酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率的工藝優(yōu)化

郭 欣，郭 萌

(1. 漳州職業(yè)技術(shù)學院食品工程學院,福建漳州 363000;2. 農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應用技術(shù)工程中心,福建漳州 363000)

黑木耳(Auriculariaauricular)又稱木耳，富含多種營養(yǎng)成分及生理功能物質(zhì)[1]，具有較高的食用和藥用價值。其中，存在于細胞中的黑木耳多糖是黑木耳生物活性的主要成分，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂和增強免疫等功效[2-4]。近年來，黑木耳功能性保健食品開發(fā)研究逐漸增多，例如黑木耳發(fā)酵飲料、黑木耳面包、黑木耳果凍、黑木耳低脂灌腸制品等[5-6],但這些產(chǎn)品大多未對黑木耳進行深加工，僅是將其作為原料直接添加入食品中，黑木耳多糖溶出率不高，造成了原料的浪費。目前，國內(nèi)外對于提高多糖提取率的方法研究主要集中在熱水浸提法[7]、酸堿浸提法[8-9]及酶、微波、超聲等輔助提取法[10-12]。這些提取方法存在耗時長、工藝復雜、加入化學溶劑、破壞其它營養(yǎng)成分等不足，不適合后續(xù)食品加工。

本文采用酵母發(fā)酵法，利用酵母菌內(nèi)在酶系，促使黑木耳細胞壁纖維之間的酯鍵斷裂而發(fā)生剝皮反應[13-14]，使更多易被人體吸收的黑木耳多糖游離釋放出來。此方法成本低、易操作，黑木耳多糖溶出率高，并且原有營養(yǎng)成分基本保持不變，是一種相對有效，更加適合保健食品深加工的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

黑木耳：福建省龍海市安利達工貿(mào)有限公司；酵母：湖北安琪酵母有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋(JHH-4)：江蘇榮華儀器有限公司；紫外可見分光光度計(UV5800PC)：北京普析通用儀器有限公司；pH計：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵工藝流程

發(fā)酵工藝流程如圖1所示。

圖1發(fā)酵工藝流程圖
Fig1Fermentation process flow cohart

1.3.2 黑木耳多糖提取及測定

參照王偉等[15]的提取方法。發(fā)酵液離心過濾取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。隨后緩慢加入3倍體積的無水乙醇，低溫靜置過夜可見沉淀，即為黑木耳粗多糖。多糖含量測定方法參照苯酚-硫酸法測定[16]。多糖提取率(%)=多糖質(zhì)量(g)/干木耳質(zhì)量(g)×100 %

1.3.3 酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率單因素試驗

(1)不同酵母添加量對黑木耳多糖溶出率的影響

在發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間16 h，pH 6.5的條件下，選取酵母添加量為 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 g/L等5個水平，研究不同酵母添加量對黑木耳多糖溶出率的影響。

(2)不同發(fā)酵溫度對黑木耳多糖溶出率影響

在酵母添加量0.75 g/L，發(fā)酵時間16 h，pH6.5的條件下，選取發(fā)酵溫度為18、22、26、30、34、38 ℃等6個水平，研究不同發(fā)酵溫度對黑木耳多糖溶出率的影響。

(3)不同發(fā)酵時間對黑木耳多糖溶出率影響

在酵母添加量0.75 g/L，發(fā)酵溫度30 ℃，pH6.5的條件下，選取發(fā)酵時間為8、16、24、32、40 h等5個水平，研究不同發(fā)酵時間對黑木耳多糖溶出率的影響。

(4)不同pH對黑木耳多糖溶出率的影響

在酵母添加量0.75 g/L，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間16 h的條件下，選取pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5等5個水平，研究不同pH對黑木耳多糖溶出率的影響。

1.3.4 響應面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.6.1軟件進行試驗設(shè)計，以酵母添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)和pH值(D)作為自變量，以黑木耳多糖溶出率為指標，優(yōu)化酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率的工藝條件。因素及水平如表1所示。

表1響應面設(shè)計因素及水平
Table1Factors and levels of responsesurface design

水平因素A:酵母添加量/(g·L-1)B:發(fā)酵溫度/℃C:發(fā)酵時間/hD:pH-10.52685.500.7530166.51134247.5

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同酵母添加量對黑木耳多糖溶出率的影響

由圖2可以看出，黑木耳多糖溶出率隨著酵母添加量的增加先呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)酵進程縮短；當酵母添加量達到0.75 g/L時，黑木耳多糖溶出率最高；之后隨酵母添加量繼續(xù)增大，溶出率反而下降，這可能是因為在固定的營養(yǎng)環(huán)境中，過多的酵母數(shù)量使得酵母之間出現(xiàn)互相爭奪營養(yǎng)的現(xiàn)象，從而影響酵母的活性。因此，最佳酵母添加量選擇為0.75 g/L。

圖2 不同酵母添加量對黑木耳多糖 溶出率的影響Fig 2 Effects of different yeast addition on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.1.2 不同發(fā)酵溫度對黑木耳多糖溶出率影響

由圖3可見，隨著發(fā)酵溫度的增加，黑木耳多糖溶出率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在30 ℃時出現(xiàn)峰值。因為酵母的最適生長溫度為30 ℃，在此溫度下，酵母生長最旺盛，體內(nèi)酶系活性大大增加，催化黑木耳細胞壁纖維不斷裂解，使多糖更容易游離出來[17-18]。而低溫和高溫都不利于酵母的生長，因此，最佳發(fā)酵溫度選擇為30 ℃。

圖3 不同發(fā)酵溫度對黑木耳多糖溶出率的影響Fig 3 Effects of different fermntation temperature on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.1.3 不同發(fā)酵時間對黑木耳多糖溶出率影響

由圖4可見，發(fā)酵初期，黑木耳多糖溶出率有所增加，在發(fā)酵16 h時達到最高值17.52%。隨著發(fā)酵時間的延長，黑木耳多糖溶出率不斷下降，這可能是因為過長的發(fā)酵時間改變了溶出的多糖結(jié)構(gòu)[19]，同時酵母發(fā)酵產(chǎn)生的CO2導致發(fā)酵液酸度降低，從而抑制酵母菌活性。因此，最佳發(fā)酵時間選擇為16 h。

圖4 不同發(fā)酵時間對黑木耳多糖溶出率的影響Fig 4 Effects of different fermntation time on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.1.4 不同pH對黑木耳多糖溶出率的影響

由圖5可知，發(fā)酵液pH在4.5～6.5時，黑木耳多糖溶出率逐漸上升，說明弱酸性條件有利于黑木耳多糖的溶出。當pH超過6.5時，黑木耳多糖溶出率出現(xiàn)快速下降的現(xiàn)象，說明堿性環(huán)境時會破壞黑木耳多糖的結(jié)構(gòu)使其降解，進而影響黑木耳多糖的溶出率。因此，最佳pH選擇為6.5。

圖5 不同pH對黑木耳多糖溶出率的影響Fig 5 Effects of different pH on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.2 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應面試驗結(jié)果

在上述單因素試驗基礎(chǔ)上，以酵母添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)和pH(D)作為自變量，進行四因素三水平的響應面試驗設(shè)計，試驗結(jié)果如表2所示。利用Design Expert 8.0.6.1軟件進行回歸分析。

表2響應面試驗結(jié)果
Table2The results of response surface experiments

序號ABCD溶出率/%10000 17.6621001 16.89 300-11 14.6240000 17.1650-101 14.7560101 16.577-1100 14.88810-10 15.239-10-10 13.46 101100 15.9611-100-1 13.5712-1-100 13.8613-1010 14.88141010 16.5715-1001 16.39160000 17.2517010-1 14.571800-1-1 11.67190000 16.9820001-1 15.8821100-1 15.49220110 16.052301-10 14.08241-100 16.72250011 16.37260-1-10 12.24270-10-1 13.52280-110 14.3290000 17.06

對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸模擬分析，得到以黑木耳多糖溶出率(Y)為響應值的回歸方程：Y=17.194+0.818 3A+0.56B+1.062 5C+0.907 5D-0.445AB-0.02AC-0.355AD-0.022 5BC+0.192 5BD-0.615CD-0.547 8A2-1.347 8B2-1.616 5C2-0.999D2。

表3方差分析表
Table3The variance analysis

方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性Model64.366 144.59718.37<0.000 1??A3.763 13.763 215.0430.017?B9.882 19.88239.502<0.000 1??C13.54 113.5454.15<0.000 1??D8.036 18.03632.12<0.000 1??AB0.792 1 10.792 13.1660.096 9AC1.600×10-3 11.600×10-36.396×10-30.937 4AD0.504 1 10.504 12.0150.177 6BC2.025×10-3 12.025×10-38.095×10-30.929 6BD0.148 22 10.148 20.5920.454 2CD1.512 9 11.512 96.0470.027 5?A21.947 11.946 77.7820.014 5?B211.783 111.78347.106<0.000 1??C216.951 116.95167.76<0.000 1??D26.474 16.47425.880.000 2??殘差3.502 140.250 1失擬項3.327 100.332 77.636 0140.052 5凈誤差0.174 40.043 5總和67.86 28

注：**為差異極顯著(P<0.01);*為差異顯著(P<0.05)

2.2.2 響應曲面分析

由表3顯著性分析可知，酵母添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)和pH(D)4個因素之間不是簡單線性關(guān)系，而是相互交叉作用。依據(jù)上述回歸方程，繪制4個因素交互作用下的響應面圖及等高線圖，如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對黑木耳多糖溶出率的響應面和等高圖Fig 6 Response surface and contour map of the interaction of various factors on the dissolution rate of Auricularia auricular polysaccharide

由圖6a可知，沿著B因素(發(fā)酵溫度)移動的等高線密度高于A因素(酵母添加量)方向。從曲面3D圖也可以看出，沿著B因素方向的曲面更陡峭。這說明發(fā)酵溫度對黑木耳多糖溶出率的影響大于酵母添加量。由圖6b可知，沿著C因素(發(fā)酵時間)移動的等高線密度高于A因素(酵母添加量)方向。從曲面3D圖也可以看出，C因素方向響應面曲線有一定的坡度。這說明發(fā)酵時間對黑木耳多糖溶出率的影響大于酵母添加量。同理，D因素(pH)對溶出率的影響大于A因素(酵母添加量)，C因素(發(fā)酵時間)對溶出率的影響大于B因素(發(fā)酵溫度)。綜合以上分析可知，4個因素對黑木耳多糖溶出率的影響主次順序為：發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>pH>酵母添加量，與表3方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最優(yōu)條件及驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6.1數(shù)據(jù)分析，酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率的最佳工藝條件為酵母添加量0.753 g/L、發(fā)酵溫度30.72 ℃、發(fā)酵時間16.8 h、pH6.58，此條件下黑木耳多糖溶出率預測值為17.74%?？紤]到實際加工條件的便利性，最終將最佳工藝選擇為酵母添加量0.75 g/L、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間16 h、pH6.5。用該工藝條件進行3次重復試驗，得到黑木耳多糖溶出率平均值為17.65%，與預測值接近，充分驗證了該回歸模型的準確性和可靠性，可用于酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率工藝優(yōu)化。

2.3 對比研究酵母發(fā)酵法與其它提取方法對黑木耳多糖溶出率的影響

為探討酵母發(fā)酵法的優(yōu)越性，將其與其它學者研究的不同提取方法進行比較。陸雯等[20]采用熱水浸提法，在提取溫度60 ℃、料液比為1∶40、提取時間為2.5 h的最佳提取條件下測得黑木耳多糖提取率為5.12%。陳祖琴等[21]通過超聲波提取法提取木耳多糖，通過對粒徑、超聲波功率、時間及料液比4個因素進行正交試驗, 測得黑木耳多糖提取率為11.95%。本試驗中，酵母發(fā)酵法測得黑木耳多糖提取率可達17.65%，明顯高于熱水浸提法和超聲波提取法，大大提高了原料的利用率，有利于降低食品企業(yè)的生產(chǎn)成本。

3 結(jié)論

本試驗采用對黑木耳漿進行酵母發(fā)酵的方法，在原有營養(yǎng)成分基本保持不變的情況下，提高黑木耳多糖溶出率。利用Design Expert 8.0.6.1軟件對該工藝中的各個影響因素進行響應面優(yōu)化，建立多元回歸模擬方程。通過方差及響應曲面分析得到影響黑木耳多糖溶出率的因素主次順序為：發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>pH>酵母添加量。通過響應面法優(yōu)化提取條件，得到最佳工藝條件為酵母添加量0.75 g/L、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間16 h、pH6.5。在此條件下，黑木耳多糖溶出率為17.65%，與預測值(17.74%)接近，說明該回歸模型的準確性和可靠性，可用于酵母發(fā)酵法提高黑木耳多糖溶出率工藝優(yōu)化。