QuEChERS-GC-MS/MS法同時測定刺梨中15種有機氯農(nóng)藥殘留

李 志，冉茂乾，張馨允，蔣洪亮，徐孟懷，焦彥朝*

（1.六盤水市山地特色生態(tài)產(chǎn)品研究中心，貴州 六盤水 553000；2.貴陽海關出入境檢驗檢疫綜合技術中心 國家果蔬檢測重點實驗室（六盤水），貴州 六盤水 553000；3.貴陽海關出入境檢驗檢疫綜合技術中心，貴州 貴陽 550081）

刺梨（Rosa roxbunghiiTratt）又名九頭鳥、文先果，是一種稀有的果實，主要分布在貴州、四川、湖北、云南等地[1-5]，果實富含維生素、糖、有機酸、胡蘿卜素，尤其是維生素C含量極高，被稱為“維C之王”[6-9]。目前在貴州已有大面積人工種植，為培育出品質優(yōu)良的刺梨，農(nóng)藥被廣泛應用于農(nóng)產(chǎn)品的除蟲殺菌，然而因存在農(nóng)藥的不合理使用，農(nóng)產(chǎn)品中經(jīng)常存在農(nóng)藥殘留超標的情況被檢出，食品中殘留小劑量的農(nóng)藥和其他化學試劑會對人和動物的健康產(chǎn)生不良影響，因此食品中農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為威脅消費者的一大安全問題。農(nóng)藥多殘留分析QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged and Safe）方法是用于高含水量食物中農(nóng)藥多殘留檢測的一種樣品處理和凈化技術[10-14]。近年來國內(nèi)外已有大量文獻研究QuEChERS方法作為農(nóng)獸藥殘留檢測的前處理，劉婷等[15]采用QuEChERS結合氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜法（gas chromatography triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS）和液相色譜-串聯(lián)質譜法（liquidchromatographytandemmassspectrometry，LC-MS/MS）對果蔬農(nóng)藥多殘留進行分析研究；高彥等[16]采用QuEChERS結合LC-MS/MS法在動物源性食品中獸藥殘留分析中的應用研究；CONCHA-MEYER A等[17]使用QuEChER結合GC-MS/MS對智利國內(nèi)市場冷凍水果和蔬菜中的農(nóng)藥殘留進行分析研究；本研究建立QuEChER前處理結合氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜法（GC-MS/MS）對刺梨中15種有機氯農(nóng)藥殘留進行同時檢測，為刺梨農(nóng)藥殘留檢測提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨（貴農(nóng)一號）、刺梨（貴農(nóng)七號）、刺梨（貴農(nóng)九號）：市售；乙腈、正己烷（色譜純）：德國Merck公司；丙酮、甲苯（色譜純）：美國Tedia試劑公司；硅藻土、氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純）：國藥集團化學有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）：均購于德國Dr.Ehrenstorfe公司；ECQUEU750CT-MP 萃取鹽包（4 g MgSO4，1 g NaCl，0.5 g檸檬酸二鈉和1 g檸檬酸三鈉）：美國Agilent公司；PestiCarb/NH2柱：上海譽譜化工科技有限公司。

α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、百菌清、艾氏劑、狄氏劑、o,p'-滴滴伊、o,p'-滴滴滴、p,p'-滴滴涕、p,p'-滴滴滴、噠螨靈、三氯殺螨醇、硫丹，規(guī)格均為（100 μg/mL、1.2 mL）：北京壇墨質檢科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TQ8050氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（配AOC-20i+s自動進樣器）：日本島津公司；TT-2500-VM型多管渦旋混合器：北京金恒祥儀器有限公司；5427 R臺式高速冷凍離心機：Eppendorf（中國）有限公司；HG200均質機：普利賽斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；AUX220分析天平：日本島津公司；EYELA旋轉蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會社；HSE-12B固相萃取儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；TWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海喆圖科學儀器有限公司；retsch混合型碾磨儀MM 400：德國ReTsch萊馳公司；Thermo ASETM 150 加速溶劑萃取器：美國賽默飛公司；SCQ-5201D超聲儀：上海聲彥超聲波儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

QuEChERS前處理：稱取10.0 g（精確至0.001 g）刺梨勻漿于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈旋渦振蕩提取5 min后，將ECQUEU750CT-MP 萃取鹽包加入離心管中再次劇烈振蕩提取5 min，然后在20 ℃、5 000 r/min離心5 min，移取1 mL提取液至裝有150 mg無水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18的2 mL微離心管中，經(jīng)旋渦振蕩1 min后10 000 r/min離心5 min，取上清液至自動進樣瓶，供GC-MS/MS分析檢測。

加速溶劑萃取[18]：稱取10 g（精確至0.001 g）刺梨勻漿與10 g 硅藻土混合，移入加速溶劑萃取儀的34 mL 萃取池中，在10.34 MPa 壓力、80 ℃條件下加熱5 min，用乙腈靜態(tài)萃取3 min，循環(huán)2次，然后用池體積60%的乙腈（20.4 mL）沖洗萃取池，并用氮氣吹掃100 s。萃取完畢后，氮吹濃縮至1 mL左右，將濃縮液于已用乙腈-甲苯溶液（3∶1）活化好的Sep-Pak NH2柱中凈化，并用20 mL乙腈-甲苯溶液（3∶1）洗滌Sep-Pak NH2柱，凈化液于40 ℃氮吹儀濃縮至1 mL，過0.45 μm有機濾膜，供GC-MS/MS分析。

超聲波萃?。悍Q取10.0 g（精確至0.001 g）刺梨勻漿于80 mL離心管中，加入20 mL正己烷放入超聲提起儀中浸提5 min，超聲儀提取條件為：功率120 W、頻率500 kHz、溫度30 ℃。加入5 g氯化鈉，再次浸提5 min，將離心管放入離心機中，在5 000 r/min離心10 min，取上清液于旋轉蒸餾瓶中，重復提取3次，合并提取液，旋轉蒸餾濃縮至1 mL左右，將濃縮液于已用乙腈-甲苯溶液（3∶1）活化好的Sep-Pak NH2中凈化，并用20 mL乙腈-甲苯溶液（3∶1）洗滌Sep-Pak NH2柱，凈化液于40 ℃氮吹儀濃縮至1 mL，過0.45 μm有機濾膜，供GC-MS/MS分析。

1.3.2 氣相色譜-質譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃，恒溫2 min，以10 ℃/min的速率升溫至180 ℃，恒溫1 min，再以3 ℃/min的速率升溫至270 ℃，恒溫14min；進樣口溫度：280 ℃；色譜-質譜接口溫度：280 ℃；離子源溫度：300 ℃；載氣：氦氣（He），純度≥99.999%，流速1.2 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：無分流進樣，1.5 min后開閥；電離方式：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量：70 eV；駐留時間：2.5 min；溶劑延遲時間：3 min；采集參數(shù)：質譜多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）（參數(shù)見表1）。

表1 15種有機氯農(nóng)藥組分的CAS號、多反應監(jiān)測參數(shù)Table 1 CAS number and multiple reaction monitoring parameters for 15 kinds of organochlorine pesticides

續(xù)表

1.3.3 標準曲線的配制

取兩個10 mL容量瓶，其中一個容量瓶配10種混合標準中間液，另一個容量瓶配5種混合標準中間液，分別移取有機氯農(nóng)藥標準液（100 μg/mL、1.2 mL）各1 mL于2個10 mL容量瓶中，并用丙酮定容至刻度，即得質量濃度為10 μg/mL混合農(nóng)藥標準中間液，放入4 ℃冰箱中冷藏，有效期3個月。

分別移取標準中間液50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL于10 mL容量瓶中，并用丙酮定容至刻度，即得質量濃度為0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL的標準工作液。按照1.3.2節(jié)氣相色譜-質譜條件進行分析，以濃度為橫坐標，定量離子對的峰面積為縱坐標進行線性回歸。

1.3.4 不同溶劑對各組分響應值的影響

樣品中殘留農(nóng)藥的提取是食品中農(nóng)藥殘留分析檢測的關鍵環(huán)節(jié)，選擇一個好的提取溶劑是保證農(nóng)藥殘留檢測準確性的前提條件，因此對樣品殘留農(nóng)藥提取溶劑盡可能選擇能充分提取樣品所含農(nóng)藥成分及其代謝產(chǎn)物，而又盡量少提取樣品中其他干擾物質。按照1.3.1 QuEChERS前處理，考察乙腈、正己烷、二氯甲烷3種不同提取溶劑對刺梨中15種待測物提取效率。

1.3.5 不同凈化劑對各組分響應值的影響

蔬菜水果中的色素、碳水化合物、有機酸等的凈化程度會影響樣品的回收率。目前QuEChERS方法常用的凈化劑有PSA、C18、GCB等，不同類型的凈化劑對最終待測物的提取效率有顯著影響，選取PSA-GCB（1∶1）、PSA-C18（1∶1）、GCB-C18（1∶1）三種組合作為凈化劑，按1.3.1 QuEChERS前處理，考察不同凈化劑對刺梨的凈化效果。

1.3.6 分析條件的優(yōu)化

為進一步得到最優(yōu)分析條件，分別選取不同萃取方法、正己烷萃取體積、PSA-C18不同配比組合吸附劑作為分析條件的3因素3水正交試驗，試驗設計見表2。

表2 檢測條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for determination conditions optimization

1.3.7 方法的回收率與精密度試驗

選取空白刺梨樣品基質進行加標回收試驗，分別準確添加25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 3個濃度水平的15種有機氯農(nóng)藥混合標準溶液，按照1.3.1 QuEChERS前處理，每個濃度做6平行樣品，回收率與精密度如表5所示。

2 結果與分析

2.1 15種有機氯農(nóng)藥混標溶液總離子流色譜圖

圖1 15種有機氯農(nóng)藥標準品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of 15 kinds of organochlorine pesticide standards

2.2 15種有機氯農(nóng)線性關系及方法檢出限

以空白基質產(chǎn)生的3倍信噪比（S/N）計算檢出限[19-20]，15種有機氯農(nóng)藥保留時間、線性回歸方程、相關系數(shù)及檢出限見表3。由表3可知，15種有機氯農(nóng)藥在0.05～1.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)（R2）均大于0.997，檢出限0.001 2～0.021 2mg/kg。

表3 15種有機氯農(nóng)藥的保留時間和線性回歸方程及相關系數(shù)Table 3 Retention times,linear regression equations and correlation coefficients of 15 kinds of organochlorine pesticides

2.3 提取方法的比較

超聲波萃取是基于超聲波的特殊物理性質，主要是通過電壓換能器產(chǎn)生的快速機械振動波來減少目標萃取物與樣品之間的作用力，從而實現(xiàn)固-液萃取分離；QuEChERS萃取是一種適用于高含水量食物中農(nóng)藥多殘留檢測的樣品處理和凈化技術，簡化了以前繁雜的萃取步驟并且擴大了所萃取農(nóng)殘的范圍，因此在食品分析方法中得到了廣泛應用；加速溶劑萃取是一種全新的處理固體和半固體樣品的方法，通過升高萃取過程溫度，提高萃取壓力來實現(xiàn)快速、高效的萃取。由圖2可知，超聲波萃取、QuEChERS萃取、加速溶劑萃取各化合物回收率均在70%～110%，滿足農(nóng)藥加標回收率要求。

圖2 不同提取方法對回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction methods on recovery rates

2.4 提取溶劑的選擇

農(nóng)藥殘留提取溶劑的選擇應遵循“相似相溶”原理，應選擇與待測農(nóng)藥極性相似的溶劑作為提取液，有機氯農(nóng)藥極性較弱應選擇極性弱的溶劑作為提取液。由圖3可知，乙腈、正己烷、二氯甲烷作為提取溶劑時，其平均回收率分別是89.07%、90.93%、81.80%；乙腈沸點較高，不利于濃縮，且價格較為昂貴，對一些熱穩(wěn)定性較差的有機氯農(nóng)藥提取效率有較大影響；二氯甲烷極性較強，其提取平均回收率相對較低，且二氯甲烷毒性較大，不利于實驗人員的健康；故選正己烷作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on recovery rates

2.5 凈化劑種類的選擇

QuEChERS方法中最常用的三種凈化吸附劑是PSA、GCB、C18。C18凈化劑疏水性極強，能夠有效去除樣品中的脂肪酸和色素，同時它對非極性化合物具有較強的吸附作用[10]；PSA對樣品基質中各種色素、有機酸以及一些脂肪酸和糖具有良好凈化效果[14]；GCB可以有效的凈化基質中類甾體、葉綠素等色素，但對脂肪的凈化能力較差，且具有較強的吸附性，使一些農(nóng)藥不易洗脫，從而影響分析結果。為了能有效去除刺梨中雜質的干擾，本研究分別考察了PSA-GCB（1∶1）、PSA-C18（1∶1）、GCB-C18（1∶1）三種組合凈化劑對刺梨中15種有機氯農(nóng)藥回收率的影響，結果見圖4，PSA-GCB（1∶1）、PSA-C18（1∶1）、GCB-C18（1∶1）三種組合凈化劑對刺梨凈化效果的平均回收率分別82.27%、88.73%、81.40%，因此選擇PSA-C18（1∶1）組合作為本實驗的凈化劑。

圖4 不同凈化劑對回收率的影響Fig.4 Effect of different purifying agents on recovery rates

2.6 分析條件的優(yōu)化

分別選取不同萃取方法、正己烷體積、PSA-C18組合凈化劑配比作為分析條件的3個影響因素，設計了3因素3水平的正交試驗，試驗結果及極差分析見表4。由表4可知，最優(yōu)分析條件為QuEChERS作為樣品前處理、正己烷體積為20 mL、凈化劑為PSA（50 mg）-C18（50 mg）。按該條件進行3次平行驗證試驗，刺梨中15種有機氯農(nóng)藥的平均回收率為98.87%，優(yōu)于其他試驗條件所得的回收率，因此確認該方法為刺梨農(nóng)藥殘留檢測的最優(yōu)分析條件。

表4 刺梨中有機氯農(nóng)藥殘留檢測條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for determination conditions optimization of organochlorine pesticide residues in Rosa roxbunghii Tratt

2.7 回收率與精密度試驗結果

由表5可知，15種有機氯農(nóng)藥的平均回收率為81.98%～105.55%，精密度試驗結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.23%～6.98%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》相應參數(shù)要求，表明該檢測方法科學可行。

表5 15種有機氯農(nóng)藥回收率及精密度試驗結果Table 5 Recovery rates and precision tests results of 15 kinds of organochlorine pesticides

續(xù)表

2.8 實際樣品分析結果

采用該方法檢測三種刺梨中15種有機氯農(nóng)藥，檢測結果見表6。由表6可知，貴農(nóng)一號刺梨、貴農(nóng)七號刺梨中檢測農(nóng)藥分別有2種呈陽性，分別是五氯硝基苯0.030 8 mg/kg、噠螨靈0.0581mg/kg、百菌清0.0653mg/kg、硫丹0.0397mg/kg；貴農(nóng)九號刺梨中只有一種農(nóng)藥呈陽性：α-六六六0.0235mg/kg。

表6 刺梨樣品中15種有機氯農(nóng)藥的檢測結果Table 6 Determination results of 15 kinds of organochlorine pesticides in Rosa roxburghii Tratt samples

3 結論

建立QuEChERS-GCMS/MS法測定刺梨中15種有機氯農(nóng)藥殘留的快速檢測分析方法，該方法具有經(jīng)濟、快速、靈敏和足夠精確等優(yōu)勢；且具有良好的線性關系、加標回收率均在81.98%～105.55%之間、儀器檢出限（S/N=3）均在0.001 2～0.021 2 mg/kg區(qū)間，回收率的相對標準偏差（n=6）均小于10%，與其他農(nóng)藥殘留檢測方法比，具有提取效率高、溶劑用量少、操作簡單等優(yōu)勢，在實際刺梨農(nóng)藥殘留檢測中得到了廣泛應用，能滿足日常的刺梨農(nóng)藥殘留分析檢測。