根皮素對硫代乙酰胺誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用

，吳 莉，舒青龍

（江西中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，江西 南昌 330006）

根皮素（phloretin）是具有二氫查爾酮類結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，存在于蘋果、梨和多種蔬菜汁液中。根皮素還是美白類中草藥白蒺藜[1]、白鮮皮[2]的主要黃酮類活性成分。已有研究表明，根皮素具有很好的抗氧化、抑制酪氨酸酶、抗腫瘤、降血糖、保護血管等生物活性[3-5]。根皮素可抗氧化、淡化色斑、使皮膚增白，其效果優(yōu)于曲酸和熊果苷等，是目前化妝品中常用的美白劑。

急性肝損傷（acute liver damage）是一種極其常見的肝臟疾病，誘導因素主要有自由基、藥物、酒精、免疫和病毒等原因，目前有效的臨床預(yù)防和治療方法是口服抗氧化劑和合理的藥物支持治療。AST和ALT是肝損傷的標志酶，在正常條件下，這些酶主要存在于細胞核和線粒體內(nèi)。堿性磷酸酶（ALP）分布在肝細胞的毛細膽管側(cè)和血竇側(cè)的微絨毛上，當膽汁排出不暢、毛細膽管內(nèi)壓升高時，可誘發(fā)產(chǎn)生大量堿性磷酸酶。γ-GT分布在肝細胞毛細膽管側(cè)和整個膽管系統(tǒng)，總膽紅素（TB）是判斷黃疸程度的主要指標。 因此，血清 ALT、AST、γ-GT、ALP和TB的含量廣泛用來作為小鼠肝損傷程度的重要指標。

硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）具有明顯的肝細胞毒性，主要通過干擾mRNA從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，影響蛋白質(zhì)的合成和肝細胞膜的完整性，導致肝細胞的損傷和壞死，是肝損傷的有效造模藥物[6]。硫代乙酰胺造成肝損傷小鼠的血清ALT、AST、γ-GT、ALP和TB等明顯升高，說明造模成功。

作者采用硫代乙酰胺造模，誘導小鼠急性肝損傷，以槲皮素作為陽性對照藥物，通過檢測血清學指標（ALT、AST、γ-GT、ALP 和 TB）和組織病理切片方法，研究根皮素對小鼠急性肝損傷的保護作用，為根皮素用于防治急性肝損傷提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

根皮素（純度98%）：購自陜西華泰精細化工有限公司；槲皮素（純度99%）：上海國藥廠生產(chǎn)；硫代乙酰胺（純度99%）：上海國藥廠生產(chǎn)；根皮素異煙?；辏兌?5%）：作者所在實驗室合成化合物；谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總膽紅素和γ-GT測定試劑盒：均購自南京建成生物工程研究所；UV-2450紫外可見分光光度計：購自日本島津公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：購自國華電器公司；酸度計：購自上海精益公司。

健康雄性昆明種小白鼠，體質(zhì)量平均30 g，江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號[SYXK（Jiangxi） 2004-0001]。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 采用硫代乙酰胺造模，誘導小鼠急性肝損傷，再研究根皮素和槲皮素對小鼠急性肝損傷的保護作用。清潔級昆明小鼠，每組8只，分為7組，即A組正常對照組（等量蒸餾水灌胃）、B組造模組 （硫代乙酰胺400 mg/kg，腹腔注射）、C組根皮素異煙?；甑蛣┝拷M （灌胃344.66 mg/kg，作者所在實驗室合成的新化合物，因為很難獲得高純度化合物，所以只做了低劑量組，用來比較藥物的活性。）、D組根皮素高劑量組（灌胃480 mg/kg）、E 組根皮素低劑量組（灌胃 240 mg/kg）、F組槲皮素高劑量組（灌胃529.7 mg/kg）、G組槲皮素低劑量組（灌胃264.85 mg/kg）。藥物灌胃，1次/d，連續(xù)7 d；除空白對照組外，其他6組于第7天用硫代乙酰胺400 mg/kg腹腔注射，造成急性肝損傷模型，24 h后采集血樣。置室溫中放置2 h，1 500 r/min離心10 min，分離血清，于4℃冰箱保存，按試劑盒說明測定小鼠血清 ALT、AST、ALP、γ-GT 和總膽紅素。

1.2.2 ALT、AST、ALP、γ-GT 和總膽紅素測定方法ALT和AST測定方法參照試劑盒的方法。測定管依次分別加入0.1 mL待測樣本和0.5 mL基質(zhì)液，混勻后于37℃水浴30 min，再加入0.5 mL 2，4-二硝基苯肼液，混勻后37℃水浴20 min，加入5 mL 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液。對照管依次分別加入0.5 mL基質(zhì)液，37℃水浴30 min，再加入0.5 mL 2，4-二硝基苯肼液和0.1 mL待測樣本，混勻后，37℃水浴20 min，加入5 mL 0.4 mol/L氫氧化鈉液。測定管和對照管室溫放置10 min，505 nm處蒸餾水調(diào)零，測定各管OD值，計算測定管減去對照管數(shù)值，查標準曲線，計算相應(yīng)的酶活力單位數(shù)。標準曲線分別為：

堿性磷酸酶ALP測定方法參照試劑盒的方法，測定管依次分別加入0.05 mL待測樣本和0.5 mL緩沖液；標準管依次分別加入0.05 mL的0.1 mg/mL酚標準液和0.5 mL緩沖液；空白管依次分別加入0.05 mL雙蒸水和0.5 mL緩沖液。以上各試管充分混勻，于37℃水浴15 min，加1.5 mL顯色劑。樣品立即混勻后，以空白管調(diào)零，520 nm處測定各管OD值，計算相應(yīng)的酶活力。計算公式為：

γ-GT測定方法參照試劑盒的方法。測定管依次分別加入0.1 mL待測樣本和2 mL底物基質(zhì)液，混勻后于37℃水浴10 min，加0.2 mL終止劑。對照管依次分別加入0.1 mL待測樣本，37℃水浴10 min，加0.2 mL終止劑，2 mL底物基質(zhì)液。樣品混勻后，室溫放置5 min，410 nm處蒸餾水調(diào)零，測定各管OD值，計算相應(yīng)的酶活力。計算公式為：

血清總膽紅素測定方法參照試劑盒的方法?？瞻坠芤来畏謩e加入0.2 mL待測樣本、1.6 mL咖啡因試劑和0.4 mL對氨基苯磺酸?？偰懠t素測定管依次分別加入0.2 mL待測樣本、1.6 mL咖啡因試劑和0.4 mL重氮試劑。各試管樣品混勻后，室溫放置10 min，加入抑制劑0.05 mL，再加入酒石酸鈉溶液1.2 mL?；靹蚝笥?10 nm處蒸餾水調(diào)零，測定各管OD值，查標準曲線，計算相應(yīng)的血清總膽紅素單位數(shù)。血清總膽紅素計算公式為：

1.2.3 組織病理學檢查 取上述各組小鼠的肝左葉，浸泡在10%福爾馬林溶液中，用于組織病理學檢查。肝組織經(jīng)過10個步驟連續(xù)脫水處理，用液體石蠟包埋，再用組織切片機切片，得到3～5 μm厚的組織切片。再經(jīng)過20個步驟的連續(xù)處理（二甲苯、乙醇、蘇木精染色和伊紅染色等），獲得可以用來顯微觀察的肝臟組織切片。通過顯微鏡，觀察造模組肝臟損傷情況和藥物處理組保護情況，主要包括中央靜脈周圍肝細胞變性和壞死、肝血竇的嚴重淤血、炎性細胞浸潤、氣球樣變性、細胞邊界的喪失等，并進行拍照，分析記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），以 P值表示統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2．1 根皮素對血清ALT和AST活性的影響

以槲皮素作為陽性對照藥物，使用硫代乙酰胺造模，根皮素和槲皮素對ALT和AST活性的影響見圖 1（a）和圖1（b）。在硫代乙酰胺造模組，血清ALT、 AST 活性分別是（327.73±53.41） U/L（n=8，P＜0.01） 和（334.32±61.70）U/L（n=8，P＜0.01），但是空白組血清ALT、AST活性分別是 （29.93±4.39）U/L和（35.33±15.27） U/L（n=8）。 這些數(shù)據(jù)表明，硫代乙酰胺嚴重破壞肝細胞膜，造成大量ALT和AST釋放到血液中。預(yù)先灌胃1.754 mmol/kg或0.877 mmol/kg根皮素組別中，小鼠血清ALT活性分別為（149.14±21.55）U/L 和（189.43±16.64）U/L，AST 活性分別為（123.58±35.90）U/L 和（168.64±33.32） U/L。相比于造模組，根皮素組ALT、AST明顯降低（n=8，P＜0.05），而且降低幅度呈現(xiàn)劑量依賴性。高、低劑量組統(tǒng)計學差異明顯，P＜0.05；與低劑量組相比模型組改善明顯，P＜0.05。在相同的實驗條件下，還測定了根皮素異煙酰基腙[7-8]的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，在預(yù)先灌胃0.877 mmol/kg相同劑量時，活性順序為根皮素異煙?；辏鹃纹に兀靖に?。

圖1 根皮素和槲皮素對小鼠血清ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）和AST（天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）活性的影響Fig.1 Effects of phloretin and quercetin on serum ALT and AST activity in mice

眾所周知，血清 ALT、AST、γ-GT、 ALP 和 TB的含量廣泛用來作為小鼠肝損傷程度的重要指標[9]。硫代乙酰胺肝損傷模型，廣泛用于誘導肝損傷、肝纖維化、肝硬化和肝癌[10-11]。肝損傷的機制之一是大量生成自由基和過氧化物陰離子[12]。硫代乙酰胺產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的生物轉(zhuǎn)化可以在12～24 h后檢測到，硫代乙酰胺產(chǎn)生的免疫毒性主要是肝臟產(chǎn)生的代謝物[13]。

2．2 根皮素對血清γ-GT和 ALP活性的影響

在使用硫代乙酰胺造模時，根皮素和槲皮素對γ-GT 和 ALP 活性的影響見圖 2（a）和圖 2（b）。

在硫代乙酰胺造模組，血清γ-GT活性是（244.65±48.84） U/L（n=8，P＜0.01），但是空白組血清γ-GT 活性是（61.16±11.63） U/L（n=8）。 在硫代乙酰胺造模組，血清ALP活性是（41.51±4.60）King U/dL（n=8，P＜0.01），但 是 空 白 組 血 清 ALP 活 性 是（10.08±1.53） King U/dL（n=8）。 這些數(shù)據(jù)表明，硫代乙酰胺嚴重破壞肝細胞膜，造成大量γ-GT和ALP釋放到血液中。預(yù)先灌胃1.754 mmol/kg或0.877 mmol/kg根皮素組別中，小鼠血清γ-GT活性分別為（103.19±20.93） U/L 和（129.30±27.91）U/L，ALP活性分別為（19.67±3.32）King U/dL 和（24.17±3.58）King U/dL。相比于造模組，根皮素組γ-GT和ALP活性明顯降低（n=8，P＜0.05），而且降低幅度呈現(xiàn)劑量依賴性。高、低劑量組統(tǒng)計學差異明顯，P＜0.05；而且低劑量組相比模型組改善明顯，P＜0.05。在預(yù)先灌胃0.877 mmol/kg相同劑量時，活性順序為槲皮素＞根皮素。

2．3 根皮素對血清總膽紅素濃度的影響

在使用硫代乙酰胺造模時，根皮素和槲皮素對血清總膽紅素濃度的影響見圖2（c）。在硫代乙酰胺造模組，血清總膽紅素濃度是（377.57±43.32）μmol/L（n=8，P＜0.01），但空白組血清總膽紅素濃度為（151.62±15.96） μmol/L（n=8）。這些數(shù)據(jù)表明，硫代乙酰胺嚴重破壞肝細胞膜，造成大量血清總膽紅素釋放到血液中。預(yù)先灌胃1.754 mmol/kg或0.877 mmol/kg根皮素組別中，小鼠血清總膽紅素濃度分別為（198.14±29.64） μmol/L 和（227.04±34.20） μmol/L，相比于造模組，根皮素組血清總膽紅素濃度明顯降低 （n=8，P＜0.05），而且降低幅度呈現(xiàn)劑量依賴性。高、低劑量組統(tǒng)計學差異明顯，P＜0.05；而且低劑量組相比模型組改善明顯，P＜0.05。在預(yù)先灌胃0.877 mmol/kg相同劑量時，活性順序為槲皮素＞根皮素。

圖2 根皮素和槲皮素對小鼠血清γ-GT（γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶），ALP（堿性磷酸酶）和TB（血清總膽紅素）的影響Fig.2 Effects of phloretin and quercetin on serum γ-GT，ALP，and TB activity in mice

2．4 組織切片病理學觀察

在使用硫代乙酰胺造模造模情況下，研究根皮素和槲皮素對肝細胞的保護作用，還可以通過組織病理學觀察來檢驗?？瞻捉M小鼠肝切片顯示正常肝細胞有保存完好的細胞質(zhì)，顯著的細胞核，可見中央靜脈。硫代乙酰胺模型組小鼠的肝切片顯示了廣泛的肝損傷，表現(xiàn)為中度到重度的中央靜脈周圍肝細胞變性和壞死，離血管越近的細胞壞死越嚴重。肝血竇有嚴重的淤血，炎性細胞浸潤，細胞邊界喪失。然而，預(yù)處理了根皮素和槲皮素的小鼠肝組織病理學病變，得到了明顯改善，見圖3。

圖3 根皮素和槲皮素對小鼠肝臟影響的HE染色切片病理學檢查（400×）Fig.3 Representative photographs of liver sections stained with HE showing the pathological changes in hepatic tissues under microscopy （400× ） to detect the effects of phloretin and quercitin on the liver histological damage after TAA treatment in mice

槲皮素被廣泛用作研究肝損傷的陽性對照物。 張洋[14]等研究了納米脂質(zhì)體槲皮素對肝損傷大鼠保肝作用，認為槲皮素被制成納米藥物后提高了其對肝臟、脾臟的趨向性和肝靶向性。納米脂質(zhì)體槲皮素保護肝臟的機制是增強肝臟SOD和GSH-Px的活性、降低肝臟MDA水平、增強Bcl-2蛋白的表達和減弱Bax蛋白的表達。何婭娣[15]等研究了槲皮素對四氯化碳誘導大鼠肝損傷的保護作用，結(jié)果表明槲皮素組較模型組的ALT、AST顯著降低（P＜0.05）；肝細胞變性、壞死及炎癥反應(yīng)明顯減輕。周曉娟[16]等研究了槲皮素對大鼠慢性酒精性肝損傷的保護作用，表明槲皮素能降低酒精性肝損傷大鼠血清中 TG、ALT、AST水平；降低肝組織中MDA含量、提高肝組織中SOD活性和GSH含量；肝組織病理結(jié)果顯示槲皮素能改善酒精性肝損傷。

根皮素存在于蘋果、梨和多種蔬菜汁液中，還是美白類中草藥白蒺藜、白鮮皮的主要黃酮類活性成分。白蒺藜[1]（Fructus tribuli）為蒺藜科一年生或多年生草本植物蒺藜（Tribulus terrestris L.）的成熟果實，全國大部分地區(qū)均產(chǎn)，但長江以北較多?？?、辛、平，入肝經(jīng)，平肝解郁、祛風明目。白蒺藜皂苷具有抗衰老、抗疲勞、改善心腦血管系統(tǒng)和性功能等作用。白鮮皮[2]為蕓香科白鮮屬植物白鮮（Dictamnus dasycarpus Turcz）的干燥根皮，主要分布于東北、華北、西北及華東等地，為歷代本草及中國藥典收載。白鮮皮屬于多年生草本，全株有特殊的刺激味，其味苦性寒；歸脾、胃、膀胱經(jīng)；具有清熱燥濕、祛風解毒、止癢等作用。

3 結(jié)語

研究了根皮素對硫代乙酰胺誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用。采用硫代乙酰胺造模，誘導小鼠急性肝損傷，以槲皮素作為陽性對照藥物，通過檢測血清學指標（ALT、AST、γ-GT、ALP 和 TB）和組織病理切片方法，研究根皮素對小鼠急性肝損傷的保護作用。結(jié)果顯示，相比于模型組，根皮素處理組小鼠血清 ALT、AST、γ-GT、ALP和 TB顯著降低（P＜0.05），而且降低幅度呈現(xiàn)劑量依賴性。根皮素處理組的小鼠肝組織病理學病變得到了顯著改善。研究表明，根皮素對硫代乙酰胺誘導的小鼠急性肝損傷有顯著的保護作用，是值得進一步研究的急性肝損傷保護的候選藥物和食品添加劑。