納米金-適配體比色傳感法檢測(cè)玉米油中黃曲霉毒素B₁

楊妍 尹盈愛(ài) 董益陽(yáng)

摘?要?黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是真菌或霉菌產(chǎn)生的有毒代謝物，通過(guò)污染農(nóng)作物和食品從而對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅。本研究建立了納米金（AuNPs）-適配體比色傳感法，采用不同序列長(zhǎng)度的AFB1適配體檢測(cè)玉米油中AFB1。通過(guò)優(yōu)化適配體濃度、NaCl濃度和體系反應(yīng)溫度，進(jìn)一步提高體系檢測(cè)靈敏度。在最佳條件下，50（B50）和80（A80）個(gè)堿基長(zhǎng)度的適配體建立的AuNPs-適配體比色傳感法的檢出限分別為13.55和10.56 ng/mL，線性范圍均為20～1000 ng/mL，且選擇性良好?；贐50和A80適配體比色傳感法檢測(cè)玉米油中AFB1的加標(biāo)回收率分別為102.4%～104.9%和98.1%～109.1%。結(jié)果表明，基于B50和A80建立的AuNPs比色傳感法均可用于玉米油中AFB1特異性鑒定。本研究為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和高效篩查食品中AFB1污染提供了技術(shù)支持，為開(kāi)發(fā)針對(duì)其它靶標(biāo)的適配體傳感檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?黃曲霉毒素B1;適配體;納米金-適配體比色傳感法;玉米油

1?引 言

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是真菌黃曲霉（fungus Aspergillus flavus）和霉菌寄生曲霉（mold Aspergillus parasiticus）產(chǎn)生的次級(jí)代謝物[1]，多存在于花生、玉米、大米、大豆、小麥等農(nóng)副產(chǎn)品中[2]。AFB1具有急性和慢性毒性[3]，還可導(dǎo)致肝癌，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為I類(lèi)致癌物[4]。AFB1對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的消費(fèi)安全以及人和動(dòng)物的健康存在嚴(yán)重威脅，因此許多國(guó)家和組織設(shè)定了AFB1殘留的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)對(duì)小麥、大麥及其制品的AFB1殘留量最高限量為5 μg/kg，玉米、玉米面和玉米制品的AFB1殘留量最高限量為20 μg/kg[5];歐盟規(guī)定所有谷物和谷物制品中的AFB1的最大殘留限量為2 μg/kg[6]。目前，檢測(cè)AFB1方法主要分為3類(lèi)：第一類(lèi)是儀器檢測(cè)法，如高效液相色譜-熒光法[7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8]和氣相色譜-質(zhì)譜法[9]等，儀器法靈敏度高、重現(xiàn)性好，但存在設(shè)備昂貴不便攜、樣品前處理過(guò)程繁瑣、周期長(zhǎng)等問(wèn)題。第二類(lèi)是基于免疫分析的快速檢測(cè)方法，酶聯(lián)免疫分析法[10]檢測(cè)快速、回收率高，但酶活性不穩(wěn)定，易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性問(wèn)題。膠體金免疫層析技術(shù)[11]操作方便、檢測(cè)時(shí)間短、成本低，但檢測(cè)結(jié)果的精確度仍存在一些問(wèn)題。熒光免疫分析法[12]靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)多組分樣品檢測(cè)，但反應(yīng)條件嚴(yán)格，可選擇的熒光物質(zhì)受限，環(huán)境中稀土元素易影響反應(yīng)。第三類(lèi)方法是基于核酸適配體開(kāi)發(fā)的簡(jiǎn)單、快速、低成本的AFB1現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速篩查方法。

核酸適配體是在體外通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選得到的單鏈寡核苷酸（DNA或RNA）[13，14]。適配體能以高親和力和特異性識(shí)別各種靶分子，包括金屬離子、藥物、有機(jī)小化合物、代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)甚至細(xì)胞等[15～17]。與抗體相比，適配體具有批間差異性小、易合成和修飾、熱穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)[18，19]。近年來(lái)，適配體與熒光法、電化學(xué)、比色法相結(jié)合的生物傳感方法受到越來(lái)越多的關(guān)注[20～23]，其中，比色法成本低、檢測(cè)迅速、操作簡(jiǎn)單，已廣泛應(yīng)用于食品中真菌毒素[24]、四環(huán)素類(lèi)抗生素[25]、磺胺類(lèi)抗生素[26]等多種靶標(biāo)的檢測(cè)。Yang等[24]基于納米金（AuNPs）聚集變色，開(kāi)發(fā)了比色傳感法檢測(cè)赭曲霉毒素A（OTA）;Sun等[27]基于AuNPs類(lèi)過(guò)氧化物酶活性建立了比色傳感法，檢測(cè)玉米中的赤霉烯酮。

在上述報(bào)道中，適配體比色傳感法均使用一條確定堿基序列長(zhǎng)度的適配體檢測(cè)靶標(biāo)分子，而堿基序列的組成以及序列長(zhǎng)度是影響適配體與靶標(biāo)的親和性的重要因素。為了比較不同序列長(zhǎng)度適配體在實(shí)際檢測(cè)中的性能，本研究針對(duì)AFB1，選擇目前文獻(xiàn)報(bào)道中常用的50（B50）[28]和80（A80）[29]個(gè)堿基長(zhǎng)度的AFB1適配體，建立了相應(yīng)的AuNPs-適配體比色傳感方法，比較了兩種適配體傳感器在比色傳感中的檢測(cè)能力和選擇性，為食品中AFB1的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速篩查奠定了基礎(chǔ)。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

JEOL-100CX-II透射電子顯微鏡（日本日立株式會(huì)社）;Nanodrop 2000c紫外分光光度計(jì)、UV/UF超純水儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）;pHS-3C pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）;?3K 15臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）;BT25S臺(tái)式電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

氯金酸（純度99%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）;檸檬酸三鈉、NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2和HCl均為分析純（北京化工廠）;黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、OTA標(biāo)準(zhǔn)品（青島普瑞邦公司）;四環(huán)素（TC）標(biāo)準(zhǔn)品、分析純?nèi)u甲基甲烷（Tris）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。玉米油購(gòu)于本地超市。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ cm）。黃曲霉毒素B1適配體序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下： B50 [28]：5'-?GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3';A80[29]：5'-?AGC AGC ACA GAG GTC AGA TGG TGC TAT CAT GCG CTC AAT GGG AGA CTT TAG CTG CCC CCA CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3'。

2.2?AuNPs的制備

采用檸檬酸鹽還原法合成AuNPs[25]。100 mL 1% 氯金酸溶液在攪拌下加熱至沸騰，然后快速加入3 mL 1%檸檬酸三鈉溶液。在劇烈攪拌下，溶液保持加熱約12 min，直到溶液顏色變成酒紅色。制得的AuNPs溶液于4℃避光保存。

2.3?基于AuNPs-適配體傳感法檢測(cè)AFB1

用結(jié)合緩沖液（100 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，pH 7.6）配制0.3 μmol/L AFB1適配體，然后將40 μL 適配體溶液和40 μL AFB1溶液充分混勻，孵育5 min，加入240 μL AuNPs孵育5 min，再加入40 μL 0.3 mol/L NaCl溶液充分混勻，反應(yīng)5 min，裸眼觀察顏色變化，并用UV-Vis分光光度計(jì)掃描450～750 nm的光譜，記錄520和650 nm處吸收值變化。配制不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（20、50、100、200、400、600、800和1000 ng/mL），用于繪制校準(zhǔn)曲線。所有測(cè)定均在25℃進(jìn)行。

2.4?選擇性研究

配制800 ng/mL的AFB1、AFB2、OTA和TC溶液，按照AuNPs-適配體傳感法檢測(cè)AFB1的步驟，分別用A80和B50進(jìn)行適配體特異性評(píng)價(jià)，并取等體積的緩沖液做陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2.5?實(shí)際樣品測(cè)定

稱(chēng)取4 g玉米油，加20 mL石油醚，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再加20 mL提取液（甲醇-水，55∶45，V/V）充分振蕩搖勻。靜置分層，收集下層的甲醇-水溶液，上層液體再加5 mL提取液再次萃取，合并兩次萃取的下層溶液，65℃水浴中蒸干，然后放在冰盒冷卻3 min，準(zhǔn)確加入1 mL苯-乙腈（98∶2，V/V）混合液，充分溶解蒸干的殘留物。將AFB1添加到預(yù)處理溶液中，用緩沖液分別稀釋成20、50、100、200、300、400、600、800和1000 ng/mL，用于繪制基質(zhì)匹配的校準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行實(shí)際樣品中AFB1測(cè)定[30，31]。

3?結(jié)果與討論

3.1?比色法傳感法檢測(cè)AFB1的原理

本研究基于AuNPs比色法，使用50堿基和80個(gè)堿基長(zhǎng)度適配體檢測(cè)AFB1，比較兩種適配體的檢測(cè)能力和選擇性，原理如圖1所示。采用檸檬酸還原法合成AuNPs，由于AuNPs顆粒表面帶負(fù)電荷的檸檬酸根離子，AuNPs顆粒間具有靜電排斥作用，在NaCl溶液中可以穩(wěn)定分散，溶液呈酒紅色。單鏈核酸適配體可以暴露堿基而非磷酸骨架，通過(guò)分子間范德華力吸附在帶負(fù)電荷的AuNPs顆粒表面[27]，阻礙AuNPs顆粒在NaCl溶液中的聚集，具有保護(hù)作用（圖1C-Ⅰ）。當(dāng)體系中存在靶標(biāo)AFB1分子，AFB1和適配體特異性識(shí)別誘導(dǎo)適配體結(jié)構(gòu)從無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)變?yōu)閯傂越Y(jié)構(gòu)，適配體對(duì)AuNPs的保護(hù)作用減弱，導(dǎo)致AuNPs在高濃度NaCl作用下發(fā)生聚集，溶液的顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色（圖1C-Ⅱ），并且溶液顏色變化程度與AFB1的濃度呈比例關(guān)系，因此，通過(guò)裸眼觀察或測(cè)定溶液吸收值可對(duì)AFB1的濃度進(jìn)行定性或精密定量檢測(cè)。

3.2?AuNPs以及傳感體系的表征

圖2A為AuNPs在不同條件下的吸收光譜。采用檸檬酸還原法合成～13 nm AuNPs顆粒（圖2B）在520 nm處有最大吸收峰（圖2A，曲線a）。當(dāng)加入0.3 mol/L NaCl時(shí)，AuNPs在520 nm處的吸收峰值降低，在710 nm處出現(xiàn)另一個(gè)吸收峰（圖2A，曲線b），這主要是由于NaCl誘導(dǎo)AuNPs顆粒聚集引起的。在分別添加0.3 μmol/L A80和B50適配體后，僅出現(xiàn)了520 nm的吸收峰，與AuNPs的特征峰相似（圖2A，曲線c和d），表明適配體可以保護(hù)AuNPs顆粒免受NaCl引起的聚集。在體系中加入800 ng/mL AFB1后，A80和B50體系同時(shí)觀察到在520和650 nm處的吸收峰（圖2A，曲線e和f），這是由于AFB1結(jié)合了部分A80和B50，使其失去了保護(hù)金納米粒子的作用。因此，采用A650/A520比值變化進(jìn)行后續(xù)研究。

3.3?反應(yīng)條件優(yōu)化

3.3.1?適配體濃度優(yōu)化?適配體濃度是影響比色傳感法檢測(cè)AFB1靈敏度的關(guān)鍵。AuNPs的分散性受NaCl濃度影響，因此，首先確定NaCl的起始工作濃度。如圖2C所示，隨著NaCl濃度增加，AuNPs在520 nm處的吸收峰值降低，在650 nm處的吸收峰值增加，當(dāng)NaCl濃度為0.30和0.35 mol/L時(shí)，兩者特征吸收峰值相近。因此選擇0.3 mol/L為NaCl起始工作濃度。適配體可以保護(hù)AuNPs顆粒免于聚集，A80和B50濃度優(yōu)化結(jié)果如圖2D所示。在NaCl作用下，低濃度的適配體對(duì)AuNPs沒(méi)有足夠的保護(hù)作用，導(dǎo)致AuNPs聚集，溶液變藍(lán)。隨著適配體濃度增加，適配體對(duì)AuNPs的保護(hù)作用增強(qiáng)，使AuNPs在NaCl溶液中免于聚集，溶液顏色由藍(lán)變紅。當(dāng)A80和B50濃度為0.3 μmol/L時(shí)，A650/A520值接近，由于適配體過(guò)量會(huì)降低檢測(cè)靈敏度，因此，選擇0.3 μmol/L作為適配體的最佳工作濃度。

3.3.2?NaCl濃度優(yōu)化?NaCl濃度影響AuNPs的分散性和適配體檢測(cè)AFB1的靈敏度。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，添加不同濃度的NaCl至A80和B50適配體與AFB1識(shí)別體系中，結(jié)果如圖3所示，0.20和0.25 mol/L NaCl不能破壞未結(jié)合AFB1的適配體對(duì)AuNPs的保護(hù)作用，溶液顏色仍為紅色。當(dāng)NaCl濃度為0.30和0.35 mol/L時(shí)，AuNPs發(fā)生聚集，導(dǎo)致溶液顏色梯度變化（圖3B和3D），且AuNPs體系的A650/A520峰吸收比值隨NaCl濃度的增加而增大（圖3A和3C）。另外，NaCl濃度為0.30 mol/L時(shí)，B50和A80在50～800 ng/mL AFB1濃度范圍均能獲得良好的線性相關(guān)系數(shù)（R2B50=0.9807，R2A80=09679）。由于過(guò)高濃度的NaCl不利于提高檢測(cè)AFB1的靈敏度，因此，本研究選擇NaCl的最佳工作濃度為0.30 mol/L。

3.3.3?反應(yīng)溫度優(yōu)化?體系的反應(yīng)溫度對(duì)適配體和靶標(biāo)分子識(shí)別有較大影響，而反應(yīng)溫度在體系優(yōu)化過(guò)程中易被忽略，故常導(dǎo)致實(shí)際檢測(cè)結(jié)果不理想?？疾炝朔磻?yīng)溫度對(duì)A80和B50適配體識(shí)別AFB1能力的影響。如圖4所示，隨著溫度升高，AuNPs-適配體體系的顏色逐漸加深（圖4B和4D）。同時(shí)，A650/A520值響應(yīng)幅度增加（圖4A和4C），4℃時(shí)響應(yīng)幅度最低，37℃最高，25℃次之，表明溫度的升高可能有利于適配體對(duì)AFB1的識(shí)別和加速AuNPs的聚集。分析A650/A520值與AFB1濃度（50～800 ng/mL）的線性相關(guān)系數(shù)發(fā)現(xiàn)，較高溫度時(shí)，適配體檢測(cè)AFB1的線性范圍較窄。綜合考慮操作簡(jiǎn)便和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求，最終選擇25℃作為體系的反應(yīng)溫度。

3.4?AuNPs-適配體比色傳感法定量檢測(cè)AFB1

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，建立了AuNPs-B50和AuNPs-A80適配體比色傳感法定量檢測(cè)AFB1的方法。如圖5B所示，隨著AFB1濃度升高，溶液顏色逐漸由紅變藍(lán)，在AFB1濃度范圍為20～1000 ng/mL時(shí)（圖5A，黑線和紅線），AuNPs-B50和AuNPs-A80適配體比色傳感法檢測(cè)AFB1的A650/A520比值與AFB1濃度呈線性關(guān)系，線性方程分別為y1=6.5864×104C+0.0713 （R21=0.9976）和y2=6.1984 × 104C+ 00741（R22=0.9984）。

對(duì)于實(shí)際玉米油樣品，為了減弱樣品基質(zhì)對(duì)AFB1檢測(cè)的干擾，采用預(yù)處理的玉米油樣品繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，B50和A80適配體體系在玉米油樣品基質(zhì)體系中檢測(cè)AFB1的峰吸收比值略有降低，但線性相關(guān)性良好（圖5A，藍(lán)線和綠線），線性范圍均為20～1000 ng/mL，線性方程分別為 y3=4.3556×104C + 0.0934（R23=0.9934），y4=4.7343×104C + 0.0889（R24=0.9969），檢出限（3σ）分別為13.55和10.56 ng/mL，滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)對(duì)玉米油中AFB1的檢測(cè)要求[5]。本方法與文獻(xiàn)報(bào)道方法的分析性能比較見(jiàn)表1。本研究表明，B50和A80適配體建立的AuNPs-適配體比色傳感法具有良好的AFB1檢測(cè)能力，A80檢測(cè)玉米油基質(zhì)中AFB1的效果略?xún)?yōu)于B50，可能與適配體的構(gòu)型和親和性（Kd，B50=75 nmol/L，Kd，A80=11.39 nmol/L）有關(guān)[28，29]。

3.5?選擇性

考察了AuNPs-適配體比色傳感法檢測(cè)AFB1的特異性。在相同的條件下，采用800 ng/mL的AFB2、OTA和TC進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。如圖5C所示，與AFB1明顯增加的峰吸收比值相比，AFB2的峰吸收比值略增，OTA和TC的峰吸收比值無(wú)明顯增加，且接近陰性對(duì)照組。這表明B50和A80適配體在AuNPs比色傳感法檢測(cè)中具有良好的選擇性和特異性。

3.6?玉米油實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證建立的AuNPs-適配體比色傳感法的準(zhǔn)確性和可靠性，采用本方法對(duì)玉米油樣品進(jìn)行了檢測(cè)。本地超市購(gòu)得玉米油樣品中未檢出AFB1。采用預(yù)處理的玉米油樣品進(jìn)行AFB1加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為50、100和300 ng/mL。結(jié)果如表2所示，基于B50和A80適配體檢測(cè)AFB1的加標(biāo)回收率范圍分別為102.4%～104.9%和98.1%～109.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.1%～9.2%和2.9%～10.0%。上述結(jié)果表明，基于B50和A80適配體建立的AuNPs比色傳感法的準(zhǔn)確度相當(dāng)，定量檢測(cè)AFB1的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本方法可用于玉米油中AFB1的快速篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

4?結(jié) 論

AuNPs比色傳感法的關(guān)鍵在于適配體在AuNPs表面的吸附和解吸作用，以及AuNPs-適配體體系在鹽溶液中的穩(wěn)定性。目前，大部分靶標(biāo)分子常存在不同長(zhǎng)度的適配體序列，因此，建立并評(píng)價(jià)不同長(zhǎng)度適配體的AuNPs比色傳感分析方法至關(guān)重要。本研究基于AuNPs比色傳感技術(shù)，建立了50和80堿基長(zhǎng)度的AFB1適配體定量檢測(cè)AFB1的方法，評(píng)價(jià)了兩條適配體檢測(cè)AFB1的能力。通過(guò)優(yōu)化適配體濃度、鹽濃度和溫度，得到AuNPs-B50和AuNPs-A80適配體比色傳感法檢測(cè)玉米油基質(zhì)中AFB1的檢出限分別為13.55和10.56 ng/mL，線性檢測(cè)范圍均為20～1000 ng/mL，選擇性均較高。本研究表明，在相同AFB1濃度范圍內(nèi)，A80適配體檢測(cè)玉米油中AFB1效果略?xún)?yōu)于B50適配體，這可能與適配體本身的結(jié)構(gòu)和親和性有關(guān)，需結(jié)合其它分子互作技術(shù)深入探討。本檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速，裸眼可視，易于進(jìn)行定性和定量分析，可望發(fā)展為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速篩選樣品中AFB1的高效方法。本研究為建立和對(duì)比其它靶標(biāo)相同而適配體序列長(zhǎng)度不同的適配體傳感方法提供了參考。

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