海洋棲熱菌β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶原核表達(dá)

歐亞非，趙彩夢(mèng)，鄭亞?wèn)|，毛多斌，魏 濤

（1.上海煙草集團(tuán)技術(shù)中心 北京工作站，北京 101121；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

全反式視黃醛又稱(chēng)維生素A醛，在食品保健、化妝品、醫(yī)藥化工行業(yè)具有廣泛用途[1-2]。目前報(bào)道的全反式視黃醛一般通過(guò)視黃醇氧化反應(yīng)獲得，由于視黃醇的分子結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)共軛雙鍵，對(duì)熱、光或氧氣等極不穩(wěn)定，在氧化反應(yīng)過(guò)程中容易形成多種氧化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率較低且氧化劑的使用會(huì)產(chǎn)生大量污染物[3-4]。相比化學(xué)合成法，微生物酶轉(zhuǎn)化法制備產(chǎn)物具有專(zhuān)一性強(qiáng)、產(chǎn)物含量高、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，同時(shí)可以避免化學(xué)合成中環(huán)境污染問(wèn)題[5-6]。

β-胡蘿卜素是8個(gè)異戊二烯單元相連接且分子兩端各有一個(gè)不飽和己烯環(huán)的四萜化合物，在微生物及其相關(guān)裂解酶水解過(guò)程中能產(chǎn)生全反式視黃醛以及其他揮發(fā)性致香物質(zhì)[7-10]。β-胡蘿卜素降解方式分為對(duì)稱(chēng)裂解和不對(duì)稱(chēng)裂解兩種方式：對(duì)稱(chēng)裂解由β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶作用第15個(gè)碳的位置，生成2分子視黃醛；不對(duì)稱(chēng)裂解由β-胡蘿卜素7,8雙加氧酶、β-胡蘿卜素9,10雙加氧酶和β-胡蘿卜素11,12雙加氧酶等催化作用不同位點(diǎn)，生成番紅花苷、藏紅花醛、β-紫羅酮、脫落酸等[11-14]。目前對(duì)于β-胡蘿卜素不對(duì)稱(chēng)裂解酶研究較多，而對(duì)于對(duì)稱(chēng)裂解酶研究較少，來(lái)源于海洋細(xì)菌β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶Blh是是唯一報(bào)道微生物來(lái)源的β-胡蘿卜素對(duì)稱(chēng)裂解酶[15]。本研究將來(lái)自海洋棲熱菌（Thermussp.DN-1）的β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶（β-carotene-15,15’-oxygenase，BCMOTA）基因在大腸桿菌中克隆表達(dá)，利用生物酶法催化水解β-胡蘿卜素生成全反式視黃醛，以期獲得一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)全反式視黃醛的新型酶催化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

海洋棲熱菌（Thermussp.）DN-1：本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得與保存。

1.1.2 試劑

全反式視黃醛標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：百靈威科技有限公司；β-胡蘿卜素（純度95%）：陜西帕尼爾生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）（DH5α）感受態(tài)細(xì)胞、限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和BamHI、PyrobestDNA聚合酶、DNA連接酶、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒ver.3.0：大連TAKARA公司；大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、克隆與表達(dá)質(zhì)粒載體pET22b：上海斯信生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，121 ℃滅菌20 min。

含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，氨芐霉素和氯霉素濃度均為1%，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler X50h型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)Eppendorf公司；LDZX 型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；1-15K低溫離心機(jī)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Y92-III超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；GeneGenius凝膠成相系統(tǒng)：英國(guó)Syngene公司；QYC 211恒溫培養(yǎng)箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；2010A/2010C型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Thermussp.DN-1基因組序列提取

利用細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒提取Thermussp.DN-1基因組DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成

按照目前已經(jīng)報(bào)道β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)引物如下：（F）5'-GTGCCGACATATGAACACCGCATCGGCCTATCGGAAG-3'（NdeI）和（R）5'-AATTCAGGGATCCATTGGCACACTGGACTGGCACATCCCG-3'（BamHI），由上海生工公司合成。

1.3.3Thermussp.DN-1β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA的基因克隆

以Thermussp.DN-1基因DNA為模板，PCR技術(shù)擴(kuò)增β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA基因片段，PCR反應(yīng)體系（100 μL）：模板1 μL（50 ng），脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（25 mmol/L）2 μL，引物（100 μmol/L）各1 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，10×緩沖液10 μL，ProbestTMDNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，超純水82 μL。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃、4 min；變性95 ℃、30 s；退火56 ℃、30 s；延伸72 ℃、2 min，35個(gè)循環(huán)。將目的基因與載體pET22b連接，獲得重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.4Thermussp.DN-1β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA的氨基酸序列分析

利用Clustal W 軟件對(duì)Thermussp.DN-1β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA與已報(bào)道相關(guān)蛋白序列進(jìn)行氨基酸比對(duì)分析。

1.3.5 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中。挑取LB平板上的單菌落于20 mL含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～16 h；按2%接種量轉(zhuǎn)接入1 L含氨芐青霉素和氯霉素LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2.5 h，使OD600nm值在0.4～0.6；加入終濃度0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）于30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h；離心收集的菌體懸浮在30 mL破壁緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，100 mmol/L NaCl）中，超聲波破碎菌體；12 000×g離心15 min，得到粗酶液。利用鎳柱親和層析和Sephacryl TM S-100 HR column 分子篩柱純化蛋白。分子篩條件：50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl緩沖液（pH 7.5）平衡，流速為1 mL/min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)收集下來(lái)的蛋白。

1.3.6β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶酶活力的測(cè)定

檢測(cè)β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA活性，采用以下反應(yīng)體系[16-18]：2 mg/mLβ-胡蘿卜素、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO4·7H2O、20 mmol/L三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽（tris（2-carboxylethyl）phosphine hydrochloride，TCEP）、2%辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（octyl thioglucoside，OTG）、1%Tween 80、5 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、50 mmol/L Tricine-KOH緩沖液（pH 8.0）和0.5 U/mLβ-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA酶液，50 ℃酶解120 min，加入5%的甲醛終止反應(yīng)。以不含有酶液的上述反應(yīng)體系作為對(duì)照組。

β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA酶活力單位定義為：在一定條件下，每分鐘生成1 μmol的全反式視黃醛所需要的酶量為一個(gè)活力單位（U）。

高效液相色譜法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物[19-21]，所用色譜柱為Alltech Prevail C18色譜柱（25 cm×4.6 cm），采用日本島津SPD-M10A二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)β-胡蘿卜素，流動(dòng)相為正己烷∶甲基叔丁基醚（95∶5，V/V），洗脫速度為1.0 mL/min，在波長(zhǎng)460 nm檢測(cè)；檢測(cè)全反式視黃醛，流動(dòng)相為乙腈∶水（90∶10，V/V），洗脫速度為0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm。以不同質(zhì)量濃度（x）全反式視黃醛標(biāo)準(zhǔn)品（0.005 mg/mL、0.010 mg/mL、0.020 mg/mL、0.040 mg/mL、0.060 mg/mL、0.080 mg/mL、0.100 mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算酶活力。

1.3.7 重組β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA酶學(xué)性質(zhì)研究

（1）最適反應(yīng)溫度

將適量的酶液分別于15～70 ℃溫度條件下與底物混合反應(yīng)30 min，比較酶活性大小，確定最適溫度。

（2）最適反應(yīng)pH值

在不同pH（6.0～10.5）的緩沖液中檢測(cè)酶活，并確定最適pH值。所用緩沖液分別為50 mmol/L檸醋酸鈉緩沖液（pH 5.5～6.0）、磷酸鈉緩沖液（pH 6.5～8.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 8.5～9.0）和3-環(huán)己胺基苯磺酸（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid，CAPS）緩沖液（pH 9.5～10.5）。

（3）酶濃度對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)量的影響

在1 000 mg/L的底物濃度的反應(yīng)體系中分別添加β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA（0～6 U/mL），檢測(cè)全反式視黃醛產(chǎn)量。

（4）底物濃度對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)量的影響

在酶濃度為4 U/mL的反應(yīng)體系中添加不同濃度底物β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA（0～1 000 mg/L），檢測(cè)全反式視黃醛產(chǎn)量。

（5）在最佳反應(yīng)條件下全反式視黃醛產(chǎn)量

在以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，建立β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素制備全反式視黃醛的最佳反應(yīng)條件，酶濃度4 U/mL，β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度1 000 mg/L，反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)pH 8.0，其他反應(yīng)條件為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系。

2 結(jié)果與分析

2.1 Thermus sp.DN-1 β-胡蘿卜素15，15’雙加氧酶BCMOTA的氨基酸序列分析

圖1 β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA和Blh氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Amino acid sequence alignment between β-carotene 15,15'-dioxygenase BCMOTA and Blh

經(jīng)過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得到編碼β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA的氨基酸序列如下：共319氨基酸。到目前為止，不可培養(yǎng)海洋細(xì)菌來(lái)源Blh（GenBank accession num ber：AAY68319）是唯一報(bào)道微生物來(lái)源的β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶[11]。利用軟件Clustal W 2.1比對(duì)分析β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA和Blh氨基酸序列，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，BCMOTA和Blh氨基酸序列具有30%相似性，其中具有LPHGDLDA，HSXXH和TVPHMI三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域；H21、H79、H188、H192和H252為預(yù)測(cè)的五個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA基因的克隆及表達(dá)

重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)后，經(jīng)超聲波破壁、50 ℃熱處理、鎳柱親和層析和分子篩Sephacryl TM S-100，得到純化重組β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶，分子質(zhì)量為35 kDa，結(jié)果如圖2所示。

圖2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA純化結(jié)果Fig.2 Purification results of β-carotene 15,15'-dioxygenase BCMOTA detected by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

2.3 β-胡蘿卜素15，15’雙加氧酶轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素制備全反式視黃醛

HPLC檢測(cè)酶反應(yīng)活性，色譜圖如圖3所示。結(jié)果表明，重組β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA具有裂解β-胡蘿卜素15,15’雙鍵的活性，在β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶的酶活性標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，優(yōu)化催化合成全反式視黃醛產(chǎn)量。

β-胡蘿卜素單加氧酶BCMOTA水解β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化生成全反式視黃醛，反應(yīng)式如下：

圖3 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)物（a）、全反式視黃醛標(biāo)準(zhǔn)物（b）及BCMOTA酶水解產(chǎn)物（c）HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of β-carotene standard (a),all-transretinal standard (b) and BCMOTA enzymic hydrolysates (c)

2.4 β-胡蘿卜素15,15t雙加氧酶BCMOTA酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.4.1β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA最適反應(yīng)溫度

如圖4所示，β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，且該酶在35～55 ℃溫度范圍內(nèi)都有80%以上的活性。

圖4 溫度對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity

2.4.2β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA最適反應(yīng)pH

pH值會(huì)改變位于酶活性中心、底物和輔酶的解離狀態(tài)，進(jìn)而改變酶與底物的結(jié)合狀態(tài)以及催化水平。研究了不同pH條件對(duì)酶活力的影響，如圖5所示，該酶最適反應(yīng)pH為8.0，在pH 7.0～9.5范圍內(nèi)，該酶可以保持60%以上的活性。

圖5 pH值對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of pH value on enzyme activity

2.4.3 酶濃度對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)量的影響

如圖6所示，研究了酶濃度（0～6 U/mL）對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)生的影響。在含有1 000 mg/L底物濃度的反應(yīng)系統(tǒng)中，全反式視黃醛的產(chǎn)生隨著酶濃度先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，在約4 U/mL達(dá)到產(chǎn)物達(dá)到最大量，因此認(rèn)為產(chǎn)生全反式視黃醛的最適酶濃度為4 U/mL。

圖6 酶濃度對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of enzyme concentration on all-trans retinal production

2.4.4 底物濃度對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)量的影響

研究底物質(zhì)量濃度（0～1 000 mg/L）對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)生的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，在4 U/mL酶濃度的反應(yīng)系統(tǒng)中，在底物質(zhì)量濃度600 mg/L條件下檢測(cè)到全反式視黃醛的最大產(chǎn)量。

圖7 底物質(zhì)量濃度對(duì)全反式視黃醛產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of substrate mass concentration on all-trans retinal production

2.4.5 在最佳反應(yīng)條件下全反式視黃醛產(chǎn)量

如圖8所示，在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)25h，產(chǎn)生569.3mg/L全反式視黃醛，同時(shí)消耗600 mg/Lβ-胡蘿卜素，根據(jù)催化反應(yīng)式，計(jì)算生成全反式視黃醛的轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.5%。結(jié)果表明，該酶可以高效催化合成全反式視黃醛，具有較好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

圖8 在最佳反應(yīng)條件下全反式視黃醛產(chǎn)量Fig.8 All-trans retinal production under optimal reaction conditions

3 結(jié)論

本研究得到了一種海洋棲熱菌Thermussp.DN-1β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶BCMOTA的基因序列和氨基酸序列，并在E.coliBL21（DE3）中成功克隆表達(dá)；通過(guò)鎳柱親和層析和分子篩Sephacryl TM S-100，得到純化重組β-胡蘿卜素15,15’雙加氧酶。SDS-PAGE分析表明該酶分子質(zhì)量約35 kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究表明該酶的最適溫度和pH分別為50 ℃和8.0；在最佳反應(yīng)條件酶濃度4 U/mL，β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度1 000 mg/L，反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)pH 8.0，生成569.3 mg/L全反式視黃醛，轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.5%，表明該酶可以高效催化合成全反式視黃醛，因此在食品化工領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用價(jià)值。