柳州酸筍中降亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及鑒定

陳正培，蔣 潮，夏嫻?jié)櫍醭接?，吳錦蘭，熊建文*

（廣西科技大學(xué) 鹿山學(xué)院，廣西 柳州 545616）

柳州酸筍屬于典型的泡菜，是將大頭甜筍和井水混合后進行厭氧發(fā)酵而制成，主要的發(fā)酵菌株來源于井水和大頭甜筍自身所攜帶的乳酸菌。如同其他泡菜一樣，在酸筍發(fā)酵過程中容易產(chǎn)生亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽的存在會對人體健康產(chǎn)生潛在危害[1]。過量的亞硝酸鹽在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為亞硝胺，而亞硝胺具有強烈的致癌作用[2]。人體長期攝入過量的亞硝酸鹽可引發(fā)胃癌、肺癌等疾病產(chǎn)生[3-6]。此外，過量的亞硝酸鹽會引起急性中毒，輕者出現(xiàn)頭暈嘔吐、全身乏力等癥狀；重者可引起呼吸困難、昏迷甚至窒息死亡[7]。有研究表明，許多乳酸菌如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等[8-9]具有降解亞硝酸鹽的能力，這些乳酸菌所產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶在降解亞硝酸鹽上起到了重要作用[10-11]。杜曉華等[12-16]從多種酸制品中篩選出了降解亞硝酸鹽的優(yōu)良乳酸菌，而且這類降解亞硝酸鹽的乳酸菌在乳酸腸球菌（Enterococcus lactococcus）、消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）以及植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）中均有存在[17-18]。

柳州酸筍是柳州螺螄粉的重要輔料，是形成柳州螺螄粉的獨特風(fēng)味的重要成份。然而在發(fā)酵過程中具有產(chǎn)生亞硝酸鹽的潛在可能性。因此，本研究用MRS-CaCO3培養(yǎng)基對酸筍發(fā)酵液中的乳酸菌進行分離，通過測定亞硝酸鹽降解率，從柳州酸筍中篩選出降解亞硝酸鹽的功能性乳酸菌，并研究影響其亞硝酸鹽降解的因素，為今后開發(fā)降亞硝酸鹽的微生態(tài)活性菌劑奠定基礎(chǔ)，對無亞硝酸鹽的優(yōu)質(zhì)酸筍研發(fā)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

酸筍發(fā)酵液樣品：采集于廣西柳州市區(qū)、柳城縣、鹿寨縣，共33份樣品。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、瓊脂粉、胰蛋白胨、多聚蛋白胨、細菌學(xué)蛋白胨（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉、磷酸氫二鉀、亞硝酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eclipse E200生物顯微鏡：日本尼康公司；Master-S15超純水機：上海和泰儀器有限公司；L9800基因擴增儀：北京萊普特科學(xué)儀器有限公司；GenoSens1880凝膠成像分析系統(tǒng)：上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

將采集的酸筍發(fā)酵液稀釋后，利用傾注法在含鈣乳酸細菌MRS固體培養(yǎng)基上進行分離，挑選具有鈣溶圈較大的菌落，于MRS固體平板上純化2次后進行甘油保存。

1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌的初篩

用無菌接種環(huán)取試管中保存的目標(biāo)菌株1環(huán)，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)10h，測定菌液在波長600nm處的吸光度值（OD600nm值），調(diào)整菌液的OD600nm值為0.6，將其作為種子液。然后將目標(biāo)菌株按1%（V/V）的接種量接種于亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為125 mg/mL 的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，取0.1 mL菌液置于10 mL離心管中，依次加入0.25 mL飽和硼砂溶液、0.1 mL亞鐵氰化鉀溶液、0.1 mL乙酸鋅溶液和4 mL超純水，混勻后于8 000×g離心1 min。取2.5 mL上清液加入10 mL離心管中，加入0.50 mL對氨基苯磺酸溶液，渦旋混勻后避光靜置5 min，再加入0.25 mL鹽酸萘乙二胺溶液和1.75 mL超純水，渦旋混勻后避光靜置10 min。于波長538 nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算亞硝酸鹽含量，并按下式計算亞硝酸鹽降解率。

式中：x為菌株的亞硝酸鹽降解率，%；C0為原培養(yǎng)基中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為測試樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；100為換算系數(shù)。

1.3.3 降解亞硝酸鹽乳酸菌的復(fù)篩

將目標(biāo)菌株按1%的接種量（V/V）接種于亞硝酸鹽含量為625 mg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)12 h，測定菌液中的亞硝酸鹽含量，計算降解率，方法同上。

1.3.4 菌株的形態(tài)學(xué)觀察[13]

將目標(biāo)菌株在MRS固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察菌株菌落形態(tài)，再對菌株進行革蘭氏染色，觀察菌株細胞形態(tài)。

1.3.5 目標(biāo)菌株的分子生物學(xué)鑒定

將目標(biāo)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌體并提取菌體的總DNA（具體方法參考試劑盒說明書）。以其為模板，用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對其16 S rDNA序列進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增體系：2×PCR Mix 10 μL，Primer 27F 0.5 μL，Primer 1492 R 0.5 μL，Tempted DNA 1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1min，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物送至華大基因生物公司進行測序。

測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用軟件MEGA6.0中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 不同因素對乳酸菌降解亞硝酸鹽能力的影響

碳源的確定：分別以同樣濃度的蔗糖、乳糖和可溶性淀粉等碳源替代含625 mg/mL亞硝酸鹽的MRS液體培養(yǎng)基中的葡萄糖，經(jīng)過121 ℃、30 min滅菌處理冷卻，將目標(biāo)菌株的種子液按照1.0%（V/V）接種量接種到上述培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，分別在12 h、24 h、36 h、48 h、60 h取菌液進行亞硝酸鹽含量測定，考察不同碳源對亞硝酸鹽降解率的影響。

氮源的確定：分別以同樣濃度的胰蛋白胨、細菌學(xué)蛋白胨和多聚蛋白胨等氮源替代含625 mg/mL亞硝酸鹽的MRS液體培養(yǎng)基中的蛋白胨，經(jīng)過121 ℃、30 min滅菌處理冷卻，將目標(biāo)菌株的種子液按照1.0%（V/V）接種量接種到上述培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，不同時間取菌液測定亞硝酸鹽含量測定，考察不同氮源對亞硝酸鹽降解率的影響。

接種量的確定：將目標(biāo)菌株的種子液分別按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%（V/V）的接種量接種于含625 mg/mL的亞硝酸鹽MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，考察不同接種量對亞硝酸鹽降解率的影響。

pH值的確定：將目標(biāo)菌株的種子液按照1.0%（V/V）接種量分別接種到pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的并含有625 mg/mL的亞硝酸鹽MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，考察不同pH值對亞硝酸鹽降解率的影響。

溫度的確定：將目標(biāo)菌株的種子液按1.0%（V/V）的接種量接種于含625 mg/mL的亞硝酸鹽MRS液體培養(yǎng)基中，分別于22 ℃、27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃溫度條件下進行靜置培養(yǎng)，考察不同溫度對亞硝酸鹽降解率的影響。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

所有實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次，使用Excel2013進行標(biāo)準(zhǔn)偏差分析，用T-test進行差異性分析，用Origin9.0軟件進行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降亞硝酸鹽乳酸菌的篩選

2.1.1 乳酸菌的分離

利用MRS-CaCO3培養(yǎng)基對33份酸筍發(fā)酵液中的乳酸菌進行分離、得到22株形態(tài)均一的白色菌落，所有菌落周圍都出現(xiàn)典型的溶鈣圈，將其純化后進行編號，分別為：LC-3-1、LC-3-2、LC-3-3、LC-3-4、LC-3-5、LC-3-6、LC-3-7、LC-3-8、LC-3-9、LC-3-10、LC-3-11、LC-3-12、LC-3-13、LC-3-14、LC-3-15、LC-3-16、LC-3-17、LC-3-18、LC-3-19、LC-3-20、LC-3-21、LC-3-22。

2.1.2 亞硝酸鹽乳酸菌初篩和復(fù)篩

在125 mg/mL亞硝酸鹽質(zhì)量濃度下22株菌的亞硝酸鹽降解率結(jié)果見表1。

表1 22株菌的亞硝酸鹽降解率Table 1 Degradation rates of nitrite of 22 strains

由表1可知，通過初篩比較22株候選菌株的亞硝酸鹽降解率，其中，菌株LC-3-1、LC-3-2、LC-3-3和LC-3-9的亞硝酸鹽降解率超過99%。對這四株菌亞硝酸鹽降解率進行復(fù)篩，亞硝酸鹽的降解能力大小依次為菌株LC-3-3＞菌株LC-3-2＞菌株LC-3-1＞菌株LC-3-9，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株LC-3-3亞硝酸鹽降解率最大，平均值為76.58%。因此，對菌株LC-3-3進行下一步試驗。

表2 625 mg/mL亞硝酸鹽濃度下4株菌的亞硝酸鹽降解率Table 2 Degradation rates of nitrite of 4 strains at nitrite concentration of 625 mg/ml

2.2 菌株LC-3-3的形態(tài)學(xué)觀察

菌株LC-3-3的菌落及細胞形態(tài)觀察結(jié)果見圖1。由圖1A可知，菌株LC-3-3的菌落在MRS固體培養(yǎng)基中呈圓形，中等大小，凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊，菌落背面為黃色。由圖1B可知，菌株LC-3-3呈典型的革蘭氏陽性，桿狀、無芽孢，單細胞大小為（6.34×5.08）μm。

圖1 菌株LC-3-3的菌落（A）及細胞（B）形態(tài)Fig.1 Colony (A) and cell (B) morphology of strain LC-3-3

2.3 分子生物學(xué)鑒定

以菌株LC-3-3的基因組DNA為模板，以細菌鑒定通用引物27F及1492R為引物進行PCR擴增，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產(chǎn)物在1 500 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符，送至測序公司進行測序。

圖2 菌株LC-3-3 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of strain LC-3-3 16S rDNA PCR amplification products

菌株LC-3-3的16S rDNA序列經(jīng)同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株LC-3-3與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，親緣關(guān)系最近，同源性為99%。因此，菌株LC-3-3被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖3 基于16S rDNA序列菌株LC-3-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain LC-3-3 based on 16S rDNA sequences

2.4 不同因素對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

2.4.1 不同碳源對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

以上4種碳源分別作為培養(yǎng)基中唯一碳源時，培養(yǎng)植物乳桿菌LC-3-3，每隔12 h取樣測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽的含量，分別取樣5次，分析4種碳源對植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，各碳源對亞硝酸鹽降解率的影響為葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞可溶性淀粉。對它們進行兩兩比較，分析碳源間的顯著性差異，結(jié)果見表3。由表3可知，除蔗糖與乳糖培養(yǎng)基間無顯著性差異外（P＜0.05），其他均有顯著性差異（P＜0.05）。呈現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是碳源結(jié)構(gòu)的差異，葡萄糖作為單糖，可以直接被植物乳桿菌LC-3-3利用，有利于對亞硝酸鹽的降解；而蔗糖和乳糖屬于二糖，需要被分解后才能利用，利用其降解亞硝酸鹽的效果次之，可溶性淀粉屬于多糖，被分解的效率更低，植物乳桿菌LC-3-3利用其降解亞硝酸鹽的效果更差。

圖4 不同碳源對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

表3 4種碳源間的差異性分析Table 3 Differences analysis among the four carbon sources

2.4.2 不同氮源對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

以上4種氮源分別作為培養(yǎng)基中唯一氮源來培養(yǎng)植物乳桿菌LC-3-3，每隔12 h取樣測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽的含量，分別取樣5次進行測定，分析4種氮源對植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的影響，結(jié)果見圖5。如圖5所示，亞硝酸鹽降解率為蛋白胨＞細菌學(xué)蛋白胨＞胰蛋白胨＞多聚蛋白胨。對它們進行兩兩比較，分析氮源間的顯著性差異，如表4所示，蛋白胨、細菌學(xué)蛋白胨和胰蛋白胨三種培養(yǎng)基間的降解率無顯著性差異（P＞0.05），發(fā)酵多聚蛋白胨與蛋白胨和細菌學(xué)蛋白胨有顯著性差異（P＜0.05）。因此蛋白胨、細菌學(xué)蛋白胨和胰蛋白胨均可作為植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的氮源，而多聚蛋白胨不利于植物乳桿菌LC-3-3對亞硝酸鹽的降解。

圖5 不同氮源對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

表4 4種氮源間的差異性分析Table 4 Differences analysis among the four nitrogen sources

2.4.3 不同接種量對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

將植物乳桿菌LC-3-3分別以0.5%、1.0%、2.0%、4.0%和6.0%進行接種，每隔12 h取樣測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽的含量，分別取樣5次進行測定，分析接種量對植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的影響，結(jié)果如圖6所示，不同時期亞硝酸鹽降解率隨培養(yǎng)時間的增加而升高，且隨著接種量的減少而降低。對它們進行兩兩比較，分析接種量間的顯著性，結(jié)果見表5。由表5可知，相鄰接種量間均有顯著差異（P＜0.05）。因此，接種量越高，生物量越大，越有利于亞硝酸鹽的降解。

圖6 不同接種量對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽的能力的影響Fig.6 Effects of different inoculum on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

表5 接種量間的差異性分析Table 5 Differences analysis among the inoculum

2.4.4 不同pH對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響

圖7 不同pH對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽的能力的影響Fig.7 Effects of different pH value on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

由圖7可知，在pH4.5～pH6.0之間，隨著接pH的增加，亞硝酸鹽降解降解率逐漸增加，在pH6.0～8.0之間，隨著pH的增加，亞硝酸鹽降解率逐漸降低，且在發(fā)酵的60 h內(nèi)均出現(xiàn)這種趨勢，因此植物乳桿菌LC-3-3降解亞硝酸鹽的最適pH為6.0，弱酸性環(huán)境促進了植物乳桿菌LC-3-3對亞硝酸鹽的降解。

2.4.5 不同溫度對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽能力的影響由圖8可知，發(fā)酵溫度為22～47 ℃之間，隨著溫度的升高，植物乳桿菌LC-3-3對亞硝酸鹽的降解率呈先增強后減弱的趨勢，其降解亞硝酸鹽的最適溫度為37 ℃。比較不同溫度發(fā)酵12 h的亞硝酸鹽降解率，37 ℃條件下的降解率明顯高于其他溫度，隨著發(fā)酵時間的延長，不同溫度間降解率的差異逐漸縮小，這可能是因為37 ℃條件下植物乳桿菌LC-3-3生長最好，生物量最大，但隨著發(fā)酵時間的延長，其溫度條件下的生物量也得到了積累，縮小了不同溫度條件下生物量的差異，從而縮小了亞硝酸鹽降解率的差異。

圖8 不同溫度對植物乳桿菌LC-3-3降亞硝酸鹽的能力的影響Fig.8 Effects of different temperature on nitrite-degrading ability of Lactobacillus plantarum LC-3-3

3 結(jié)論

本研究從柳州自然發(fā)酵酸筍中分離純化獲得一株降亞硝酸鹽能力較好的菌株LC-3-3，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。該菌株在MRS培養(yǎng)基中生長良好，采用MRS培養(yǎng)基的其他組分及其濃度，以葡萄糖為唯一碳源（添加量為20 g/L）、蛋白胨為唯一氮源（添加量為10 g/L）、接種量為6%、pH值為6.0、溫度為37 ℃的條件下，最適合植物乳桿菌LC-3-3對亞硝酸鹽的降解。該菌株源于廣西發(fā)酵酸筍，將其用于酸筍發(fā)酵具有安全性高的顯著特點，此外，由于竹筍的季節(jié)性，發(fā)酵酸筍的保藏期通常需要長達1年時間，該菌株的獲得在輔助酸筍發(fā)酵，降低酸筍中亞硝酸的含量具有良好的應(yīng)用價值。