液相色譜儀檢定中的問題及建議

/ 上海市計量測試技術(shù)研究院

0 引言

液相色譜儀具有快速、靈敏、高選擇、高分離效率及適用范圍廣等特點，廣泛應(yīng)用于食品藥品的定性與定量檢測等領(lǐng)域，是分析實驗室必備的理化分析測試儀器。隨著液相色譜技術(shù)的不斷發(fā)展，儀器的更新?lián)Q代，液相色譜儀第一版檢定規(guī)程自1991年01月01日發(fā)布實施已經(jīng)經(jīng)過兩輪修訂，能夠較好與儀器的發(fā)展水平相適應(yīng)。但是，由于儀器應(yīng)用面較廣，各行業(yè)對儀器的性能要求的側(cè)重也不同，本文根據(jù)檢定實踐積累，對規(guī)程中泵流量測定、波長示值誤差與重復(fù)性、線性范圍等內(nèi)容提出方法改進和優(yōu)化的建議，為規(guī)程的修訂提供參考。

1 輸液系統(tǒng)泵流量實測值的影響因素及其控制

泵流量決定了樣品的出峰時間，其設(shè)定值誤差與穩(wěn)定性直接影響到樣品的定性結(jié)果，是儀器檢定過程的一個重要環(huán)節(jié)。規(guī)程中泵流量實測值根據(jù)收集的流動相的密度、質(zhì)量以及收集時間由式（1）得到[1]。

式中：Fm—— 流量實測值，mL/min；

W2—— 容量瓶+流動相的質(zhì)量，g；

W1—— 容量瓶的質(zhì)量，g；

ρt—— 實驗室溫度下流動相密度，g/cm3；

t—— 收集流動相的時間，min

實際檢定時，通過稱重法測量泵流量主要存在以下問題。

1.1 泵流量實測值的影響因素

根據(jù)規(guī)程，在流動相出口處用事先稱重過的潔凈容量瓶收集流動相，該出口通常指的是廢液端流出口。此時，流動相已經(jīng)流經(jīng)整個系統(tǒng)，這不僅是對泵流量的測定，更是對整機流量的測定。其設(shè)定值誤差與穩(wěn)定性不僅取決于泵，還會受到其他因素的影響：

1）在常規(guī)檢定過程中，通常柱溫箱為室溫狀態(tài)，但是當(dāng)檢測器為示差折光率檢測器時，其柱溫須與檢測器溫度保持一致，為排除室溫波動的干擾，通常設(shè)定值為35 ℃及以上。此時，以甲醇作為流動相，當(dāng)甲醇以較高溫度的狀態(tài)流經(jīng)整個系統(tǒng)后，其揮發(fā)速度明顯高于室溫狀態(tài)，使得泵流量設(shè)定值小于實際值，溫度越高，偏離越大。

2）蒸發(fā)光檢測器是通過洗脫液霧化成氣溶膠在漂移管中蒸發(fā)，檢測蒸汽中樣品顆粒的散射光產(chǎn)生的電信號，從而進行數(shù)據(jù)采集。根據(jù)其原理可知，當(dāng)流動相流經(jīng)蒸發(fā)光檢測器后，會產(chǎn)生一定的損耗，并且其廢液流出口的管路過粗，可能有部分霧化，呈氣霧狀，導(dǎo)致從廢液端進行流動相收集的結(jié)果不準(zhǔn)確。在以上情況下，可從檢測器入口處采集流動相。但是部分超高效液相色譜儀，其管路粒徑小，壓力大，流動相會以噴射狀流出，若難以準(zhǔn)確進行流動相采集，可更換粗粒徑管路后進行測量。

3）實驗室條件也會對測量結(jié)果產(chǎn)生影響，例如部分生產(chǎn)車間不具備最小分度值在1 mg內(nèi)的天平，或天平不在同層或同樓，或其提供的天平不具有溯源性，均導(dǎo)致測量結(jié)果出現(xiàn)偏差。

1.2 泵流量實測值的控制

根據(jù)規(guī)程，在稱重法測量過程中，流動相的采集、稱重、計時均是由檢定人員手動操作完成，其中不可避免地會引入人為影響因素。同一臺液相色譜儀的穩(wěn)定性由不同的檢定人員測量，或者由同一個檢定人員先后兩次測量，其結(jié)果均可能出現(xiàn)較大差異。

為避免人為因素引入的誤差，方便用戶對液相色譜儀流動相流速的檢測，建議可采用商品化液相流量計，直接測量得出泵流量的實測值。該類流量計又稱容積式流量計、定排量流量計，屬于高精度流量計。其原理是根據(jù)收集固定體積流動相所需要的時間，即式（2）計算泵流量。

式中：Fm——流量實測值，mL/min；

V—— 液相流量計的固定體積，mL；

t—— 收集流動相的時間，min

相對而言，液相流量計直接連接于泵端，不受柱溫及檢測器影響，直接對泵性能進行檢測，能更好地減少人為、環(huán)境、實驗室條件等因素引入的誤差，并且在測量過程中操作簡便，更具有實用性。對于同一臺液相色譜儀，采用液相流量計法和稱重法得到的測量結(jié)果見表1。根據(jù)表中數(shù)據(jù)可知，液相流量計所測定的泵流量穩(wěn)定性值優(yōu)于稱重法所得結(jié)果，并且由于在后續(xù)檢定中流量穩(wěn)定性為必檢項目，建議可以在實驗室環(huán)境因素影響較大的情況下，使用液相流量計測量的方法進行泵流量穩(wěn)定性的測量。

表1 不同方法測定液相色譜儀泵流量設(shè)定值誤差和穩(wěn)定性（室溫）

2 進樣系統(tǒng)對檢測結(jié)果影響及檢定建議

2.1 樣品交叉污染

液相色譜儀在使用過程中進樣量小，且樣品成分復(fù)雜。若進樣后殘留過高，則會導(dǎo)致樣品間的交叉污染，致使數(shù)據(jù)呈現(xiàn)假陽性，或出現(xiàn)雜峰或干擾峰，影響結(jié)果的可信度。而液相色譜儀檢定規(guī)程中并沒有要求對該項目進行檢定，無法判斷儀器是否對樣品引入交叉污染。因此，建議檢定規(guī)程中增加相應(yīng)檢定項目，具體操作過程可參照2020年2月1日起實施的GB/T 38125-2019《液相色譜儀用自動進樣器》。其中在自動進樣器樣品殘留技術(shù)指標(biāo)中，要求空白樣與標(biāo)樣的峰面積的比值應(yīng)不大于0.01%。此外，在該項國家標(biāo)準(zhǔn)中提出的自動進樣器的取樣體積誤差、進樣重復(fù)性、線性等技術(shù)指標(biāo)都具有極高的參考價值[2]。

2.2 樣品室溫度

液相色譜儀在理化分析的應(yīng)用過程中，常用于有機物及生物樣品的分析，該類樣品對溫度較為敏感，在一定溫度下可能會引起量變或質(zhì)變。為了解決這一問題，液相色譜儀在樣品室中安裝了控溫模塊，可使樣品在進樣等待過程中處于低溫的狀態(tài)，得到更好的保存。而液相色譜儀檢定規(guī)程中并未要求對控溫裝置的溫度準(zhǔn)確度進行考核，無法判斷樣品室溫度是否滿足需求。鑒于樣品室的控溫模塊并非液相色譜儀必備模塊，建議檢定規(guī)程中根據(jù)客戶需求，可作為選擇項目增加。在具體操作的實施過程中，對不同的指定位置下，樣品進樣器中恒溫器的溫度準(zhǔn)確性進行考察，其技術(shù)指標(biāo)可參照柱箱溫度。

3 檢測系統(tǒng)檢定結(jié)果影響因素及控制

3.1 波長示值誤差與重復(fù)性

波長示值誤差與重復(fù)性針對的是液相色譜儀中的紫外-可見光檢測器、二極管陣列檢測器、熒光檢測器。

液相色譜儀規(guī)程中檢定紫外-可見光/二極管陣列檢測器的常用方法是以泵注入檢測器的方式，將重鉻酸鉀溶液充滿整個檢測池，測量235 nm，257 nm，313 nm，350 nm處波長示值誤差與重復(fù)性。熒光檢測器是以泵注入檢測器的方式，將萘甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液充滿整個檢測池，測量激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長330 nm處的波長示值誤差與重復(fù)性。

液相色譜作為理化分析實驗室常用設(shè)備，客戶的日常使用需求量較大，在檢定波長后，由于檢測器的檢測池中充滿高濃度重鉻酸鉀溶液，導(dǎo)致儀器管路嚴(yán)重污染，需要較長時間的沖洗后才能投入使用。因此，通?？赏ㄟ^各儀器廠商提供的診斷軟件對儀器波長進行自檢。而對于不具備自檢能力的儀器，規(guī)程起草人何海紅[2]針對該問題提出利用咖啡因乙腈溶液進行液相色譜儀的波長校準(zhǔn)，通過進樣的方式，測量咖啡因在 205 nm，245 nm，273 nm 處波長示值誤差和重復(fù)性。該方法普遍應(yīng)用于各大進口儀器廠商，是被美國FDA承認(rèn)的波長校準(zhǔn)方法，儀器不產(chǎn)生污染，可以減少后處理所用的時間，使儀器能夠更快投入使用。

同理，熒光檢測器使用萘甲醇標(biāo)樣充滿檢測池，對標(biāo)樣的需求量較大，建議也采用直接進樣的方式，可以較大程度減少萘甲醇的使用量和對樣品池的沖洗時間，減少污染，提高工作效率。

除此之外，使用純水相在0.25 mL/min的低流速下測量水的激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長397 nm，同樣可以得到熒光檢測器的波長示值誤差和重復(fù)性。這也是各儀器廠商熒光波長測定的常用方法。

3.2 線性范圍

液相色譜儀的線性范圍決定了測量樣品的濃度范圍，直接影響到樣品的定量結(jié)果準(zhǔn)確性。在液相色譜儀檢定規(guī)程中，線性范圍作為檢測器的考察項目，是將標(biāo)樣單獨以注射器注射的方式直接注入檢測池中，但是，示差折光率檢測器對環(huán)境、壓力、流動相組成有著較高的要求，工作時通常需要保持環(huán)境的恒溫、恒壓，且流動相組成恒定。按照規(guī)程進行線性范圍檢測上限CH檢定校準(zhǔn)時，以手動方式將注射器中標(biāo)樣推進檢測池的過程中，這三者都會發(fā)生明顯變化，無法保證測得結(jié)果的準(zhǔn)確性。李碩等[4]在2014版液相色譜儀檢定規(guī)程發(fā)布后提出利用改進進樣方式，提高線性范圍檢定的可操作性。本實驗室采用自動進樣器的方式進樣（甲醇中膽固醇溶液：膽固醇含量 1×10-4～10×10-4g/mL），所得結(jié)果與同一臺儀器注射法進樣結(jié)果見表2。

表2 不同進樣方法測定液相色譜儀泵流量設(shè)定值誤差和穩(wěn)定性

由表2中數(shù)據(jù)可知：利用自動進樣器直接進樣的方式能夠呈現(xiàn)出更好的線性關(guān)系，該方法能綜合評價包括進樣器在內(nèi)的整機線性范圍性能。手動注射的方式會在樣品注入檢測器的瞬間產(chǎn)生較為顯著的溫度、壓力、流動相組成的變化，對于示差折光率檢測器的干擾過大，存在著不穩(wěn)定性因素，所得結(jié)果的重現(xiàn)性差。

在常規(guī)檢定及日常使用過程中，通常以有機相作為流動相使用。因此，為更好地考察儀器整機的線性性能，可以在純甲醇相中，通過自動進樣器進樣方式考察線性。其中，紫外-可見檢測器、二極管陣列檢測器、熒光檢測器均可使用萘甲醇標(biāo)樣進樣，示差折光率檢測器可使用膽固醇-甲醇標(biāo)樣進樣。若儀器日常以水相作為常用流動相，則可在不接色譜柱的情況下，使用丙酮-水溶液進樣，得到線性結(jié)果。陳敏等[5]針對紫外檢測器線性范圍的檢定，也同樣提出了自動進樣器進樣的方式，減少樣品消耗量，縮短檢定時間，證明了自動進樣器進樣方式在紫外檢測器上同樣具有可行性。

4 結(jié)語

本文根據(jù)檢定經(jīng)驗和試驗數(shù)據(jù)，針對液相色譜儀檢定涉及的泵流量測定、波長示值誤差與重復(fù)性、線性范圍等的方法進行探討。對泵流量測定提出可以增加液相流量計法，提高工作效率。對波長示值誤差與重復(fù)性提出咖啡因進樣方式，避免儀器污染。對線性范圍測定，以實驗數(shù)據(jù)證明對于溫度、壓力、流動相組成的變化敏感的示差折光率檢測器而言，自動進樣器進樣方式更具有可操作性。同時結(jié)合液相色譜儀工作實際，提出可以增加樣品交叉污染、樣品室溫度性能的檢定，為更加完整地評價儀器性能提供參考。