中藥藥渣中固氮菌、解磷菌、解鉀菌的篩選

王明歡，張小娜，林 冰，鄧錦輝，張 英

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000）

中藥藥渣來源于中成藥生產(chǎn)、中藥材加工與炮制、原料藥生產(chǎn)等，以中成藥生產(chǎn)帶來的藥渣量最大，約占總量的70%［1］，目前其處理方式主要是堆放、焚燒、填埋，不僅占用大量土地資源，嚴(yán)重污染土地及地下水，而且還造成資源浪費(fèi)［2］。它富含有纖維、多糖、蛋白質(zhì)、微量元素等營養(yǎng)成分，質(zhì)輕、透氣性好［3］，不失為一種優(yōu)質(zhì)的微生物堆肥原料。

國外大多以家禽糞便、污水污泥等為原料進(jìn)行有機(jī)堆肥［4-5］，但目前大量抗生素、激素飼料應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，其所含的重金屬在動(dòng)物體內(nèi)囤積，并有一部分隨糞便排出，以其為肥料時(shí)可造成土地及農(nóng)作物污染。隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，有機(jī)食品生產(chǎn)、資源再生利用與微生物肥料生產(chǎn)相結(jié)合已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展方向［6］。

我國腐植酸類肥料（有機(jī)肥）肥源分布廣、貯量大、成本低，中藥藥渣便是其中一種，它經(jīng)過高溫提取后已基本腐爛，極易被微生物利用。微生物肥料中發(fā)揮作用最大的是固氮菌、解磷菌、解鉀菌，其中固氮菌能固定空氣中氮元素，從而供植物吸收；解磷菌、解鉀菌可將植物無法吸收的難溶性磷、鉀轉(zhuǎn)化為可溶性的，故篩選出高效的3種菌是制備微生物肥料的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)將從中藥藥渣中進(jìn)行相關(guān)篩選為今后葉類藥渣制備生物有機(jī)肥料提供參考。

1 材料

1.1 儀器 VD-650 桌上式潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；YXQ-SG46-280SA 手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；THZ-103B 恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；UV-2100 紫外可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；AA7000 原子吸收分光光度計(jì)（日本島津公司）；vario EL cube 元素分析儀（德國Elementar公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA 公司）；FD-1C-50 冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；CR22 冷凍離心機(jī)（日本Hitachi 公司）。

1.2 原料 廣州中醫(yī)藥大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室外已堆放1 年的夏桑菊藥渣，廣州某中藥廠室外堆放3 年的藥渣。

1.3 試劑 瓊脂粉（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；鉀長石粉（廣州翔博生物科技有限公司）；溴百里香酚藍(lán)（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心）；抗壞血酸、酒石酸銻氫鉀、鉬酸銨、硼酸、甲基紅（上海麥克林生化科技有限公司）；溴甲酚綠（上海展云化工有限公司）；葡萄糖、蔗糖、H2SO4、K2HPO4、K2SO4、NaCl、CaCO3、MgSO4·7H2O、NaHPO4、FeCl3·6H2O、（NH4）2SO4、KCl、FeSO4· 7H2O、MnSO4· H2O、Ca3（PO4）2、H2O2、CuSO4、無水乙醇均為分析純。采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定發(fā)酵液中可溶性磷，試劑配制方法見文獻(xiàn)［7］。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 Ashby（阿須貝）無氮培養(yǎng)基 組成為KH2PO40.2 g、NaCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCO35.0 g、CaSO4·2H2O 0.1 g、甘露醇10 g、瓊脂20 g（液體培養(yǎng)基則不加）、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 至7.0，121 ℃下滅菌20 min。

1.4.2 蒙金娜固體培養(yǎng)基（無機(jī)磷固體培養(yǎng)基）組成為葡萄糖10 g、Ca3（PO4）225 g、（NH4）2SO40.5 g、MgSO4· 7H2O 0.3 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO40.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、瓊脂20 g（液體培養(yǎng)基則不加）、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 至7.0。

1.4.3 有機(jī)磷固體培養(yǎng)基 組成為葡萄糖10.0 g、（NH4）2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、瓊脂20 g（液體培養(yǎng)基則不加）、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 至7.0，滅菌后冷卻至60 ℃左右，加入10 mL 蛋黃液（生理鹽水與蛋黃液比例1∶1）。

1.4.4 解鉀培養(yǎng)基 組成為Na2HPO42 g、FeCl30.005 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO30.1 g、蔗糖5 g，鉀長石粉（去離子水洗滌5 次）1 g、溴百里香酚藍(lán)0.1 g、瓊脂20 g（液體培養(yǎng)基則不加）、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 至7.0。

2 方法

2.1 固氮菌篩選

2.1.1 固氮菌分離 取10 g 藥渣加入20 mL 無菌水中振蕩5 min，逐級(jí)稀釋至1×10-1、1×10-2，各取0.2 m L 涂布于Ashby 無氮固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)48 h，挑取能夠生長的單一菌落，平板劃線法進(jìn)一步分離純化，挑取單菌株轉(zhuǎn)接至斜面，保藏培養(yǎng)基。

2.1.2 固氮能力測(cè)定 將“2.1.1”項(xiàng)篩選的固氮菌接種于Ashby 無氮固體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，活化。從平板上挑取菌種至200 mL 新鮮的無氮液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 振蕩培 養(yǎng)3 d，得到種子液，6 000 r/min下離心10 min，除去上清液，沉淀，稱定質(zhì)量，取一定量沉淀干燥至呈均勻粉末狀，稱定質(zhì)量，命名為中藥菌體-1。剩余菌泥均分為3 份，接種至3 個(gè)300 mL 新鮮的Ashby 無氮液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵7 d 后的液體培養(yǎng)基離心，上清液旋蒸后冷凍干燥得均勻粉末，稱定質(zhì)量，命名為中藥發(fā)酵液-1，而沉淀在50 ℃干燥后稱定質(zhì)量，命名為中藥菌體-2。然后，將上述所得3 份樣品通過元素分析儀［8］進(jìn)行分析，得到氮含有量。

2.2 解磷菌篩選

2.2.1 解磷菌分離 菌懸液按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，逐級(jí)稀釋至1×10-2、1×10-4，各取0.2 mL 涂布于有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)48 h，挑取有明顯溶磷圈的菌落，接種于蒙金娜固體培養(yǎng)基上，選取有溶磷圈的菌落作進(jìn)一步劃線分離，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至菌種保藏培養(yǎng)基。

2.2.2 解磷能力測(cè)定 將“2.2.1”項(xiàng)下篩選的解磷菌接種到活化培養(yǎng)基平板上，從不同菌株平板上各挑取一環(huán)解磷菌至液體種子培養(yǎng)基，制備菌懸液。吸取每株菌的菌懸液各2 mL 至蒙金娜液體培養(yǎng)基中，以2 mL 無菌水加至液體培養(yǎng)基中作為對(duì)照，在恒溫?fù)u床內(nèi)30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)7 d，鉬藍(lán)比色法［8］測(cè)定發(fā)酵液中可溶性磷含有量。

2.3 解鉀菌篩選

2.3.1 解鉀菌分離 菌懸液按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，逐級(jí)稀釋至1×10-1、1×10-2，各取0.2 mL 涂布于解鉀培養(yǎng)基平板上，30 ℃下培養(yǎng)48 h。挑取溶鉀圈與菌落直徑比（D/d）較大的菌株，平板劃線法將其接種到新鮮的解鉀培養(yǎng)基上，觀察溶鉀圈情況再將單菌落轉(zhuǎn)接至斜面保藏培養(yǎng)基。

2.3.2 解鉀能力測(cè)定 將“2.3.1”項(xiàng)下篩選的解鉀菌接種到活化培養(yǎng)基平板上，從不同菌株平板上各挑取一環(huán)解鉀菌至液體種子培養(yǎng)基中，制成菌懸液。吸取每株菌的菌懸液各2 mL 至解鉀培養(yǎng)基中，2 mL 無菌水加至液體培養(yǎng)基中作為對(duì)照，在恒溫?fù)u床內(nèi)30 ℃、180 r/min 下培養(yǎng)7 d，原子吸收分光光度法［9］測(cè)定發(fā)酵液中可溶性鉀含有量。

3 結(jié)果

3.1 固氮菌 經(jīng)初篩、復(fù)篩后，得到1 株活力較高的固氮菌，為圓形，乳白色，半透明，邊緣及表面光滑，稍凸，濕潤粘稠狀，命名為GD-1。然后，采用vario EL cube 元素分析儀測(cè)定固氮能力，結(jié)果見表1，可知在培養(yǎng)基沒有加外源氮的情況下該菌株仍能生長，固定于空氣中的氮一部分用于菌體自身生長，另一部分溶于發(fā)酵液。

表1 固氮能力測(cè)定結(jié)果（，n＝3）

表1 固氮能力測(cè)定結(jié)果（，n＝3）

3.2 解磷菌 篩選得到的①號(hào)為圓形，白色，奶油狀，表面凸起，有絨毛，不透明，易刺破，命名為JP-1；②號(hào)為圓形，白色，褶皺，不透明，邊緣整齊，命名為JP-2。然后，采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定可溶性磷含有量，以其為橫坐標(biāo)（X），吸光度（700 nm 波長處）為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A=0.517 4X-0.001 8（R2=0.999 8）。解磷能力見表2，可知JP-2 解磷能力強(qiáng)于JP-1，但兩者溶解磷酸鈣能力均不強(qiáng)，故今后需繼續(xù)篩選得到解磷效果更好的菌株以增加堆肥肥效。

表2 解磷能力測(cè)定結(jié)果（，n＝3）

表2 解磷能力測(cè)定結(jié)果（，n＝3）

3.3 解鉀菌［10］篩選得到的①號(hào)為黃色，菌落較小，命名為JK-1；②號(hào)為黃色，圓形，菌落大，表面呈油滴狀，命名為JK-2；③號(hào)為金黃色，菌落圓形，命名為JK-3。然后，采用原子吸收分光光度法測(cè)定可溶性鉀含有量，以其為橫坐標(biāo)（X），吸光度（766.39 nm 波長處）為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A=0.308 68X+0.067 360（R2=0.999 2）。解鉀能力見表3，可知JK-2 最強(qiáng)，其次是JK-3，JK-1 最弱，但后來在傳代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)三者解鉀能力都有所減弱，可能因?yàn)槿虞^深，分離得到的微生物是兼性厭氧菌，在好氧環(huán)境中生長時(shí)難以發(fā)揮作用所致，具體原因還需進(jìn)一步探討。

表3 解鉀能力測(cè)定結(jié)果（，n＝3）

表3 解鉀能力測(cè)定結(jié)果（，n＝3）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)篩選得到固氮菌GD-1，通過元素分析儀測(cè)定其有效氮含有量為4.91 mg/L，具有較強(qiáng)的固氮能力；篩選得到2 株解磷菌JP-1、JP-2，通過鉬藍(lán)比色法測(cè)定其釋放的有效磷含有量分別為2.68、4.60 mg/L，均有一定的解磷能力，而且后者更強(qiáng)，但與個(gè)別分離自其他環(huán)境中菌株解磷能力相比［11-12］，解無機(jī)磷能力較弱（最高為4.60 mg/L）；篩選得到3 株解鉀菌JK-1、JK-2、JK-3，通過原子吸收分光光度法測(cè)定其可溶性鉀含有量分別為0.80、0.92、0.90 mg/L，解鉀能力依次為JK-2 強(qiáng)于JK-3 強(qiáng)于JK-1。另外，所得解磷菌、解鉀菌隨著傳代次數(shù)增加解磷、解鉀能力逐漸減弱，與大量文獻(xiàn)報(bào)道一致［13］，原因尚不明確，需作進(jìn)一步探索。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為從中藥藥渣中篩選高效固氮菌、解磷菌、解鉀菌提供了一種思路，可為相關(guān)資源化利用奠定基礎(chǔ)。但與從其他基質(zhì)中篩選微生物相比還存在一定的差距，今后將通過大量篩選或結(jié)合基因工程的方法得到可用于產(chǎn)業(yè)化的堆肥菌劑。