膜電位情況

收集各組待測EC9706細胞，加入100 μL Binding Buffer重懸，然后加入5 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI，室溫避光孵育 15 min后加入 400 μL Binding Buffer，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

將2×105個對數(shù)生長期的EC9706細胞接種于6孔培養(yǎng)板，細胞生長至90%融合時加入DDP培養(yǎng)2 h，胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，過濾后加入終濃度為5 μmol/L的 DCFH-DA，37 ℃孵育 30 min，于激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm處用流式細胞儀檢測細胞熒光強度。檢測細胞內(nèi)線粒體熒光強度時細胞生長至90%融合時加入DDP后培養(yǎng)12 h，胰蛋白酶消化后加入100 μmol/L的熒光染料DiOC6（3），其余步驟同上。

1.6 Transwell法檢測食管癌EC9706細胞侵襲能力

取對數(shù)生長期的EC9706細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為1×105/mL，將 Transwell小室放入 24 孔板，4°C 預(yù)冷，上室加入1∶4稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，待凝固后上室加入RPMI1640培養(yǎng)基400 μL，下室加入正常培養(yǎng)液。細胞沉降后培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽擦去小室內(nèi)細胞，用結(jié)晶紫對侵襲至小室下層的細胞進行染色，拍照、計數(shù)穿膜細胞，每組3個復(fù)孔，實驗至少重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測食管癌EC9706細胞蛋白表達水平

收集對數(shù)生長期的EC9706細胞，用含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解，提取蛋白并取15～20 μL，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，室溫下靜置 30～60 min。一抗（稀釋比例1∶1 000）4°C孵育過夜，二抗（稀釋比例1∶3 000）室溫孵育l h。顯色，然后用凝膠成像系統(tǒng)曝光，以Actin為內(nèi)參蛋白，相對蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用SNK法進一步行多重比較。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌EC9706細胞中NKX6.3的表達

Western blot和RT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染后Control組、miR-NC組、NKX6.3組NKX6.3蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.987，P=0.001），NKX6.3 mRNA 表達差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.396，P＜0.001），其中NKX6.3組蛋白和mRNA表達量均高于miR-NC組（均P＜0.01）。見圖 1。

2.2 NKX6.3對食管癌EC9706細胞增殖的影響

Western blot實驗顯示，Control組、miR-NC 組、NKX6.3組Ki67蛋白表達組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.018，P=0.001），CCK-8 法檢測亦顯示 3 組細胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.378，P=0.003），其中NKX6.3組Ki67蛋白表達量和細胞增殖率均低于miR-NC 組（均 P＜0.01）。見圖 2。

圖1 轉(zhuǎn)染后食管癌EC9706細胞中NKX6.3的表達情況Fig.1 Expression of NKX6.3 in esophageal cancer EC9706 cells after transfection

圖2 NKX6.3對食管癌EC9706細胞增殖的影響Fig.2 Effect of NKX6.3 on the proliferation of esophageal cancer EC9706 cells

2.3 NKX6.3對食管癌EC9706細胞內(nèi)活性氧、線粒體膜電位的影響

流式細胞儀檢測活性氧、線粒體膜電位，結(jié)果顯示，Control組、miR-NC 組、NKX6.3組細胞活性氧、線粒體膜電位組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.369，P＜0.001），其中NKX6.3組細胞活性氧高于miR-NC組，而線粒體膜電位低于miR-NC組（P＜0.001）。見圖3。

圖3 NKX6.3對食管癌EC9706細胞活性氧和線粒體膜電位的影響Fig.3 Effects of NKX6.3 on reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential of esophageal cancer EC9706 cells

2.4 NKX6.3對食管癌EC9706細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測檢細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，Control組、miR-NC組、NKX6.3組細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.076，P＜0.001），其中 NKX6.3 組細胞凋亡率高于miR-NC組（P＜0.001）。見圖4A。Western blot檢測結(jié)果顯示，3組細胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達水平差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.369，P＜0.001），其中NKX6.3組Bcl-2蛋白表達水平較miR-NC組降低（P＜0.001），而Bax及Caspase-3蛋白表達水平升高（P＜0.001）。見圖 4B。

圖4 NKX6.3對食管癌EC9706細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of NKX6.3 on apoptosis of esophageal cancer EC9706 cells

2.5 NKX6.3對食管癌EC9706細胞侵襲的影響

Transwell小室實驗結(jié)果顯示，Control組、miR-NC組、NKX6.3組細胞侵襲數(shù)目差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.972，P＜0.001），其中NKX6.3組細胞侵襲數(shù)目較miR-NC組降低（P＜0.001）。見圖5A。Western blot檢測結(jié)果顯示，3 組細胞 Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達水平差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.789，P＜0.001），其中與miR-NC組相比，NKX6.3組N-cadherin蛋白表達水平降低（P＜0.001），而 Vimentin、E-cadherin 蛋白表達水平升高（P＜0.001）。見圖 5B。

圖5 NKX6.3對食管癌EC9706細胞侵襲的影響Fig.5 Effect of NKX6.3 on the invasion of esophageal cancer EC9706 cells

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，也是臨床上絕大多數(shù)腫瘤患者的致死因素，因此阻止腫瘤表達的轉(zhuǎn)移相關(guān)因子可能有助于抑制惡性腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。目前研究發(fā)現(xiàn)NKX6.3可調(diào)控癌細胞的生物學(xué)特性。Ki67是細胞核內(nèi)與細胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原，在維持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及細胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用，也是反映細胞增殖的敏感指標［5-6］。本研究構(gòu)建過表達NKX6.3的食管癌細胞后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NKX6.3后Ki67蛋白降低，細胞增殖亦明顯受抑制，說明NKX6.3可抑制食管癌細胞增殖，而這可能通過抑制Ki67表達而阻礙食管癌細胞有絲分裂過程實現(xiàn)。

線粒體是調(diào)控細胞凋亡的核心，當線粒體通透性改變其膜電位也會隨之改變［7］。劉亮等［8］通過降低食管癌EC9706細胞線粒體膜電位，啟動內(nèi)源性線粒體凋亡途徑，從而促進細胞凋亡。除了線粒體膜電位，細胞內(nèi)的活性氧水平也是細胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，可作用于線粒體而促使線粒體膜通透性改變、膜電位下降、釋放色素C等［9］。本研究中的流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NKX6.3后細胞凋亡水平明顯增強，細胞活性氧水平升高，而線粒體膜電位降低，說明NKX6.3可促進細胞凋亡。而除了線粒體凋亡途徑，基因也是調(diào)控細胞凋亡的主要途徑之一。Caspase是一種具有特異天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是一組在細胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用的酶，其中Caspase-9基因處于Caspase家族激活基因的頂端，是Caspase家族中最常見的凋亡啟動子，通過自身裂解可使pro-Caspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3，然后通過剪切另外的Caspase底物引起級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡［10］。Bcl-2家族也是常見的凋亡控制基因，當Bcl-2表達下降，Bax表達上升時，可促進細胞凋亡；而當Bcl-2表達升高，Bax表達降低時，則抑制細胞凋亡［11-12］。本研究進一步檢測凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax及Caspase-3）的表達情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NKX6.3后細胞中Bcl-2蛋白表達水平降低，而Bax及Caspase-3蛋白表達水平升高，由此可見，NKX6.3基因既可通過提高癌細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)而促進細胞凋亡，也可以通過影響凋亡相關(guān)基因表達而抑制細胞凋亡。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchyml transition，EMT）使腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的早期事件，腫瘤細胞可通過細胞極性喪失，改變自身細胞形態(tài)而與其他細胞分離［13-14］。EMT過程通常伴隨著相關(guān)蛋白的表達變化，例如E-cadherin、N-cadherin及Vimentin等。其中E-cadherin和N-Cadherin是鈣依賴性的跨膜蛋白，參與細胞與細胞間黏附，其含量改變會影響細胞間的黏附作用，當N-cadherin蛋白含量降低、E-cadherin蛋白含量升高時，細胞間的黏附能力增強，可抑制癌細胞侵襲和遷移［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染NKX6.3后細胞侵襲和遷移能力減弱，N-cadherin蛋白表達水平降低，而Vimentin、E-cadherin蛋白表達水平升高，說明過表達NKX6.3可能通過抑制EMT過程，增強細胞間的黏附能力，從而降低食管癌細胞的侵襲及遷移能力，抑制腫瘤擴散和轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)，NKX6.3可通過提高食管癌細胞中的活性氧成分，破壞其線粒體膜結(jié)構(gòu)，降低膜電位，以及調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達而促進細胞凋亡，通過抑制增殖相關(guān)蛋白表達及EMT過程而降低細胞增殖和侵襲能力，因此NKX6.3可能是阻斷食管癌轉(zhuǎn)移和治療的潛在靶點。但NKX6.3對食管癌細胞的具體作用機制以及在其他食管癌細胞系及動物體內(nèi)中的作用有待進一步研究。