原料配比對(duì)膽南星成分及藥效影響

李澤煜，潘 多，單國(guó)順，許 枬，高 慧，賈天柱

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

2017 年藥智網(wǎng)公布連續(xù)3 年抽查發(fā)現(xiàn)9 個(gè)廠家的膽南星不合格，其中5 家屬假冒，膽南星質(zhì)量問題可見一斑。膽南星的炮制工藝為制天南星的細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)加工而成，或用生天南星細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)發(fā)酵而成，實(shí)際生產(chǎn)以后者居多［1］。傳統(tǒng)理論非常重視膽南星的膽汁用量。如《本草》 言，“其功如牛黃者，即膽汁之精華耳”［2］?！端幤坊x》 曰，“膽星，意不重南星而重膽汁，借星以收取汁用，非如他藥監(jiān)制也，故必須九制則純。假膽以清膽氣，星以豁結(jié)氣，大能益肝鎮(zhèn)驚”［3］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)膽南星抗驚厥和抑制中樞興奮作用強(qiáng)弱與膽汁的用量有關(guān)［4］。但因活性成分不清楚，原料配比對(duì)膽南星藥效作用影響研究不夠深入，實(shí)際生產(chǎn)中膽汁配比不足是導(dǎo)致膽南星質(zhì)量問題的主要原因［5］。為深入揭示原料配比對(duì)膽南星的成分和功效的影響，提高膽南星質(zhì)量，本研究采用6 種成分為指標(biāo)［6-7］，考察不同膽汁配比對(duì)膽南星成分的影響。同時(shí)，依據(jù)功效和臨床主治癥，選擇大鼠酵母致熱實(shí)驗(yàn)、小鼠氣管段酚紅法和小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)考察膽汁配比對(duì)膽南星藥效的影響，以期為規(guī)范膽南星生產(chǎn)工藝提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 cquity 超高效液相色譜分析系統(tǒng)、TSQ 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；jnt-lgj型電子體溫計(jì)（北京翼諾泰科技發(fā)展有限公司）：UX4200S 型電子天平（上海衡發(fā)實(shí)業(yè)有限公司）；Victor X5 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmery 公司）；大鼠IL-1β ELISA 試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司，S20171219HF）；大鼠IL-6 ELISA 試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司，S20171213SD）；大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司，S20171208GY）；UV-752 型紫外可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 膽南星，取采集于遼寧千山地區(qū)，經(jīng)遼寧省藥品檢驗(yàn)所王維寧主任藥師鑒定為東北天南星Arisaema amurenseMaxim.的干燥塊莖，粉碎，按文獻(xiàn)［3］方法，分別加入1/3 倍量豬膽汁、1倍量豬膽汁、3 倍量豬膽汁，制成膽南星，平行3份。布洛芬片（規(guī)格0.1 g/片，由吉林萬(wàn)通藥業(yè)集團(tuán)鄭州萬(wàn)通復(fù)升藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H41025653）。酵母菌（安琪酵母股份有限公司，批號(hào)20161212）。磷酸可待因（青海制藥廠有限公司，批號(hào)20100110）；氯化銨片（北京中新制藥廠，批號(hào)120901）。牛磺鵝 去氧膽酸（批號(hào)100078-200414A）、?；秦i去氧膽酸（批號(hào)100078-200414）、鵝去氧膽酸（批號(hào) 100078-200414）、豬去氧膽酸（批號(hào)100078-200414）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甘氨鵝去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸由本實(shí)驗(yàn)室提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)98%。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)3 月齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXX（遼）2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 LC-MS 法測(cè)定膽南星中6 種膽汁酸成分

2.1.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0 min，35%A；2 min，45%A；10 min，48%A；11 min，100%A）；柱溫35 ℃；體積流量0.40 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑氣流N2；體積流量900 L/h；脫溶劑溫度450 ℃；錐孔氣流N2；體積流量50 L/h；離子源溫度150 ℃；碰撞氣體氬氣。采用MRM 定量模式，6 種分析物的質(zhì)譜分析條件參數(shù)見表1，總離子流圖見圖1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of various constituents

圖1 各成分總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

2.1.3 混合對(duì)照品制備 精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇制成單一對(duì)照品溶液，作為貯備液。分別吸取各單一對(duì)照品貯備液1.0 mL，置于100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成含豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、?；秦i去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸分別為8.78、16.88、6.24、19.73、27.18、21.97 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。內(nèi)標(biāo)液為綠原酸，質(zhì)量濃度為5 μg/mL。

2.1.4 供試品溶液制備 精密稱取膽南星粉末0.2 g，置具塞三角瓶中，加甲醇5 mL，密塞，精密稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，50 kHz）30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 線性關(guān)系考察 分別準(zhǔn)確取“2.1.3”項(xiàng)下各對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋，配制系列梯度質(zhì)量濃度的對(duì)照品混合溶液，測(cè)定前按1∶1加入內(nèi)標(biāo)。依法測(cè)定峰面積，以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并以信噪比為10 計(jì)算定量限（LOQ），以信噪比為3計(jì)算檢測(cè)限（LOD），結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取編號(hào)SCFZ-1 樣品0.2 g，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得樣品中豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、牛磺豬去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸的RSD 分別為4.79%、2.09%、1.86%、2.25%、2.66%、2.57%。表 明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5.3 精密度試驗(yàn) 吸取混合對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下，日內(nèi)重復(fù)測(cè)定6 次，連續(xù)測(cè)定3 d，測(cè)得豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、?；秦i去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸的日內(nèi)精密度RSD 分別為0.85%、1.5%、1.16%、0.80%、0.51%、1.30%，日間精密度RSD 分別為2.43%、1.98%、1.96%、1.53%、2.52%、3.34%，表明該儀器精密度良好。

2.1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取編號(hào)為SCFZ-1 的膽南星粉末6 份，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得樣品中豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、?；秦i去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸含有量 RSD 分別為3.54%、3.77%、3.43%、4.09%、4.25%、3.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取與重復(fù)性試驗(yàn)同批次已知含有量（編號(hào)SCFZ-1）的膽南星樣品9 份（每份0.1 g），精密加入低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的6 種對(duì)照品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。得豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、牛磺豬去氧膽酸、牛磺鵝去氧膽酸平均加樣回收率分別為99.7%、99.6%、99.3%、99.5%、99.6%、99.3%，RSD 分別為 1.01%、1.07%、1.88%、1.57%、1.94%、1.64%。

2.1.6 樣品含有量測(cè)定 稱取3 種不同原料配比的膽南星粉末，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別吸取混合對(duì)照品溶液及供試品溶液各2 μL，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、?；秦i去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸的含有量，結(jié)果見表3。

2.2 解熱作用研究

2.2.1 受試藥物配制 取不同原料配比膽南星，加80%乙醇提取2 次，每次提取1 h，濾過，合并濾液，回收溶劑，濃縮成1.02 g/mL 的藥液，置于冰箱備用。

2.2.2 大鼠酵母致熱實(shí)驗(yàn) 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，從第8 天開始每天測(cè)量肛溫2 次，時(shí)間間隔為0.5 h，將連續(xù)3 d 體溫小于38 ℃和大于36 ℃，以及2 次溫差＞0.5 ℃的大鼠剔除。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，連續(xù)測(cè)量體溫2 次，間隔0.5 h，將2 次溫度的平均值作為基礎(chǔ)體溫。同時(shí)，剔除體溫大于38 ℃者。剩余大鼠隨機(jī)分成6 組，即正常對(duì)照組、模型組、布洛芬組、高比膽南星組（膽汁占原料比為3∶1）、中比膽南星組（膽汁占原料比為1∶1）、低比膽南星組（膽汁占原料比為1∶3），每組8 只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水12 h，正常組大鼠背部皮下注射無(wú)菌生理鹽水，其余各組大鼠背部皮下注射10% 酵母菌10 mL/kg［8］。造模5 min 后，布洛芬組給藥劑量為20 mg/kg，各受試藥物組分別灌胃給予相應(yīng)的膽南星藥液1.7 g/kg。正常組與模型組大鼠灌胃給予同體積生理鹽水。分別于給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h 測(cè)量體溫，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)測(cè)量2 次。最后1 次測(cè)定體溫后，麻醉取血，分取血清，用于IL-1、IL-6、TNF-α 含有量測(cè)試。

2.3 祛痰作用

2.3.1 小鼠氣管酚紅排泄實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［9］方法，采用小鼠氣管段酚紅法分別對(duì)3 種不同原料配比膽南星的80%醇提取物進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)。每組均為10 只小鼠，雌雄各半。昆明種小鼠適應(yīng)1周，實(shí)驗(yàn)分組同“2.2.2”項(xiàng)，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h，正常組灌胃給予蒸餾水，陽(yáng)性藥物組灌胃給予氯化銨1 g/kg，給藥組分別灌胃給予3 種膽南星醇提取物，給藥量10 mL/kg，1 次/d，連續(xù)5 d。末次給藥30 min 后，各組小鼠腹腔注射5%酚紅生理鹽水溶液（10 mL/kg）0.2 mL，45 min后將小鼠麻醉處死，將其仰位固定于手術(shù)板上，剪開頸正中皮膚，分離氣管，剪取自甲狀軟骨處至氣管分叉處的氣管段，取出氣管后，放入盛有2 mL生理鹽水的試管中，超聲15 min，加入5%NaHCO3溶液2 mL，置紫外分光光度計(jì)下558 nm處測(cè)吸光度（A）。

2.3.2 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取研磨過的酚紅粉末2.50 mg，置于50 mL 量瓶中，用生理鹽水溶解并定容，配制成50 μg/mL 酚紅溶液，用移液管精密吸取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL 該溶液于10 mL 量瓶中并用生理鹽水定容，分別加入5% NaHCO3溶液1.00 mL，在紫外分光光度計(jì)558 nm 處測(cè)定A值，以吸光度為縱坐標(biāo)（A），溶液中酚紅的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C）進(jìn)行回歸，得回歸方程A=0.1634C-0.001 7（r=0.999 3）。表明酚紅溶液在0～30 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 止咳作用實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［10］方法，采用濃氨水刺激小鼠黏膜引咳實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)不同原料配比膽南星80%乙醇提取物進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)分組同“2.2.2”項(xiàng)，隨行設(shè)置正常對(duì)照組和陽(yáng)性藥組。昆明種小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h。對(duì)照組灌胃給予含2 滴1%聚山梨酯-80 的0.5% CMC-Na，陽(yáng)性藥物組灌胃給予磷酸可待因30 mg/kg，給藥組分別灌胃給予3 種膽南星的醇提取物，1 次/d，連續(xù)7 d。末次給藥1 h 后，分別將小鼠按照分組順序放置于倒置的500 mL 容器中，內(nèi)放一棉球，用1 mL 注射器吸取25%氨水0.3 mL 注入棉球，迅速倒置容器（以防氣體泄漏），秒表記錄時(shí)間，觀察記錄小鼠的咳嗽潛伏期（從記錄時(shí)間起到小鼠第1 次咳嗽的時(shí)間）、3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)（以小鼠腹肌收縮，張大口同時(shí)并伴有咳嗽聲為準(zhǔn)），計(jì)算抑咳率。抑咳率%=（對(duì)照組咳嗽次數(shù)-給藥組咳嗽次數(shù)）/對(duì)照組咳嗽次數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行計(jì)量資料分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，結(jié)果用（）表示。

2.6 3 種原料比例膽南星中膽汁酸成分含有量 結(jié)果見表3。表明不同原料比例膽南星中膽汁酸含有量差異較大，尤其是結(jié)合型膽汁酸比例差異更加顯著。

表3 不同原料比例樣品中6 種成分含有量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.3 Results of content determination of six constituents in different ratio samples（n＝3）

2.7 解熱作用比較

2.7.1 對(duì)干酵母致熱大鼠體溫變化的影響 圖2顯示，造模后模型組大鼠平均體溫逐漸升高，7 h達(dá)到峰值，隨后開始下降。各受試藥物組大鼠平均體溫上升幅度均小于模型組，尤其是造模5 h之后差異顯著（P＜0.01）。高比膽南星組和中比膽南星組的解熱作用強(qiáng)于低比膽南星組組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠平均體溫變化曲線Fig.2 Change curve of average body temperature of rats in each group

2.7.2 對(duì)致熱大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 含有量的影響 表4 表明，給藥10 h 后，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含有量上升（P＜0.01）。與模型組比較，布洛芬組、高比膽南星組和中比膽南星組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含有量均下降（P＜0.01），但低比膽南星組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含有量無(wú)降低（P＞0.05）。

表4 不同來(lái)源樣品對(duì)干酵母致熱大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 含有量的影響（，n＝8）Tab.4 Effects of samples from different sources on the contents of IL-1β，IL-6 and TNF-α in serum of rats induced by dry yeast（，n＝8）

表4 不同來(lái)源樣品對(duì)干酵母致熱大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 含有量的影響（，n＝8）Tab.4 Effects of samples from different sources on the contents of IL-1β，IL-6 and TNF-α in serum of rats induced by dry yeast（，n＝8）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

2.8 祛痰作用比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同膽汁用量的膽南星祛痰作用有一定差異，結(jié)果見表5。與對(duì)照組比較，氯化銨組、3 種膽南星組均能增加小鼠酚紅排泌量（P＜0.01）；高比膽南星組和中比膽南星的祛痰作用強(qiáng)于低比膽南星組。

表5 不同原料比例樣品祛痰作用比較（，n＝10）Tab.5 Comparison of phlegm removing effects of samples made by different ratio raw materials（，n＝10）

表5 不同原料比例樣品祛痰作用比較（，n＝10）Tab.5 Comparison of phlegm removing effects of samples made by different ratio raw materials（，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，??P＜0.01；與低比膽南星組比較，#P＜0.05。

2.9 止咳作用比較 不同膽汁用量的膽南星止咳作用差異較小，結(jié)果見表6。與對(duì)照組比較，磷酸可待因組、及3 種膽南星各組均能延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期，減少小鼠3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)（P＜0.05，P＜0.01），但3 種受試藥物組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表6 不同原料比樣品止咳作用比較（，n＝10）Tab.6 Comparison of arresting cough effects of samples made by different ratio raw materials（，n＝10）

表6 不同原料比樣品止咳作用比較（，n＝10）Tab.6 Comparison of arresting cough effects of samples made by different ratio raw materials（，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，??P＜0.01。

3 討論

實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有廠家生產(chǎn)膽南星時(shí)膽汁占原料比甚至低于40%。故結(jié)合傳統(tǒng)工藝和實(shí)際生產(chǎn)，本研究以膽汁占原料配比為3∶1、1∶1、1∶3 分別制備膽南星，考察原料配比對(duì)膽南星成分和藥效的影響。并基于膽南星的清熱化痰功效及其臨床常用于治療小兒高熱驚風(fēng)癥以及痰熱咳嗽等癥［3］，選擇解熱、止咳、化痰作用進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)。

不同膽汁配比的膽南星中6 種膽汁酸含有量差異較大，尤以結(jié)合型膽汁酸更為顯著，這與膽汁中富含膽汁酸類成分相吻合［11-12］。IL-1β 是重要的致熱細(xì)胞因子［13］，IL-6 是多種發(fā)熱的中間物質(zhì)，TNF-α 是一種重要的內(nèi)源性致熱原［14］。從酵母致熱大鼠給藥后炎癥因子的變化可見，不同原料配比膽南星的解熱作用差異可能與其調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6和TNF-α 炎癥因子分泌量變化有關(guān)。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膽汁用量大，則膽南星的解熱、祛痰作用良好，反之作用減弱，但對(duì)止咳作用影響較小。結(jié)合膽汁酸具有解熱、祛痰和止咳等作用，表明膽汁用量與膽南星的功用關(guān)系密切。依據(jù)藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果，膽南星的膽汁用量與天南星的比值不應(yīng)低于1∶1。本研究只是做了初步的膽汁酸成分與藥效作用的比較，原料配比對(duì)其他成分及活性影響還需進(jìn)一步深入研究，從而為膽南星質(zhì)量控制提供更充分依據(jù)。