胃癌組織中HOXC10表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系的研究

李竟長 羅運(yùn)生 張志紅 李 敏 衛(wèi)青青 黃 成 石 周 黃文強(qiáng) 倪秉強(qiáng)

胃癌是較常見的惡性腫瘤，目前全球范圍內(nèi)胃癌病死率居第2位，胃癌的早期診斷較為困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于進(jìn)展期，預(yù)后較差[1-2]。盡管目前化學(xué)治療、放射治療和手術(shù)等的改進(jìn)能明顯延長胃癌患者的總生存期(OS)，但其5年生存率仍很低[3]。因此，尋找能預(yù)測胃癌患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，對于臨床診治及提供治療決策依據(jù)非常重要。

HOXC10是HOX基因家族成員，其在機(jī)體生長發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡及受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等調(diào)節(jié)中起著重要作用。研究表明HOXC10的異常上調(diào)可能參與了包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-6]。胃癌組織中HOXC10的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系尚未明確，本文就此進(jìn)行研究，探討HOXC10作為預(yù)后預(yù)測指標(biāo)的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2010年1月至2012年12月在柳州市人民醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)的264例患者，以及2017年1月至2017年6月接受胃癌根治術(shù)的20例患者的新鮮胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>2 cm)。所有患者均經(jīng)病理檢查確診為胃腺癌，術(shù)前均未接受化學(xué)治療和放射治療，統(tǒng)一根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第八版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)胃癌診治實(shí)踐指南進(jìn)行術(shù)后輔助治療。所有患者知情并簽署由醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)的知情同意書。

1.2 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

按照Trizol法提取胃癌組織及癌旁組織的總RNA，用核酸蛋白檢測儀對RNA的濃度和純度進(jìn)行測定；按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系要求進(jìn)行qRT-PCR，所用的HOXC10、人β-actin內(nèi)參引物見表1。HOXC10 mRNA相對于人β-actin表達(dá)量的計(jì)算方法為2-ΔCt(ΔCt=癌組織或癌旁組織中HOXC10的Ct值-相同樣本中人β-actin的Ct值)。HOXC10 mRNA在胃癌組織與癌旁組織中的相對表達(dá)量的計(jì)算方法為：2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織)。根據(jù)胃癌組織相對癌旁組織的HOXC10表達(dá)水平將樣本分成2組，<1為低表達(dá)組，≥1為高表達(dá)組。

表1 引物序列

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

用4%福爾馬林固定組織，然后用石蠟包埋切片(厚度4 μm)。脫蠟后，切片用3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，加入10 mL(pH 6.0)枸櫞酸鈉緩沖液中，92 °C～95 °C加熱15 min，進(jìn)行抗原修復(fù)。用5% BSA封閉非特異性抗原，將用5% BSA 1∶100稀釋的兔抗人HOXC10單克隆抗體加到玻片上，完全覆蓋組織，4 °C冰箱孵育過夜，PBS漂洗2次(5 min)。將二抗(山羊抗兔)加到玻片上，完全覆蓋組織，37 °C濕盒孵育40 min，PBS漂洗2次(5 min)。用DAB顯色，顯微鏡觀察，反應(yīng)時(shí)間控制在2～4 min，自來水沖洗終止顯示。用蘇木素室溫復(fù)染30 min，自來水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察。

1.4 隨訪情況

本研究隨訪終點(diǎn)為隨訪時(shí)間滿5年或患者死亡。無復(fù)發(fā)生存期(RFS)定義為從患者接受手術(shù)開始到出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、進(jìn)展或因各種原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間。OS定義為從患者接受手術(shù)開始至因任何原因?qū)е滤劳鲋栈螂S訪結(jié)束之日的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。采用配對t檢驗(yàn)分析胃癌組織與癌旁組織中HOXC10的表達(dá)差異，采用χ2檢驗(yàn)分析臨床病理特征與HOXC10相對表達(dá)水平的關(guān)系。采用Kaplan-Meier方法分析HOXC10表達(dá)水平與RFS、OS的關(guān)系。采用Cox回歸分析單因素、多因素與RFS、OS的關(guān)系。用二元Logistic回歸分析建立Logistic回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中HOXC10 mRNA表達(dá)情況

結(jié)果顯示， HOXC10 mRNA在胃癌組織中表達(dá)較癌旁組織顯著上調(diào)(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HOXC10 mRNA在胃高分化腺癌(Ⅰ級)、中分化腺癌(Ⅱ級)中低表達(dá)，在胃低分化腺癌(Ⅲ級)中高表達(dá)(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與胃癌組織相比，**P<0.05

圖1 HOXC10 mRNA在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 HOXC10 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平 DAB染色 ×100 A 高分化腺癌 B 中分化腺癌 C 低分化腺癌

2.2 HOXC10表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

本研究共納入264例胃癌患者，其臨床病理特征數(shù)據(jù)見表2。HOXC10表達(dá)水平與患者性別及年齡不明顯相關(guān)(P>0.05)。HOXC10表達(dá)水平與患者病理分級、Lauren分型、TNM分期、腫瘤浸潤深度(T分期)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量(N分期)等臨床病理特征明顯相關(guān)，HOXC10在病理分級差、彌漫型、TNM分期晚、腫瘤浸潤深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多的患者中高表達(dá)(P<0.05)。

2.3 HOXC10表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)HOXC10表達(dá)水平將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，兩組比較結(jié)果顯示，HOXC10低表達(dá)組的RFS和OS均長于高表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。見圖3。

2.4 臨床病理特征及HOXC10表達(dá)水平與預(yù)后的Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析顯示，病理分級、Lauren分型、TNM分期、T分期、N分期及HOXC10表達(dá)水平與RFS及OS均顯著相關(guān)(P<0.05)，而性別和年齡與RFS和OS無顯著相關(guān)性(P>0.05)。剔除性別、年齡后，進(jìn)一步進(jìn)行多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)病理分級、Lauren分型、TNM分期、T分期、N分期及HOXC10 表達(dá)水平與胃癌患者的RFS及OS均顯著相關(guān)(P<0.05)。見表3、表4。

表2 HOXC10表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系/例

圖3 HOXC10低表達(dá)組與高表達(dá)組的RFS曲線及OS曲線 A RFS曲線 B OS曲線

表3 臨床病理特征及HOXC10表達(dá)水平與RFS的Cox回歸分析

表4 臨床病理特征及HOXC10表達(dá)水平與OS的Cox回歸分析

2.5 Logistic回歸模型

根據(jù)Cox多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果，將與胃癌患者RFS及OS有密切相關(guān)性的病理分級、Lauren分型、TNM分期、T分期、N分期及HOXC10表達(dá)水平6個變量納入Logistic回歸模型。再根據(jù)Logistic回歸分析結(jié)果，納入病理分級、Lauren分型、TNM分期、T分期和N分期5個變量作為基于傳統(tǒng)臨床病理特征參數(shù)預(yù)測胃癌患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)。然后再納入病理分級、Lauren分型、TNM分期、T分期和HOXC10表達(dá)水平5個變量作為基于HOXC10表達(dá)水平預(yù)測胃癌患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)，基于兩組參數(shù)平行原則，未納入N分期作為參數(shù)?；趥鹘y(tǒng)臨床病理特征參數(shù)預(yù)測的胃癌患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)模型受試者工作特征(ROC)曲線下面積(0.844，95%CI：0.790～0.898)與基于HOXC10參數(shù)預(yù)測的胃癌患者5年內(nèi)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)模型的ROC曲線下面積(0.841，95%CI：0.787～0.895)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。基于傳統(tǒng)臨床病理特征參數(shù)預(yù)測的胃癌患者5年內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)模型的ROC曲線下面積(0.867，95%CI：0.815～0.919)與基于HOXC10參數(shù)預(yù)測的胃癌患者5年內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)模型的曲線下面積(0.858，95%CI：0.804～0.912)比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 兩類預(yù)測胃癌5年內(nèi)復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)模型的ROC曲線 A 基于臨床病理特征和HOXC10表達(dá)的5年內(nèi)胃癌復(fù)發(fā)預(yù)測模型的ROC曲線 B 基于臨床病理特征和HOXC10表達(dá)水平的5年內(nèi)胃癌死亡預(yù)測模型的ROC曲線

3 討論

HOX基因編碼的蛋白是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡及血管生成的轉(zhuǎn)錄因子[4]，除了在胚胎發(fā)育和組織重塑中的作用外，HOX基因網(wǎng)絡(luò)也參與機(jī)體造血和白血病的發(fā)生、發(fā)展[5]。研究發(fā)現(xiàn)HOX基因在口腔鱗癌、食管癌、結(jié)直腸癌及胰腺癌中呈異常高表達(dá)，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-9]。然而，目前對HOX基因表達(dá)與胃癌的關(guān)系仍知之甚少。

HOXC10是HOX基因家族的成員，由于其在腫瘤發(fā)展中的重要作用而受到越來越多的關(guān)注。目前研究表明，HOXC10在多種實(shí)體腫瘤中呈異常高表達(dá)，如乳腺癌[10]、腦膠質(zhì)瘤[11]、宮頸癌[12]、甲狀腺癌[13]等，且參與各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。Guo等[14]的研究發(fā)現(xiàn)HOXC10在胃癌細(xì)胞中表達(dá)異常上調(diào)，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，機(jī)制研究表明其主要通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。Tang等[15]的研究發(fā)現(xiàn)HOXC10在肺腺癌中高表達(dá)，且其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、器官轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征密切相關(guān)，相對于HOXC10低表達(dá)者，HOXC10高表達(dá)者的RFS和OS更短，預(yù)后更差。

本研究對20對新鮮胃癌組織及癌旁組織進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示HOXC10在胃癌組織中的表達(dá)較癌旁組織顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步明確HOXC10在胃癌組織中的表達(dá)情況，對264例術(shù)后胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果顯示HOXC10表達(dá)水平與病理分級(P=0.001)、Lauren分型(P=0.001)、TNM分期(P=0.007)、腫瘤浸潤深度(P=0.044)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量(P=0.012)等臨床病理特征明顯相關(guān)，與性別及年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，HOXC10高表達(dá)者的RFS和OS均較低表達(dá)者短，預(yù)后更差。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)病理分級、Lauren分型、TNM分期、T分期、N分期及HOXC10 表達(dá)水平與胃癌患者的RFS及OS均顯著相關(guān)(P<0.05)。此外，Logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，HOXC10高表達(dá)是胃癌的獨(dú)立預(yù)測因子，基于HOXC10參數(shù)的Logistic回歸模型與基于傳統(tǒng)臨床病理特征參數(shù)的Logistic回歸模型對胃癌患者術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩類預(yù)測模型效果相當(dāng)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明胃癌組織中HOXC10的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，HOXC10可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程中起著重要的促進(jìn)作用，其可能成為預(yù)測胃癌患者預(yù)后、指導(dǎo)治療的生物學(xué)指標(biāo)。