GC-MS/MS 法檢測含薄荷中成藥中的留蘭香

何風(fēng)艷，何 軼，王菲菲，戴 忠，馬雙成

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

薄荷為唇形科植物薄荷Mentha haplocalyxBriq.的干燥地上部分，具有疏散風(fēng)熱、清利頭目、利咽、透疹、疏肝行氣等功效［1］。薄荷的藥用歷史悠久，早在三國時期華佗的《丹方大全》 鼻病方中就多處提及薄荷入藥［2］。作為常用中藥，薄荷在中藥制劑中的使用也非常廣泛，在2015 年版《中國藥典》 中收錄的含薄荷、薄荷素油、薄荷腦的中成藥就達到130 多種。留蘭香又名綠薄荷、香花菜，為薄荷同屬植物留蘭香Mentha spicataL.干燥全草，原產(chǎn)南歐，目前我國河北、江蘇等多個省份有栽培［3］。留蘭香作為重要的香料植物，在食品、日用品等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［4］。留蘭香是近年來薄荷的常見偽品［5-6］，二者雖為同屬植物，但氣味及化學(xué)成分存在差異［7-9］，不可混用。本實驗收集薄荷和留蘭香樣品共18 批，對其揮發(fā)性成分進行比較研究，遴選可能的指標(biāo)成分。在此基礎(chǔ)上，以留蘭香中的特征成分香芹酮為指標(biāo)，對2 個常用中成藥制劑牛黃鎮(zhèn)驚丸、牛黃清胃丸進行薄荷偽品留蘭香的檢查，以期考察中藥成方制劑中留蘭香摻偽薄荷投料的情況，為監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 7890B 氣相色譜-7000C 三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；Mettler AE240、Mettler XS105DU 電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；KQ-300DA 型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

對照品薄荷腦（批號110728-200506）、（-）薄荷酮（批號111705-201105）、胡薄荷酮（111706-201606）、α-蒎烯（110897-200502）、檸檬烯（批號100470-201503）、芳樟醇（111503-201603）、桉油精（110788-201506）、乙酰薄荷酯（批號190044-201001），均購于中國食品藥品檢定研究院；香芹酮對照品（批號C110521000-00610）購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

薄荷藥材12 批，編號1～12，購自北京、太原、阜陽等市各藥店，留蘭香新鮮樣品6 批，標(biāo)號13～18，購自北京市各花卉市場，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院張南平主任藥師鑒定分別為Mentha haplocalyxBriq.和Mentha spicataL.；牛黃鎮(zhèn)驚丸8 批，來自2 家生產(chǎn)企業(yè)；牛黃清胃丸49批，來自18 家生產(chǎn)企業(yè)。乙酸乙酯（分析純）購自北京化學(xué)試劑廠。

2 主要揮發(fā)性成分分析

2.1 對照品溶液制備 精密稱取薄荷腦、（-）-薄荷酮、胡薄荷酮、α-蒎烯、檸檬烯、芳樟醇、桉油精、香芹酮、乙酰薄荷酯對照品適量，分別加乙酸乙酯制成每1 mL 含1.4、1.3、1.3、1.7、1.0、2.5、1.5、2.8、2.1 mg 的溶液，作為對照品貯備液；分別精密移取上述對照品貯備液適量，逐級稀釋，得到每1 mL 含薄荷腦、（-）薄荷酮、胡薄荷酮、α-蒎烯、檸檬烯、芳樟醇、桉油精、香芹酮、乙酰薄 荷酯2.8、2.6、2.6、3.4、2.0、5.0、3.0、5.6、4.2 g 的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 精密稱取薄荷或留蘭香0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯溶液10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，冰浴下超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，乙酸乙酯補足減失質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 分析條件 采用HP-5 MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣；程序升溫，初始溫度50 ℃，5 ℃/min升至150 ℃，20 ℃/min 升至270 ℃，保持10 min；分流比10∶1；進樣口溫度220 ℃；進樣量1 μL。

質(zhì)譜接口溫度300 ℃；離子源溫度230 ℃；電子轟擊電離（EI）模式；轟擊能量70 eV；掃描方式：一級質(zhì)譜全掃描（TIC），使用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）對香芹酮進行檢測，檢測離子對m/z150～135（定量離子對），150～91（定性離子對），碰撞能量均為5 eV。

2.4 TIC 檢測結(jié)果 取薄荷和留蘭香樣品，在“2.3”項條件下進行TIC 檢測。經(jīng)NIST MS Search 2.0 檢索，共鑒定出15 個化合物，其中9 個化合物經(jīng)對照品比對確證。各化合物的相對含有量見表1，總離子流圖見圖1。

表1 不同樣品揮發(fā)性成分（%）

薄荷樣品TIC 圖譜中主要為薄荷腦的色譜峰，部分薄荷樣品TIC 圖譜中較明顯的色譜峰還有薄荷酮、胡薄荷酮、氧化胡椒酮或乙酰薄荷酯的色譜峰。留蘭香樣品的TIC 圖譜中主要為香芹酮和檸檬烯的色譜峰，其中香芹酮色譜峰最高。

為了進一步挖掘薄荷和留蘭香TIC 檢測數(shù)據(jù)的差異，針對9 種已鑒定成分，以各成分所占比值為指標(biāo)，采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計分析。聚類分析結(jié)果表明，12 批薄荷樣品（編號1～12）和6 批留蘭香樣品（編號13～18）可明顯分為2 類，見圖2。主成分分析結(jié)果表明，第一主成分（PC1）的貢獻率為55.72%，第二主成分的貢獻率為（18.16%），累計達到73.88%，能比較全面地反映樣品信息的差異。與PC1 密切相關(guān)的指標(biāo)依次為香芹酮（0.971）、檸檬烯（0.962）、薄荷腦（-0.943）、桉油精（0.936），與PC2 密切相關(guān)的指標(biāo)主要為胡薄荷酮（0.780）。樣品得分圖顯示，12 批薄荷和6 批留蘭香各自聚為一類，見圖3。結(jié)合TIC 圖譜可以看出，香芹酮色譜峰為6 批留蘭香樣品中獨有，薄荷腦色譜峰為12 批薄荷樣品中獨有，檸檬烯和桉油精色譜峰在二者中均可檢出，僅存在峰高差異。香芹酮可以作為指標(biāo)成分檢測薄荷藥材中摻偽的留蘭香。此外，檸檬烯和桉油精對于薄荷和留蘭香的鑒別也具有一定意義，可作為輔助指標(biāo)成分用于復(fù)雜樣品的鑒別。上述結(jié)果與文獻［6-8］基本一致。

2.5 MRM 檢測結(jié)果 為進一步考察香芹酮作為留蘭香檢查指標(biāo)的專屬性，本實驗還采用MRM 法對18 批薄荷及留蘭香中的香芹酮進行測定。與TIC 法相比，MRM 測定專屬性更強，靈敏度更高，可測定樣品中痕量的香芹酮。結(jié)果表明，12 批薄荷樣品中均無香芹酮色譜峰檢出，6 批留蘭香樣品中有明顯香芹酮色譜峰檢出。因此，香芹酮可作為指標(biāo)成分以區(qū)別留蘭香與薄荷。

3 中成藥中薄荷偽品留蘭香檢查

根據(jù)薄荷藥材及留蘭香樣品揮發(fā)性成分對比的結(jié)果，以香芹酮為指標(biāo)，選擇牛黃鎮(zhèn)驚丸、牛黃清胃丸2 個中成藥進行薄荷偽品留蘭香的檢查。

圖1 各樣品總離子流圖

圖2 18 批樣品聚類樹狀圖

圖3 18 批樣品主成分分析圖

3.1 供試品溶液制備 精密稱取牛黃鎮(zhèn)驚丸1.5 g 或牛黃清胃丸6.0 g，加入等量硅藻土，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯溶液20 mL，密塞，稱定質(zhì)量后，冰浴下超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，乙酸乙酯補足減失質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

3.2 檢查方法 在“2.3”項條件下，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，對香芹酮m/z150～135，150～91 進行檢測。

3.3 專屬性 取牛黃鎮(zhèn)驚丸、牛黃清胃丸樣品按照規(guī)定方法測定，結(jié)果表明，在香芹酮對照品保留時間處，陰性樣品中未見干擾，專屬性良好，見圖4～5。

圖4 牛黃鎮(zhèn)驚丸多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

圖5 牛黃清胃丸多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

3.4 檢出限

3.4.1 儀器檢出限 取香芹酮對照品貯備液，逐級稀釋，并進樣測定，以信噪比3∶1 為儀器檢出限，得到香芹酮的儀器檢出限為20 ng/mL。

3.4.2 方法檢出限 取牛黃鎮(zhèn)驚丸、牛黃清胃丸未檢出香芹酮的陰性樣品各1 丸，分別加入質(zhì)量濃度為55.66 g/mL的香芹酮對照品溶液5～40 μL 后，按“3.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，以信噪比3∶1 為檢出限，得到牛黃鎮(zhèn)驚丸和牛黃清胃丸的方法檢出限分別為0.42 μg/丸、0.83 μg/丸。

3.5 結(jié)果判定 2015 年版《中國藥典》（四部）藥材和飲片檢定通則項下規(guī)定“藥屑雜質(zhì)通常不得過3%”。根據(jù)文獻［3］，留蘭香中含油率0.6%～0.7%，精油中香芹酮含有量60%～65%，以留蘭香含油率0.7%、香芹酮含有量60%計，得到牛黃鎮(zhèn)驚丸、牛黃清胃丸薄荷處方量3%留蘭香中的香芹酮為3.39、9.22 μg。取未檢出香芹酮的牛黃鎮(zhèn)驚丸、牛黃清胃丸陰性樣品各1 丸，分別加入3.39、9.22 μg 香芹酮，按“3.1”項下方法制備供試品溶液，在“3.2”項條件下測定。牛黃鎮(zhèn)驚丸、牛黃清胃丸陽性樣品香芹酮的色譜峰面積應(yīng)不得高于各自香芹酮添加陽性樣品的峰面積。

3.6 樣品檢測 取8 批牛黃鎮(zhèn)驚丸和49 批牛黃清胃丸樣品，分別按“3.1”項下方法制備供試品溶液，在“3.2”項條件下測定。結(jié)果表明，8 批牛黃鎮(zhèn)驚丸樣品中，有3批檢出香芹酮，其中2 批香芹酮色譜峰面積較小，1 批香芹酮色譜峰面積遠高于香芹酮添加樣品的峰面積；49 批牛黃清胃丸樣品中，11 批中可檢出香芹酮，峰面積均低于香芹酮添加樣品的峰面積。

4 討論

薄荷原產(chǎn)我國，在南北各省均有分布。它的藥用歷史悠久，在《新修本草》 《本草綱目》 《植物名實圖考》 等歷代本草中均有記載，且古今藥用薄荷品種一致［2，10］。留蘭香原產(chǎn)南歐，自1950 年起開始在我國大規(guī)模引種［4，11］，因此留蘭香非我國傳統(tǒng)使用的薄荷。在臨床功效方面，薄荷疏散風(fēng)熱、清利頭目、利咽、透疹、疏肝行氣，主要用于風(fēng)熱感冒、頭痛、目赤、風(fēng)疹麻疹等癥；留蘭香則具有疏風(fēng)清熱、解表和中、理氣止痛的功效，可用于腹脹、吐瀉、痛經(jīng)、肢麻、跌撲腫痛等癥，二者存在一定差異。目前我國種植的留蘭香主要用于留蘭香精油的生產(chǎn)，作為藥用使用較少。新研究表明，留蘭香還可用于痔瘡［12］、習(xí)慣性便秘［13］、萎縮性胃炎［14］、慢性及潰瘍性結(jié)腸炎［15］以及婦科炎癥［16］的治療。鑒于功效差異，留蘭香不應(yīng)替代薄荷使用，有必要建立含薄荷中成藥中留蘭香的檢查方法。

薄荷屬植物除少數(shù)種外，在北半球溫帶地區(qū)分布廣泛。其精油的化學(xué)組成隨栽培地區(qū)、氣候條件、收獲期等因素存在差異［17-19］?；诨瘜W(xué)分析對薄荷藥材商品規(guī)格劃分研究表明，揮發(fā)油含有量與L-薄荷醇含有量正相關(guān)，建議L-薄荷醇含有量可作為薄荷藥材商品規(guī)格和等級劃分的標(biāo)準(zhǔn)之一［20］。結(jié)合本實驗研究結(jié)果，可以認(rèn)為香芹酮是區(qū)別于薄荷和留蘭香的主要指標(biāo)性成分。

本實驗采用GC-MS/MS 法對制劑中留蘭香進行檢測，具有較高的靈敏度。對于13 批檢出微量香芹酮的陽性樣品，其檢出原因可能為薄荷原料摻入少許留蘭香所致，也不排除藥材種質(zhì)變異所導(dǎo)致。而對于檢出大量香芹酮的陽性樣品（峰面積遠大于香芹酮添加樣品），則存在留蘭香摻偽薄荷投料的可能，建議相關(guān)廠家加強原料質(zhì)量管理，以杜絕此類情況發(fā)生。在今后還應(yīng)持續(xù)關(guān)注薄荷品種問題，保證臨床用藥的有效性。

《中華本草》 中記載含香芹酮的中藥除留蘭香外，含有魚香草、五香草、石薺苧、荊芥、艾葉、茵陳蒿、白豆蔻、五色梅、藏茴香、柴胡、蒔蘿子、乳香、崗松、麻根、紫菜、石莼等16 種［21］。牛黃鎮(zhèn)驚丸、牛黃清胃丸處方中均不包含上述藥味。但是進一步檢索發(fā)現(xiàn)，個別文獻報道牛黃清胃丸中的菊花中含有少量的香芹酮［22-23］。本實驗中有部分批次的牛黃清胃丸中可檢出微量香芹酮，有可能就是由菊花藥材引入。上述樣品中檢出的香芹酮含有量均較低，約為擬定限度的30%，對測定未構(gòu)成影響。但是，菊花作為觀賞和藥用植物，栽培歷史悠久、類群多樣，不同藥用類型的揮發(fā)油含有量及其組成存在顯著差異［24-27］，且目前香芹酮在菊花中的檢出結(jié)果文獻報道也不統(tǒng)一。本實驗結(jié)果顯示，菊花中可能含有的香芹酮并未影響測定結(jié)果，但仍然有待進一步研究確認(rèn)。