蓮子心化學(xué)成分測定方法研究進(jìn)展

姜 濤，劉子禎，姚藝新

（康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 普寧 515300）

蓮子心為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的成熟種子中的干燥幼葉及胚根?！侗静菥V目》 記載蓮薏（即蓮子中青心也），苦寒無毒，能清心去熱，治血渴、產(chǎn)后渴，止霍亂［1］?！侗静菰傩隆?記載入心、肺、腎三經(jīng)，能清心火、平肝火、瀉脾火、降肺火、清暑除煩、生津止渴、治目紅腫［1］?！吨袊幍洹?記載蓮子心味苦，性寒，歸心經(jīng)和腎經(jīng)，具有清心安神、交通心腎、澀精止血的作用，主要治療熱入心包、神昏譫語、心腎不交、失眠遺精及血熱吐血等。現(xiàn)代研究表明蓮子心含有蓮心堿、甲基蓮心堿、去甲烏藥堿等生物堿類，夏佛碳苷、蘆丁、金絲桃苷等黃酮類及揮發(fā)油類［2］。具有抗心律失常、抗癌、抗心肌缺血、抗氧化、降血壓、降血糖、抑制血小板聚集、松弛平滑肌、強(qiáng)心、中樞抑制等藥理作用，在臨床可用于內(nèi)科、婦科、兒科的多種疾?。?］。

近期，市售蓮子心按《中國藥典》 進(jìn)行含有量測定檢驗(yàn)鮮有合格品（藥典規(guī)定蓮子心按干燥品計(jì)算，含蓮心堿不得少于0.20%）。實(shí)驗(yàn)過程中存在以下問題［3］，用2%鹽酸甲醇溶液提取供試品中蓮心堿時(shí)，鹽酸與蓮心堿不能成鹽增加蓮心堿溶解度，相反因破壞蓮心堿氫鍵會降低其溶解度；在供試品溶液制備過程中，加流動相（乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸（56∶43∶1）稀釋至刻度時(shí)，會生成白色沉淀且超聲不溶解；按藥典方法配制流動相時(shí)，流動相因含十二烷基磺酸鈉（一種表面活性劑、發(fā)泡劑）易起泡沫且不易消失；在分析檢測時(shí)，被檢測色譜峰處存在基線漂移且附近有雜質(zhì)峰存在，易干擾。因此，課題組就1992 年至今國內(nèi)外有關(guān)蓮子心主要化學(xué)成分的定量分析方法進(jìn)行歸納總結(jié)，并提出相對較優(yōu)的生物堿含有量測定方法，以期為蓮子心及相關(guān)大健康產(chǎn)品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供有益的借鑒，為中藥中生物堿類成分的色譜分析提供參考。

1 生物堿類

1.1 蓮心堿 蓮心堿為《中國藥典》 中蓮子心的含有量測定指標(biāo)成分，具有抗心律失常、抗癌、抗氧化、抗癡呆、抗抑郁、抗HIV 等活性［4-10］。

宋進(jìn)閩等［11］采用硅膠G 板，以氯仿-丙酮-二乙胺（6∶4∶1）為展開劑，用薄層掃描法（TLCS）測定了蓮子心中蓮心堿的含有量，該研究是最早的蓮子心含有量測定研究。之后，胡學(xué)民等［12］對比研究了冷浸提取法與回流提取法提取蓮子心中蓮心堿，同樣采用TLCS 測定其含有量，2 種提取方法提取的蓮心堿含有量分別為0.939%、0.853%?；亓魈崛》ㄌ崧瘦^冷浸法提率低，可能是由于蓮心堿為熱敏成分，回流提取溫度較高導(dǎo)致部分蓮心堿結(jié)構(gòu)破壞［13］。早期多采用TLCS 對化學(xué)成分進(jìn)行定量，現(xiàn)在HPLC 已廣泛應(yīng)用于各類化學(xué)成分的定量分析。張先洲等［14］用正相HPLC 法同時(shí)測定江西、湖南、湖北蓮子心蓮心堿的含有量，但其采用正相流動相（二氯甲烷-異丙醇-二乙胺）毒性大且易導(dǎo)致液相系統(tǒng)壓力過大，HPLC 參數(shù)見表1，不宜推廣。壽國香等［15］采用離子對反相HPLC 法測定了10 個(gè)產(chǎn)地蓮子心中蓮心堿的含有量，其流動相采用醇-水-冰醋酸-辛烷磺酸鈉-乙酸鈉，配制較《中國藥典》 流動相乙腈-0.015 mol/L 十二烷基磺酸鈉溶液更為簡便且不易起泡。另外，在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)蓮心堿穩(wěn)定性較差，建議用蓮心堿高氯酸鹽作對照品。壽國香等［16］后續(xù)對蓮心堿、蓮心堿高氯酸鹽的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，證實(shí)蓮心堿穩(wěn)定性差且對光照敏感，蓮心堿高氯酸鹽則比較穩(wěn)定。吳梅青等［17］照《中國藥典》 蓮子心HPLC 含有量測定法測定了湖南6 個(gè)不同產(chǎn)地的蓮子心樣品，蓮心堿含有量在0.21%～0.32%范圍內(nèi)，均合格，其中含有量最高者為湘潭的蓮子心。唐湘?zhèn)ィ?8］建立了HPLC 快速測定7 個(gè)產(chǎn)地蓮子心中荷葉堿、蓮心堿、蘆丁含有量的方法，測得湘潭樣品含有量約0.054%。該方法為避免黃酮苷水解、生物堿提取不充分，采用2%鹽酸甲醇超聲提取后加乙二胺調(diào)PH 至堿性，為類似成分的含有量研究提供參考。石炳娟等［3］發(fā)現(xiàn)蓮子心鮮品含有量常出現(xiàn)不合格情況，故對《中國藥典》 蓮子心含有量測定方法進(jìn)行改進(jìn)為80%乙醇冷浸30 min 后超聲30 min，該法蓮心堿提取率是藥典方法提取率的1.92 倍，且各成分分離度高，該法提取條件相比《中國藥典》 方法更為簡便。上述研究多采用離子對試劑為流動相添加劑，易起泡沫，王紅敏等［4］首次以1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體為流動相添加劑，建立了HPLC 同時(shí)測定蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿含有量的方法。與上述其他色譜條件相比，該條件下被測成分色譜峰峰形良好，且無明顯的干擾峰。

除HPLC 色譜法外，毛細(xì)管電泳色譜法（CEC）也可被用于蓮心堿的定量分析。羅珍連等［19］采用CEC 測定蓮子心藥材蓮心堿含有量為0.24%，分析時(shí)間僅10 min 且耗試劑少，但色譜峰對稱性不好。

1.2 甲基蓮心堿 甲基蓮心堿具有抗腫瘤、降血脂、抗炎、抗氧化、抗失憶、抗抑郁等活性，常被作為蓮子心含有量測定研究中指標(biāo)性化學(xué)成分之一［9，20-23］。胡學(xué)民等［24］用TLCS 測得福建、江西瑞昌、湖北洪湖產(chǎn)蓮子心中甲基蓮心堿含有量分別為0.199%、0.246%、0.248%。張先洲等［14］用正相HPLC 法同時(shí)測定江西、湖南、湖北蓮子心中甲基蓮心堿的含有量，其供試品制備操作非常復(fù)雜（包含甲醇提取、3% 枸櫞酸溶解、乙醚萃取、調(diào)pH 等），難以達(dá)到良好的重現(xiàn)性。壽國香等［25］采用反相HPLC 法測定了不同產(chǎn)地、不同商品來源的蓮子心中甲基蓮心堿的含有量，發(fā)現(xiàn)不同來源的蓮子心含有量變化較大，最高可達(dá)0.88%（江蘇），最低則低于檢測限（湖北）。

1.3 去甲烏藥堿 蓮子心中去甲烏藥堿是一種強(qiáng)心成分?；輵?zhàn)鋒等［26］建立了測定蓮子心提取物中去甲烏藥堿的HPLC-UV 分析方法，方法簡單、準(zhǔn)確。但去甲烏藥堿為蓮子心的微量成分，用紫外檢測器定量靈敏度低。田海峰等［27］以9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯為熒光衍生化試劑，建立了柱前熒光衍生化HPLC 分析去甲烏藥堿含有量的高靈敏方法。方法選擇性好、準(zhǔn)確度高，能夠滿足含去甲烏藥堿中藥材的質(zhì)量控制。

1.4 荷葉堿 荷葉堿具有降脂減肥、抗氧化、抑菌、抗腫瘤等作用［28-29］。唐湘?zhèn)ィ?8］建立了HPLC 快速測定帶心湘蓮中荷葉堿、蓮心堿、蘆丁含有量的方法。湘潭的湘蓮蓮子心荷葉堿含有量最高（約0.060%），長沙的的樣品荷葉堿含有量最低（約0.022%）。Ryu 等［30］采用HPLC 建立了快速同時(shí)測 定蓮子心中neferine、1，2，3，4-tetrahydro-1-［（4-hydroxyphenyl）methyl］-2-methyl-7-isoquinolinol、1-hydroxy-2-methylpropene、3-（prop-1-enyl）benzene-1，2，4，5-tetrol 含有量的方法，該方法分離度好，準(zhǔn)確度高。

1.5 蓮心季銨堿 商晶等［31］用HPLC 建立了蓮子心中蓮心季銨堿含有量測定的方法，該方法測得湖南、福建、山東、浙江、江西、江蘇蓮子心中蓮心季銨堿含有量分別約0.5%、0.5%、0.45%、0.48%、0.32%。該方法流動相堿性不強(qiáng)不會損壞色譜柱壽命，且對水溶性的蓮心季銨堿具有良好的保留性，適用于蓮子心蓮心季銨堿的定量分析。

1.6 總生物堿 袁小紅［32］采用紫外-可見分光光度法（UV-VIS）建立了蓮子心微囊中總生物堿的含有量測定方法，測得蓮子心提取物微囊總生物堿含有量均值約為0.49%。該方法可以反映蓮子心生物堿整體情況，但不能明確總生物堿中各成分含有量。王曉穎等［33］建立同時(shí)測定蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿及甲基蓮心堿含有量的HPLC方法，測得福建蓮子心總堿（以蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿含有量之和計(jì)）的含有量在1.50%～2.00%。涂霞等［34］分別用高效液相色譜-熒光檢測器與高效液相色譜-紫外檢測器測定蓮子心中蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿含有量，發(fā)現(xiàn)2 種方法測定結(jié)果相近，均可用于蓮子心藥材中酚性生物堿的定量控制。熒光檢測器因只適合于能產(chǎn)生熒光吸收化合物的測定，故可避免有紫外吸收但無熒光吸收的雜質(zhì)成分干擾。潘揚(yáng)等［35］用HPLC 法同時(shí)測定37 批蓮子心中蓮心季銨堿、蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿的含有量，發(fā)現(xiàn)各成分含有量相差很大，蓮心堿0～1.854%、異蓮心堿0～1.337%、甲基蓮心堿0～1.185%、蓮心季銨堿0.115%～0.818%、總生物堿0.787%～2.289%。該方法雖準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，但色譜分析時(shí)間較長，超過1 h，有待優(yōu)化。劉久石等［36］建立蓮子心HPLC 指紋圖譜并測得12批蓮子心中蓮心堿含有量在0.43%～1.8%、異蓮心堿含有量在ND～0.52%（ND 為未檢測到）、甲基蓮心堿含有量在0.25%～1.4%。該研究比較了不同色譜柱，發(fā)現(xiàn)Agilent ZORBAX SB-Aq C18親水性色譜柱可以延遲出峰時(shí)間，獲得更多的色譜信息。王珊等［37］建立了蓮子心HPLC 指紋圖譜分析方法，對9 批不同產(chǎn)地的蓮子心藥材進(jìn)行相似度評價(jià)，同時(shí)進(jìn)行了蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿的含有量測定。結(jié)果表明不同產(chǎn)地蓮子心無論在指紋圖譜相似性，還是在單一生物堿含有量或總生物堿含有量方面均存在較大差異，以生物堿類化合物為指標(biāo)成分評價(jià)蓮子心質(zhì)量有待進(jìn)一步研究。

2 黃酮類

2.1 夏佛碳苷 王晶晶等［38］采用HPLC 分析不同來源蓮子心的水提物中黃酮類成分并進(jìn)行抗炎活性研究，發(fā)現(xiàn)夏佛碳苷（含有量為0.97%～1.47%）是所有水提物中含有量最高的黃酮類化合物，也是關(guān)鍵抗炎活性成分。

2.2 蘆丁、金絲桃苷 黃酮類也是蓮子心主要化學(xué)成分，具有保護(hù)心肌、降血脂、抗氧化等作用［39］。唐湘?zhèn)ィ?8］建立了HPLC 快速測定蓮子心蘆丁含有量的方法，該方法簡單快速，定量準(zhǔn)確，測得衡陽蓮子心蘆丁含有量最高，常德蓮子心蘆丁含有量最低，分別約0.092%、0.050%。曾建偉等［40］用HPLC 法測定蓮子心中蘆丁的含有量，僅檢測到蘆丁，并未檢測到金絲桃苷和木犀草素。但許雪琴等［41］采用CEC 檢測到蓮子心中蘆丁與金絲桃苷，同時(shí)測了荷葉堿的含有量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)工作電極為微碳圓盤電極（Ф=0.5 mm），檢測電位為+0.95 V，運(yùn)行液 為50 mmol/L Na2B4O7和100 mmol/L NaH2PO4緩沖液（pH 7.25），分離電壓為15 kV 時(shí)，3 種成分在15 min 內(nèi)可以完全分離。

2.3 總黃酮 夏稼紅等［42］以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法在紫外可見分光光度儀上測定37 個(gè)蓮子心藥材中總黃酮含有量，發(fā)現(xiàn)蓮子心總黃酮含有量與產(chǎn)地?zé)o關(guān)，含有量波動范圍為0.46%～1.66%，RSD高達(dá)24%。張麗珍等［43］也采用相同方法測定了來自湖南、福建、江蘇、浙江、江西、安徽的蓮子心藥材中的總黃酮含有量，測得樣品含有量相差甚大，含有量最高為1.52%，最低為0.66%。由此可見，蓮子心中總黃酮成分含有量可能受產(chǎn)地影響較大。

表1 蓮子心化學(xué)成分含有量測定色譜條件

3 揮發(fā)油

康林芝等［44］采用GC-MS 測定不同溫度處理的蓮子心精油成分含有量，見表2，發(fā)現(xiàn)溫度越高，蓮子心精油成分差異越顯著，當(dāng)處理溫度為120 ℃時(shí)，蓮子心精油成分和精油香氣值相對穩(wěn)定。喻東［45］用GC-MS 測得蓮子心乙醇提取物的揮發(fā)油主要成分是順式-9-十六烯醛、棕櫚酸甲酯、5-羥甲基-2-呋喃甲醛，其在樣品中的相對含有量分別為43.43%、21.51%、7.75%。張連文等［46］采用GC-MS 測定了蓮子心中17 種揮發(fā)油成分，發(fā)現(xiàn)各成分含有量均較高，其 中9，12-octad ecadienoic acid、heneicosanoic acid、eicosanoic acid、docosanoic acid 4 種烯酸含有量最高。潘揚(yáng)等［47］用GC-MS 測定了蓮子心中烯酸類、烷酸類等16 種脂溶性成分在樣品中的相對含有量，其中9，12-十八碳二烯酸相對含有量在被測7 個(gè)產(chǎn)地樣品中均最高，約40%（歸一化法含有量）。該研究在分析前對脂肪酸進(jìn)行了甲酯化，不僅降低脂肪酸的沸點(diǎn)還可避免高溫破壞脂肪酸結(jié)構(gòu)。林文津等［48］采用GC-MS 對比研究了超臨界CO2萃取法與水蒸氣蒸餾法提取的蓮子心揮發(fā)性化學(xué)成分，用歸一化法測定成分含有量，結(jié)果顯示2 種提取方法提取的揮發(fā)油組分及含有量相差較大，前者可提取出低沸點(diǎn)成分、熱不穩(wěn)定的揮發(fā)性成分，較后者更真實(shí)、全面地反映蓮子心揮發(fā)油成分信息。

表2 蓮子心揮發(fā)油成分含有量測定色譜參數(shù)

4 甾醇

甾醇有降血脂活性，已被應(yīng)用到臨床實(shí)踐中［49］。陳佳麗等［50］采用GC-MS 檢測到蓮子心中7 種甾醇成分。其中，谷甾醇（58.27%）相對含有量最高，其次是Δ5-燕麥甾烯醇（22.99%）和菜油甾醇（12.64%）。

5 總結(jié)與展望

表1 顯示，隨著蓮子心化學(xué)成分的深入研究，其成分檢測方法已從早期的薄層掃描法、紫外分光光度法，發(fā)展到目前廣泛使用的液相色譜法，其含有量測定檢測成分種類已從雙芐基異喹啉生物堿向黃酮類、揮發(fā)油類擴(kuò)展，測定成分?jǐn)?shù)量已由單一成分到多類成分同時(shí)測定方向發(fā)展。早期，TLCS 依據(jù)樣品斑點(diǎn)的吸光度進(jìn)行定量，易受薄層板均勻度、點(diǎn)樣準(zhǔn)確度、顯色劑的噴霧均勻度影響。如遇蓮心堿等易受光照、溫度、空氣影響的成分，用TLCS 定量時(shí)其薄層色斑穩(wěn)定性不好會導(dǎo)致定量不夠準(zhǔn)確。UV-VIS 主要用于蓮子心中總生物堿、總黃酮等大類成分的含有量測定，其結(jié)果雖能反映大類成分總量但缺乏準(zhǔn)確性。CEC 可用于蓮子心生物堿類和黃酮類成分的檢測，具有操作簡單、試樣量少、分離效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。HPLC 因具有精密度高、重現(xiàn)性好、誤差小的特點(diǎn)，已成為蓮子心最主要的含有量測定方法。GC-MS 用于蓮子心中揮發(fā)油成分的含有量測定。中藥藥效是多成分、多靶點(diǎn)作用的結(jié)果，建立與藥效密切相關(guān)成分的質(zhì)量控制方法具有重要意義。蓮子心降脂作用的生物堿成分群與抗炎作用的黃酮成分群引起了越來越多的關(guān)注［51-54］，但《中國藥典》 僅以單一成分蓮心堿為含有量測定指標(biāo)，因此，亟需建立蓮子心藥材多成分質(zhì)量控制方法。

近年來，以離子液體為流動相添加劑的色譜分析方法開始被應(yīng)用于蓮子心生物堿類成分的色譜分析［4］，其分離效率、色譜峰分離度及對稱性均比傳統(tǒng)以三乙胺為添加劑的流動相有顯著提高，同時(shí)也不會像以十二烷基磺酸鈉為添加劑的流動相容易起泡沫。離子液體是一種由體積相對較大的有機(jī)陽離子和有機(jī)或無機(jī)陰離子構(gòu)成的室溫離子液體，其具有綠色環(huán)保、熱穩(wěn)定性高、蒸汽壓低、不可燃、不易揮發(fā)、水中溶解度高、對流動相pH 影響極小等特性［55］，可作為流動相添加劑用于結(jié)構(gòu)相似且分離度差、峰形差的生物堿成分的色譜分析。因此，本文建議在控制以生物堿為主成分的中藥的質(zhì)量時(shí)，不妨采用以離子液體為流動相添加劑的色譜分析方法。