蛋白質(zhì)的核酸適配體篩選及應(yīng)用的研究進(jìn)展

趙麗萍 楊歌 張小敏 屈鋒

摘?要?核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）篩選方法獲得的，能夠與靶標(biāo)分子高親和力和特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA。蛋白質(zhì)是一種非常重要的生物功能大分子，迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了許多SELEX技術(shù)，用于蛋白質(zhì)的適配體的篩選。目前，適配體的篩選優(yōu)化方法主要集中在提高篩選效率、降低篩選成本，以及提升適配體性能等方面，從而獲得可與靶標(biāo)分子以高親和力和高特異性結(jié)合的適配體。適配體與靶標(biāo)分子親和力的表征是關(guān)鍵的篩選步驟，用于判定所篩選的適配體是否可以滿足后續(xù)應(yīng)用需求。本文歸納總結(jié)了2016年以來蛋白質(zhì)靶標(biāo)的適配體篩選的研究進(jìn)展，對核酸適配體篩選過程中有關(guān)核酸庫的優(yōu)化方法和篩選方法的改進(jìn)、新篩選方法的開發(fā)、核酸適配體的應(yīng)用等方面的研究進(jìn)行了評述。

關(guān)鍵詞?核酸適配體; 蛋白質(zhì); 篩選; 指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化; 評述

1?引 言

核酸適配體是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）在體外篩選獲得的可與靶標(biāo)高特異性和高親和力結(jié)合的單鏈DNA（ssDNA）或RNA。核酸適配體的靶標(biāo)范圍廣，包括蛋白質(zhì)、多肽、小分子、細(xì)胞、細(xì)菌，甚至組織。核酸適配體可通過化學(xué)方法合成，與抗體相比，核酸適配體具有成本低、易修飾、穩(wěn)定性好等特點。此外，核酸適配體有較好的組織滲透性，易進(jìn)入細(xì)胞，且無免疫原性。近年來，以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的核酸適配體在分子生物學(xué)、生物技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣受關(guān)注。

核酸適配體是通過體外篩選獲得的，故可根據(jù)特定應(yīng)用環(huán)境或靶標(biāo)分子特征進(jìn)行篩選。1990年，Tuerk和Gold[1]首次采用SELEX技術(shù)從隨機(jī)序列中篩選獲得T4 DNA聚合酶的RNA配體序列，并預(yù)測通過SELEX技術(shù)可篩選獲得任何蛋白質(zhì)或其它目標(biāo)分子的高親和力配體。同年，Ellington和Szostak[2]通過親和色譜柱方法篩選獲得具有特異性結(jié)合于有機(jī)染料的RNA配體序列，并將其定義為“適配體”。1992年，Toole等[3]篩選獲得具有抑制人凝血酶催化作用的首個DNA適配體。核酸適配體的篩選過程主要包括隨機(jī)寡核酸庫的建立、核酸庫與靶標(biāo)的相互作用、靶標(biāo)-核酸復(fù)合物的分離、次級庫的形成（通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行擴(kuò)增），再重復(fù)以上篩選步驟。不同的篩選方法，重復(fù)篩選3次不同，一般需4～20輪的篩選。最后對篩選得到的核酸序列進(jìn)行測序，獲得與靶標(biāo)分子以高親和力特異性結(jié)合的適配體序列[4]。

盡管以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的核酸適配體應(yīng)用前景廣泛，但其篩選過程復(fù)雜，一般需要十多輪篩選，耗費(fèi)大量人力、財力和時間，并且，篩選所得的核酸適配體還可能存在親和力不高、特異性不好等問題，影響其后續(xù)應(yīng)用。因此，適配體的篩選仍是目前適配體研究應(yīng)用亟待解決的問題。本研究組在之前的綜述[4]中，歸納總結(jié)了2015年之前的研究工作。近年來，對SELEX技術(shù)的改進(jìn)和發(fā)展的相關(guān)研究主要集中在核酸庫的優(yōu)化和篩選方法的改進(jìn)、適配體的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和計算機(jī)輔助篩選等方面。本文綜述了2016年以來，以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的核酸適配體的篩選過程中核酸庫的優(yōu)化方法和篩選方法的改進(jìn)、新篩選方法的開發(fā)、適配體親和力表征方法以及核酸適配體的應(yīng)用等工作。

2?核酸庫的設(shè)計與優(yōu)化

基于對RNA分子可形成功能性空間結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，早期的SELEX技術(shù)中優(yōu)先使用RNA隨機(jī)文庫[5]。隨后的研究結(jié)果表明，單鏈DNA（ssDNA）能夠形成比RNA更復(fù)雜的三級結(jié)構(gòu)，且ssDNA的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定、易合成，篩選過程中不需要額外的逆轉(zhuǎn)錄步驟，相比于RNA適配體篩選更節(jié)省時間和成本[6]。目前，超過85%的適配體篩選使用了ssDNA隨機(jī)文庫[7，8]。

大多數(shù)適配體體外篩選使用ssDNA或RNA的隨機(jī)文庫。然而，它們在體外相對穩(wěn)定，但在體內(nèi)則很容易被核酸酶降解，通常在10 s內(nèi)就會被破壞。此外，小片段的ssDNA或RNA可提供的分子結(jié)構(gòu)簡單，相互作用位點有限; 并且，當(dāng)其進(jìn)入生物體體內(nèi)時，循環(huán)時間短，可被腎臟快速過濾。考慮到ssDNA與RNA的結(jié)構(gòu)多樣性[9]、與靶標(biāo)的結(jié)合能力以及在體內(nèi)的穩(wěn)定性與功能等因素，初始核酸庫的設(shè)計與優(yōu)化是SELEX的重點考慮問題之一。

2.1?核酸庫長度

篩選所用的核酸庫一般是按照核酸合成的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行合成。通常在兩端分別設(shè)計兩段固定的引物序列，中間區(qū)域由4個核苷酸隨機(jī)排序組成，核苷酸數(shù)為N。理論上，每個合成的核酸庫應(yīng)有4N個不同的序列，序列的長度為引物-N-引物。核酸庫中N的選擇主要由經(jīng)驗決定，并因?qū)嶋H合成技術(shù)的限制，核酸庫所含的實際的序列數(shù)約為1014～1015條[10]。較短的隨機(jī)區(qū)域（N<20）可確保合成得到完全覆蓋的序列空間（即每條隨機(jī)序列至少有1個分子），但可能會因序列較短而使核酸分子的結(jié)構(gòu)多樣性減少。另一方面，較長的隨機(jī)區(qū)域（N>40）則可能提供更多的序列的三維結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)多樣性，但僅能覆蓋序列空間的一小部分（理論上應(yīng)該存在的序列不能全部出現(xiàn)）[11]。目前，已經(jīng)篩選報道的有短至8個核苷酸[12]和長至228個核苷酸的適配體序列[13]，而大多數(shù)篩選仍使用隨機(jī)區(qū)域長度N為20～60 nt之間的核酸庫。

不同長度的核酸庫可同時用于蛋白質(zhì)靶標(biāo)的適配體篩選。Lee等[14]采用雙庫策略（Double library （DL） SELEX），將不同長度的兩個核酸庫（16 nt 與20 nt）同時用于篩選VEGF16的ssDNA適配體。兩個核酸庫的部分堿基序列互補(bǔ)。通過DL-SELEX，獲得一對可結(jié)合在蛋白不同位點上的適配體。

此外，也可對次級庫的核酸長度進(jìn)行裁剪，縮短次級庫長度以簡化適配體序列并提高其親和力。He等[15]通過截短（Truncation）SELEX方法篩選了人紅細(xì)胞生成素α的核酸適配體In27。經(jīng)首輪篩選得到次級核酸庫后，對此次級庫進(jìn)行截短，以構(gòu)建由所有可能的核苷酸序列截短組成的步進(jìn)型文庫，重復(fù)以上步驟，直至獲得具有更高親和力的最短適配體序列。所獲得的適配體In27沒有原始的莖環(huán)部分，但仍保留了對靶標(biāo)的親和力。

核酸庫的設(shè)計與優(yōu)化還包括鏡像篩選（Spiegelmer SELEX）[43～46]以及嵌合庫（Chimeric SELEX）的設(shè)計與使用[47]等。此外，還應(yīng)考慮核酸庫中引物序列的設(shè)計[48，49]，或結(jié)合生物信息學(xué)分析指導(dǎo)核酸庫的設(shè)計與合成。而且，使用修飾的核酸庫進(jìn)行適配體篩選時，必須考慮由非天然核苷酸可能引起的化學(xué)毒性和免疫原性，以提高修飾適配體的生物相容性。

3?復(fù)合物分離

分離核酸與靶標(biāo)形成的復(fù)合物是SELEX的關(guān)鍵步驟之一?；趶?fù)合物分離技術(shù)開發(fā)的SELEX方法主要包括硝化纖維素膜過濾SELEX、微珠/磁珠SELEX、微柱SELEX、毛細(xì)管電泳（CE）SELEX、微流控自由流電泳SELEX、微流控芯片SELEX、SPR-SELEX、微陣列SELEX、AFM-SELEX等，表1列舉了2016年至今蛋白質(zhì)靶的適配體篩選所用的基于分離的SELEX方法。

3.1?CE-SELEX

CE-SELEX是快速、高效篩選核酸適配體的方法之一。在CE-SELEX中，通常將核酸庫與靶蛋白孵育后，進(jìn)行CE分離分析。高壓電場下，未結(jié)合的核酸序列與核酸-靶蛋白復(fù)合物因遷移速率不同而分離。在毛細(xì)管的出口端收集復(fù)合物，經(jīng)PCR擴(kuò)增、純化，生成次級庫，再進(jìn)行下一輪篩選。通常CE只需1～4輪篩選即可獲得高親和力和特異性的適配體[102]。在CE-SELEX中，靶蛋白與適配體的結(jié)合發(fā)生在自由溶液中，避免了對靶蛋白或核酸庫的固定，同時可降低非特異性結(jié)合，且二者相互作用不受空間位阻影響。CE-SELEX方法可進(jìn)一步改進(jìn)為平衡混合物的非平衡毛細(xì)管電泳（NECEEM）、平衡混合物的平衡毛細(xì)管電泳（ECEEM）及Non-SELEX等系列篩選方法[4]。本研究組建立了兩種新的CE-SELEX模式： 同步競爭結(jié)合篩選方法（Synchronized competition CE-SELEX，scCE-SELEX）和一步快速CE-SELEX（Single-step CE-SELEX，ssCE-SELEX）。Yang等[86]建立了雙靶蛋白的scCE-SELEX方法，將兩種靶蛋白A、B與核酸庫同時孵育，二者競爭結(jié)合達(dá)到動態(tài)平衡狀態(tài)后，將混合物注入CE中進(jìn)行分析。兩種靶蛋白與核酸庫結(jié)合分別形成兩種復(fù)合物，二者具有不同的遷移速率，能夠與未結(jié)合的核酸庫完全分離。在同步競爭結(jié)合篩選過程中，蛋白A和蛋白B彼此為反篩靶，通過競爭效應(yīng)為對方增加篩選壓力，顯著提高了篩選效率，僅需一輪篩選即可得到高親和力（KD值在nmol/L級）和特異性良好的適配體。該方法擴(kuò)展了高效篩選核酸適配體的CE-SELEX方法的應(yīng)用。Zhu等[79，81，82]建立了一種基于在線反應(yīng)的ssCE-SELEX模式，將核酸序列與靶蛋白的混合、孵育、核酸序列與靶蛋白-核酸復(fù)合物的分離、檢測以及復(fù)合物的收集在一步CE運(yùn)行中完成（圖1），并對影響復(fù)合物生成的關(guān)鍵因素（如孵育緩沖溶液、靶蛋白與核酸序列的比例等）及影響靶蛋白-核酸復(fù)合物分離與收集的因素（電壓、溫度、進(jìn)樣時間等）進(jìn)行了考察。進(jìn)一步利用該模式成功篩選了人凝血酶以及牛乳鐵蛋白的適配體。此外，還利用此模式對6種蛋白進(jìn)行了適配體篩選的初步實驗，結(jié)果表明，ssCE-SELEX模式對蛋白靶標(biāo)核酸適配體的篩選具有普適性。近期，本研究組在Biotechnology Advance期刊發(fā)表了多功能CE用于核酸適配體篩選的綜述[102]，對近年來CE技術(shù)在核酸適配體篩選方面的應(yīng)用進(jìn)行了全面地歸納和總結(jié)。Krylov研究組[85]提出了理想過濾式毛細(xì)管電泳法（Ideal-filter capillary electrophoresis，IFCE），即在生理pH值和生理離子強(qiáng)度（pH 7，150 mmol/L NaCl）時，可使游離的核酸序列與靶蛋白-核酸復(fù)合物反向移動，分離效率高達(dá)109。同時，較高的離子強(qiáng)度可抑制靶標(biāo)與核酸序列的非特異性結(jié)合，故一步篩選可獲得高親和力適配體序列。

3.2?微流控SELEX

微流控技術(shù)在復(fù)合物分離方面也有明顯優(yōu)勢[103，104]。2005年，Hybarger等[105]首次將微流控芯片技術(shù)運(yùn)用到SELEX。微流控SELEX主要有兩種方式： 將靶分子固定在磁珠上，用核酸庫與磁珠孵育[106]，在微通道內(nèi)外加上磁鐵，形成高強(qiáng)度的局域磁場梯度，精確控制大量的微磁珠; 或用溶膠-凝膠包封靶分子，再將核酸庫加入包封的溶膠-凝膠中[107]，通過將這些目標(biāo)分子包封在凝膠液滴中，在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行分離。與CE-SELEX相似，使用微流控分離所需的樣品量非常少，可嚴(yán)格控制篩選條件，加速適配體進(jìn)化[108]。如篩選過程中通過控制流速，在靶標(biāo)損失最小的情況下去除弱結(jié)合的或非特異性結(jié)合的核酸序列[8]，通過1～6輪篩選可獲得高親和力適配體[106]。

Hong等[92]開發(fā)了一種基于磁珠的多功能微流控篩選平臺，該芯片將篩選芯片和定量芯片結(jié)合。將BSA（反篩靶標(biāo)）包被的磁珠和粘蛋白1（MUC1）包被的磁珠分別注入到篩選芯片反篩區(qū)域和正篩區(qū)域。將初始ssDNA庫首先注入篩選芯片的反篩區(qū)域，在此區(qū)域中，一部分核酸庫與BSA結(jié)合; 未結(jié)合的核酸庫流入正篩區(qū)域，與MUC1結(jié)合，從而減少了非特異性吸附。同時，可通過倒置熒光顯微鏡觀察熒光信號的變化監(jiān)測整個篩選過程。收集磁珠上與目標(biāo)蛋白結(jié)合的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增生成次級庫，用于下一輪篩選。重復(fù)上述步驟，進(jìn)行多輪篩選，并將每個次級庫注入定量評價芯片，通過熒光強(qiáng)度實時評價每輪篩選的富集程度。由于次級庫可特異性地結(jié)合微通道中的MUC1包被的磁珠，當(dāng)每輪富集的熒光強(qiáng)度不再明顯增加時，停止篩選。該篩選平臺可在流動的環(huán)境中同時進(jìn)行正篩和反篩，并可通過連續(xù)洗滌來施加高強(qiáng)度篩選條件。與常規(guī)孵育方法相比，該篩選方法明顯減少了核酸的非特異性結(jié)合，還可消除弱結(jié)合的核酸。通過2輪篩選，獲得3條與MUC1高親和力（KD值分別為44.8、22.4和65.0 nmol/L）和特異性結(jié)合的適配體序列，并被用于癌細(xì)胞的標(biāo)記和外泌體捕獲。

利用熒光顯微鏡可監(jiān)測微流控SELEX過程，但因觀測區(qū)域的限制，熒光強(qiáng)度的均勻采集比較困難。Xu研究組[88]提出了PMM（Protein microarray integrated into microfluidic chip）-SELEX方法，通過靜電吸附將蛋白固定在芯片上，制備蛋白質(zhì)微陣列芯片，嵌入SELEX微流控芯片中，并注入核酸庫。與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的核酸序列被保留在蛋白質(zhì)芯片上，未結(jié)合的序列流出。通過熒光芯片掃描儀對保留在蛋白質(zhì)芯片上的核酸序列進(jìn)行均勻成像，以監(jiān)測篩選過程中蛋白與核酸的結(jié)合。以乳鐵蛋白為靶標(biāo)制備了靶蛋白芯片，以BSA、酪蛋白、乳球蛋白等為反篩靶制備了反篩蛋白芯片，將兩塊蛋白芯片同時嵌入到SELEX微流控芯片，可同時進(jìn)行正篩和反篩。通過7輪篩選得到了KD值為nmol/L級的適配體。

在微流控SELEX中，無法在芯片上直接完成核酸序列的擴(kuò)增，使得與核酸結(jié)合的靶標(biāo)包被磁珠可能在后續(xù)擴(kuò)增與篩選過程中因移液和轉(zhuǎn)移而丟失。Sinha等[87]設(shè)計了一個小型的自動化微流控SELEX平臺，它集樣品的輸送、孵育及核酸擴(kuò)增于一體，用非靶蛋白包被磁珠進(jìn)行1輪反篩后，用靶蛋白進(jìn)行5輪正篩。篩選過程可以在一個芯片中連續(xù)進(jìn)行，6輪篩選只需8 h。微流控中的PCR過程由自制的溫度控制模塊進(jìn)行，利用Arduino電路和溫度傳感器進(jìn)行實時溫度檢測，實現(xiàn)了芯片上的PCR溫度循環(huán)。每次循環(huán)后，收集PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)篩選過程。利用此平臺，篩選了3種與心血管病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的適配體。

微流控SELEX在實際篩選時有所不足，如樣品的注入量不穩(wěn)定、微通道需要進(jìn)行表面修飾提高親水性，并且還沒有商品化的微流控設(shè)備等。

3.3?原子力顯微鏡（AFM） SELEX

原子力顯微鏡（AFM）是可在分子水平上精確檢測分子間親和力、相互作用和識別特征的方法[109]。AFM靈活的懸臂末端的尖頭，可以檢測樣品表面和懸臂之間的微弱力。當(dāng)尖端接觸到樣品表面或與樣品表面靠近接觸時，懸臂的撓度被反射到懸臂背面的激光束記錄下來[110，111]。利用AFM方法可以動態(tài)檢測樣品表面與懸臂梁之間的作用力，并用于高親和力適配體的篩選，即AFM-SELEX。

Yusuke等[112]用AFM-SELEX通過3輪篩選得到了高親和力的凝血酶適配體（KD=200 nmol/L）。將鏈霉親和素固定在懸臂頂端，再結(jié)合生物素化的ssDNA庫，而將凝血酶固定在金片上。當(dāng)懸臂末端與金片接觸時，抗凝血酶的DNA適配體會與金片上的凝血酶結(jié)合，形成的DNA-凝血酶復(fù)合物滯留在金片上，得到高親和力的DNA適配體。Takenaka等[100]提出了一種新型AFM-SELEX方法。通過T和A堿基配對作用將核酸庫（含有35 mer腺嘌呤（A35））固定在金芯片（含10 mer胸腺嘧啶（T10））上，將人血清白蛋白（HSA）固定在懸臂上。當(dāng)HSA與核酸分子的相互作用大于A-T間的相互作用時，該核酸分子會因與蛋白的結(jié)合而使懸臂發(fā)生變化，基于懸臂變化可進(jìn)行高親和結(jié)合的適配體篩選。這個過程中，連接分子間的相互作用（A-T間作用）在減少或控制篩選輪數(shù)方面起著關(guān)鍵作用。通過4輪篩選，得到了HSA的特異性適配體。雖然AFM SELEX方法篩選輪次較少，3～4輪內(nèi)即可得到高親和力的適配體。但是，該方法存在AFM儀器設(shè)備昂貴、需要對靶標(biāo)和適配體進(jìn)行固定，以及初始庫容量較小等局限。

3.4?其它SELEX

分子印跡聚合物具有識別模板分子功能，也可用于適配體篩選。Liu研究組[67]開發(fā)了一種基于聚糖印跡磁性納米顆粒（MNPs）的SELEX方法，有效地篩選到與糖蛋白特異性結(jié)合的適配體。采用硼酸鹽親和可控定向表面印跡方法合成了多糖印跡MNPs，以此多糖印跡MNPs為親和界面與靶標(biāo)糖蛋白結(jié)合，再以靶標(biāo)糖蛋白結(jié)合的MNPs為親和底物篩選適配體。多糖印跡的MNPs對糖蛋白表現(xiàn)出較高的親和力和特異性，因此可優(yōu)先結(jié)合目標(biāo)糖蛋白，同時排除不需要的物質(zhì)。以RNase B和轉(zhuǎn)鐵蛋白兩種具有代表性的糖蛋白作為靶蛋白，通過3輪篩選得到對兩種靶蛋白具有高親和力和特異性的適配體。該方法具有親和度高、速度快、避免陰性篩選等優(yōu)點。

4?非純化靶蛋白的適配體篩選

4.1?全細(xì)胞蛋白的適配體篩選（Cell-SELEX）

目前報道的適配體篩選多使用重組蛋白或具有穩(wěn)定構(gòu)象的純化蛋白，但當(dāng)靶蛋白處于修飾狀態(tài)或其結(jié)合域可能被掩蔽時，不能很好地識別核酸分子[113]。例如，雖然EGFRⅧ蛋白的RNA適配體可以結(jié)合在大腸桿菌中表達(dá)的重組EGFRⅧ蛋白，但不能識別真核細(xì)胞表面表達(dá)的全長EGFRⅧ蛋白[114]。

Cell-SELEX是將整個細(xì)胞作為靶標(biāo)，由于細(xì)胞表面復(fù)雜，包含了大量的蛋白，因此，可針對多種靶標(biāo)分離出相應(yīng)的適配體。全細(xì)胞篩選具有以下優(yōu)點： 不需要預(yù)先了解靶標(biāo)分子構(gòu)象; 細(xì)胞表面分子呈現(xiàn)自然構(gòu)象和分布; 可避免純化過程中靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的破壞; 還具有篩選未知分子適配體的潛力[115～118]。

Haghighi等[98]以淋巴球抗原（CD20）蛋白過表達(dá)的HEK293T細(xì)胞為靶標(biāo)，經(jīng)過11輪篩選得到KD為nmol/L級的CD20適配體。該適配體被用于細(xì)胞的特異性識別，有望替代抗體用于免疫缺陷、自身免疫性疾病、白血病和淋巴瘤的診斷和治療。He等[119]報道了兩種由Cell-SELEX篩選獲得的適配體，它們可與紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞系（A2780T）表面的兩種不同的糖蛋白特異性結(jié)合。這兩種核酸適配體對目標(biāo)細(xì)胞均有較高的選擇性和較強(qiáng)的親和力，并且適配體與靶細(xì)胞的結(jié)合不依賴于二價離子，對血清中的核酸酶有較強(qiáng)的耐受性，可用于人血清中耐藥卵巢癌細(xì)胞的檢測。Bing等[120]經(jīng)5輪篩選獲得了堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）二聚體的適配體BG2，該適配體可結(jié)合堿性磷酸酶二聚體而非其單體，可用于細(xì)胞和組織上蛋白質(zhì)二聚體的原位檢測。

Cell-SELEX可以解決真實細(xì)胞表面蛋白的適配體篩選，但很難直接篩選到細(xì)胞表面表達(dá)量較少的蛋白的適配體。此外，還需要去除死細(xì)胞（如利用流式細(xì)胞儀分選以及基于微珠的方法等）以減少非特異性結(jié)合的干擾; 全細(xì)胞的靶標(biāo)組成復(fù)雜而且需要多輪篩選才能獲得高親和力和高選擇性的適配體。篩選過程中通常需要反篩步驟，以提高適配體的特異性，如篩選某腫瘤細(xì)胞的腫瘤標(biāo)志物的核酸適配體時，需要以其它腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞為反篩靶。與單一靶標(biāo)的適配體篩選方法相比，全細(xì)胞表面靶蛋白的鑒定是Cell-SELEX篩選的難點，可將與適配體特異性結(jié)合的靶標(biāo)提取后，通過質(zhì)譜的方法對靶蛋白進(jìn)行鑒定。但是，由于某些靶蛋白含量低、疏水性強(qiáng)、不易提取等，使得其分離、鑒定和表征較為困難，真正的全細(xì)胞蛋白靶的適配體篩選還難以實現(xiàn)。

4.2?體內(nèi)蛋白的適配體篩選（In-vivo SELEX）

體外篩選的適配體可能因不具有組織通透性而無法在體內(nèi)發(fā)揮作用。體內(nèi)篩選（In-vivo SELEX）是指利用疾病相關(guān)模型的小鼠直接進(jìn)行體內(nèi)篩選。首先，將修飾后具有抗核酸酶性能的核酸庫通過靜脈注射到荷瘤小鼠中，收集目標(biāo)靶器官/組織，提取結(jié)合的核酸序列后在體外進(jìn)行擴(kuò)增得到次級庫。將次級庫注入動物體內(nèi)，重復(fù)進(jìn)行體內(nèi)篩選。篩選時，可使用熒光分子層析成像（FMT）對深埋器官中的腫瘤進(jìn)行成像，觀察核酸序列在體內(nèi)的結(jié)合和遷移。體內(nèi)篩選策略用于鑒定原位定位結(jié)合腫瘤的適配體，具有藥物靶向遞送和有效設(shè)計診斷試劑的潛力。Chen等[121]通過In-vivo SELEX鑒定了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型中的骨靶向適配體，篩選獲得Toll樣受體4（TLR4）阻斷適配體，有望用于急性中風(fēng)治療[122]。Mai等[123]在淋巴瘤小鼠模型中篩選了對淋巴瘤骨髓細(xì)胞具有高特異性的ssDNA適配體。

體內(nèi)篩選具有原位和實時篩選的優(yōu)點，但篩選的適配體具有明顯的個體差異，因此，即便篩選成功也在很大程度上限制了其普適性應(yīng)用。如果使用修飾的核酸，還需考慮聚合酶擴(kuò)增修飾核酸的能力限制。此外，體內(nèi)結(jié)合的核酸序列的提取過程更加復(fù)雜，增加了篩選難度和成本。

5?基于生物信息學(xué)的SELEX（In-silico SELEX）

In-silico SELEX是一種基于計算機(jī)技術(shù)的非實驗篩選和優(yōu)化適配體的新方法，可為適配體篩選的3個關(guān)鍵過程提供計算解決方案，包括： 增強(qiáng)型初始庫的設(shè)計、序列的富集、高親和適配體的鑒定。In-silico SELEX主要包括兩個步驟： （1）根據(jù)二級結(jié)構(gòu)設(shè)計增強(qiáng)型的初始庫。對核酸庫的分析表明，高親和力的適配體的熱力學(xué)參數(shù)與其他序列存在差異。例如，GTP適配體二級結(jié)構(gòu)的自由能明顯低于相同長度的其它隨機(jī)序列。因此，在初始核酸庫的設(shè)計中可以減少具有簡單莖環(huán)結(jié)構(gòu)或微分支結(jié)構(gòu)的序列，同時，最大化穩(wěn)定低能結(jié)構(gòu)，以形成增強(qiáng)型的初始庫，用于下一步篩選。（2）通過分子對接計算進(jìn)行篩選。不同的分子對接工具可用于識別與靶標(biāo)結(jié)合的序列。Zhang等[124]開發(fā)了改良版DOVIS包，可用于RNA庫的高通量虛擬篩選。根據(jù)分子對接分析的數(shù)據(jù)（如結(jié)合自由能和適配體的平衡解離常數(shù)），選擇適配體候選序列進(jìn)一步研究。

Yokoyama等[95]運(yùn)用G4啟動子衍生的適配體篩選技術(shù)（G4PAS）與In-silico maturation （ISM）技術(shù)，通過計算機(jī)輔助定向進(jìn)化成功篩選了肝細(xì)胞生長因子（HGF）的適配體，并進(jìn)一步通過ISM方法將HGF適配體的特異性提高了45倍。Ahirwar等[96]設(shè)計了人雌激素反應(yīng)元素（ERE）的RNA類似物作為初始文庫，篩選了雌激素受體α（ERα）的類適配體。首先，對單鏈RNA類似物進(jìn)行建模，并使用AutoDock Vina、HADDOCK和PatchDock軟件完成與靶標(biāo)的對接，判斷其作為ERα適配體的可能性。進(jìn)一步通過等溫滴定量熱法測定ERα-RNA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，并驗證了計算機(jī)模擬預(yù)測結(jié)果。最后獲得Ka=1.02±0.1×108 mol/L的RNA序列為ERα-適配體ERaptR4，并通過細(xì)胞化學(xué)和固相免疫分析證實了ERaptR4適配體的靶向特異性。Bavi等[97]篩選了上皮細(xì)胞粘附蛋白（EpCAM）的15-mer RNA適配體。首先，生成初始庫序列，并模擬其全部序列的3D結(jié)構(gòu)，通過分子對接、分子動力學(xué)模擬以及結(jié)合自由能計算篩選適配體，并估算其親和力。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡驗證了該RNA適配體可結(jié)合癌細(xì)胞表面過表達(dá)的EpCAM。

6?蛋白質(zhì)適配體的應(yīng)用

6.1?疾病相關(guān)蛋白的檢測

蛋白質(zhì)的適配體可作為檢測探針用于各種傳感檢測。基于適配體的光學(xué)檢測、電化學(xué)檢測以及結(jié)合各種納米材料的檢測方法都可以顯著提高檢測靈敏度[125]。Díaz-Fernández等[65]經(jīng)過8輪篩選得到了特異性識別前列腺特異性抗原（PSA）糖基化部分的適配體，將此適配體用于夾心式電化學(xué)傳感器的設(shè)計可以檢測人血清中的PSA（檢出限為0.66 ng/mL）。該傳感器檢測的前列腺增生患者血清的結(jié)果低于標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法的檢測結(jié)果，表明該傳感器可精確檢測到含量更低的具有明顯糖基結(jié)構(gòu)的PSA。所設(shè)計的傳感器可為臨床前列腺特異性抗原檢測提供新的方法，有望改良現(xiàn)有臨床檢測方法，獲得更精準(zhǔn)的檢測結(jié)果，減少不必要的前列腺癌活檢。Ruan研究組[126]以甲胎蛋白特異性結(jié)合的適配體修飾的CdTe量子點（QDs）為供體，以抗AFP抗體的金納米粒（AuNPs）為受體，基于FRET原理，實現(xiàn)快速靈敏檢測血清中的AFP（線性范圍為0.5～45 ng/mL，檢出限為400 pg/mL）。隨著越來越多的生物標(biāo)志物的適配體被篩選報道，所建立的各種傳感器方法可以方便地用于多種生物標(biāo)志物的檢測，并且有望用于相關(guān)疾病的更好診斷，甚至現(xiàn)場檢測。

6.2?生物成像

適配體熒光探針具有腫瘤穿透性好、生物相容性好、信噪比低和分辨率高的優(yōu)點[127]，在生物成像中的應(yīng)用越來越廣泛。特別是以活細(xì)胞為篩選靶標(biāo)的多種具有特殊生物學(xué)功能適配體的出現(xiàn)，為基于適配體的熒光探針在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也提供了優(yōu)異的分子工具[128]。Bavi等[97]通過In-silico SELEX篩選了EpCAM的RNA適配體，利用熒光顯微成像觀察到所篩選的RNA適配體可特異性地與EpCAM陽性細(xì)胞結(jié)合，而不與EpCAM陰性細(xì)胞系結(jié)合。此實驗結(jié)果表明，RNA適配體分子小，對腫瘤生物標(biāo)志物EpCAM具有良好的選擇性和高親和力，有望用于新型分子成像和靶向治療。

6.3?治療藥物

由于適配體具有可與小分子藥物和蛋白配體競爭結(jié)合靶標(biāo)的能力[129]，被認(rèn)為具有潛在的藥物性能，可用于疾病治療。此外，適配體還具有激活目標(biāo)受體的功能，或可作為載體向目標(biāo)細(xì)胞或組織遞送治療藥物[130]。例如，適配體有作為抗病毒藥物的潛力。有研究表明，針對gp120的合成衍生物的RNA適配體可中和HIV-1[131]。此外，RIG-I的RNA適配體可以抑制新城疫病毒（NDV）、皰疹性口炎病毒（VSV）和流感病毒的復(fù)制[129]。

6.4?生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)

與疾病相關(guān)的新生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和及時治療。生物標(biāo)志物還可用于靶向給藥及細(xì)胞成像等，開發(fā)新型生物標(biāo)志物及其識別探針在醫(yī)學(xué)研究和臨床檢測領(lǐng)域十分必要，也有強(qiáng)烈的市場需求。目前，抗體是最常用的識別分子。與抗體相比，適配體有可能可以根據(jù)病變細(xì)胞表面未知膜蛋白的分子差異，將病變細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開來，因此適配體在發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物方面有巨大的潛力。采用Cell-SELEX方法進(jìn)行適配體篩選，能夠發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)志物，而不需要事先對腫瘤生物標(biāo)志物進(jìn)行了解[132]。先構(gòu)建針對靶細(xì)胞的核酸庫，然后根據(jù)核酸庫的結(jié)合活性對不同蛋白進(jìn)行分離，最后，通過質(zhì)譜分析鑒定蛋白。例如，Berezovski等[133]在未成熟和成熟樹突狀細(xì)胞中分別發(fā)現(xiàn)了6個和3個生物標(biāo)志物。Jia等[134]通過Cell SELEX和基于適配體的蛋白的純化策略，鑒定出CD109作為鼻咽癌的潛在生物標(biāo)志物，用于早期診斷和靶向治療。

7?總結(jié)與展望

自1990年SELEX技術(shù)被提出以來，核酸適配體的研究取得了長足進(jìn)步，被認(rèn)為是具有發(fā)展前景的新型分子探針，所篩選的核酸適配體數(shù)量增加迅速。近年來，隨著對傳統(tǒng)SELEX篩選方法的改進(jìn)以及高通量測序和計算機(jī)輔助設(shè)計等新技術(shù)的快速發(fā)展，核酸適配體的篩選效率已顯著提高（如篩選輪次顯著減少、篩選周期明顯縮短以及適配體的親和力提高等），但仍未有自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的適配體篩選程序和方法。親和力的測定方法雖多，但沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)或界限，用于判定篩選的適配體是否可以滿足后續(xù)應(yīng)用的要求。不同的篩選方法測定的親和力難以對應(yīng)，甚至在數(shù)量級上有很大差異，也缺少可將不同方法測定的親和力之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換的標(biāo)尺。特別是，有效好用的適配體（如凝血酶等靶標(biāo)分子的“明星”適配體）還十分有限，遠(yuǎn)不能滿足實際應(yīng)用的需求。因此，適配體篩選的機(jī)理和高效篩選方法還有待深入研究，適配體所面臨的這些問題也將會轉(zhuǎn)化為促進(jìn)適配體發(fā)展和應(yīng)用的研究動力。

References

1?Tuerk C，Gold L. Science，1990，249 （4968）： 505-510

2?Ellington A D，Szostak，J W. Nature，1990，346： 818-822

3?Bock L C，Griffin L C，Latham J A，Vermaas E H，Toole J J. Nature，1992，355： 564-566

4?YANG Ge，WEI Qiang，ZHAO Xin-Ying，QU Feng. Chinese Journal of Chromatography，2016，34（4）： 370-381

楊 歌，魏 強(qiáng)，趙新穎，屈 鋒. 色譜，2016，34（4）： 370-381

5?Gilbert W. Nature，1986，319： 618

6?Wang T，Chen C，Larcher L M，Barrero R A，Veedu R N. Biotechnol. Adv.，2019，37（1）： 28-50

7?McKeague M，DeRosa M C. J. Nucleic Acids，2012： ?748913

8?Bayat P，Nosrati R，Alibolandi M，Rafatpanah H，Abnous K，Khedri M，Ramezani M. Biochimie，2018，154： 132-155

9?Blind M，Blank M. Mol. Ther. Nucleic Acids，2015，4： e223

10?Knight R，Yarus M. Nucleic Acids Res.，2003，31（6）： e30

11?Velez T E，Singh J，Xiao Y，Allen E C，Wong O Y，Chandra M，Kwon S C，Silverman S K. ACS Comb. Sci.，2012，（14）： 680-687

12?Kwon Y S，Raston N H A，Gu M B. Chem. Commun.，2014，（50）： 40-42

13?Li Y F，Geyer C R，Sen D. Biochemistry，1996，（35）： 6911-6922

14?Lee K H，Zeng H. Anal. Bioanal. Chem.，2017，409（21）： 5081-5089

15?He X，Guo L，He J，Xu H，Xie J. Anal. Chem.，2017，89（12）： 6559-6566

16?Griffin L C，Tidmarsh G F，Bock L C，Toole J J，Leung L L K. Blood，1993，81（12）： 3271-3276

17?Pagratis N C，Bell C，Chang Y F，Jennings S，F(xiàn)itzwater T，Jellinek D，Dang C. Nat. Biotechnol.，1997，15（1）： 68-73

18?Matsunaga K，Kimoto M，Hanson C，Sanford M，Young H A，Hirao I. Sci. Rep.，2015，5： 18478

19?Shoara A A，Reinstein O，Borhani O A，Martin T R，Slavkovic S，Churcher Z R，Johnson P E. Biochimie，2018，145： 137-144

20?Dunn M R，Jimenez R M，Chaput J C. Nat. Rev. Chem.，2017，1（10）： 0076

21?Zhou J H，Rossi J. Nat. Rev. Drug Discov.，2017，16（3）： 181-202

22?Hollenstein M，Hipolito C J，Lam C H，Perrin D M. Nucleic Acids Res.，2009，37（5）： 1638-1649

23?Davydova A，Vorobyeva M，Bashmakova E，Vorobjev P，Krasheninina O，Tupikin A，Venyaminova A. Anal. Biochem.，2019，570： 43-50

24?Liu M，Yin Q，Brennan J D，Li Y. Biochimie，2018，145： 151-157

25?Aldag J，Persson T，Hartmann R. Int. J. Mol. Sci.，2018，19（12）： 3883-3398

26?Kratschmer C，Levy M. Nucleic Acid Ther.，2017，27（6）： 335-344

27?Rthlisberger P，Hollenstein M. Adv. Drug Delivery Rev.，2018，134： 3-21

28?Levi-Acobas F，Katolik A，Rthlisberger P，Cokelaer T，Sarac I，Damha M J，Hollenstein M. Org. Biomol. Chem.，2019，17（35）： 8083-8087

29?Kamatkar N，Levy M，Hébert J M. ?Mol. Ther. Nucleic Acids，2019，17： 530-539

30?Kimoto M，Nakamura M，Hirao I. Nucleic Acids Res.，2016，44（15）： 7487-7494

31?Wang H，Lam C H，Li X，West D L，Yang X. Biochimie，2018，145： 125-130

32?Gawande B N，Rohloff J C，Carter J D，von Carlowitz I，Zhang C，Schneider D J，Janjic N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2017，114（11）： 2898-2903

33?Chen T J，Hongdilokkul N，Liu Z X，Adhikary R，Tsuen S S，Romesberg F E. Nat. Chem.，2016，8（6）： 557-563

34?Thirunavukarasu D，Chen T J，Liu Z X，Hongdilokkul N，Romesberg F E. J. Am. Chem. Soc.，2017，139（8）： 2892-2895

35?Liu Z X，Chen T J，Romesberg F E. Chem. Sci.，2017，8（12）： 8179-8182

36?Chen T J，Romesberg F E. Angew. Chem. Int. Edit.，2017，56（45）： 14046-14051

37?Taylor A I，Pinheiro V B，Smola M J，Morgunov A S，Peak-Chew S，Cozens C，Weeks K M，Herdewijn P，Holliger P. Nature，2015，518（7539）： 427-430

38?Larsen A C，Dunn M R，Hatch A，Sau S P，Youngbull C，Chaput J C. Nat. Commun.，2016，7： 11235

39?Kimoto M，Yamashige R，Matsunaga K，Yokoyama S，Hirao I. Nat. Biotechnol.，2013，31： 453-457

40?Matsunaga K，Kimoto M，Hirao I. J. Am. Chem. Soc.，2017，139（1）： 324-334

41?Zhang L Q，Yang Z Y，Trinh T L，Teng I T，Wang S，Bradley K M，Hoshika S，Wu Q F，Cansiz S，Rowold D J，McLendon C，Kim M S，Wu Y，Cui C，Liu Y，Hou W J，Stewart K，Wan S，Liu C，Benner S A，Tan W H. Angew. Chem. Int. Edit.，2016，55（40）： 12372-12375

42?Golden M C，Collins B D，Willis M C，Koch T H. J. Biotechnol.，2000，81（2-3）： 167-178

43?Maasch C，Buchner K，Eulberg D，Vonhoff S，Klussmann S. Nucleic Acids Symp. Ser.，2008： ?61-62

44?Wang Z M，Xu W L，Liu L，Zhu T F. Nat. Chem.，2016，8（7）： 698-704

45?Pech A，Achenbach J，Jahnz M，Schulzchen S，Jarosch F，Bordusa F，Klussmann S. Nucleic Acids Res.，2017，45（7）： 3997-4005

46?Vater A，Klussmann S. Curr. Opin. Drug Discov. Devel.，2003，6（2）： 253-261

47?Kanwar J R，Roy K，Kanwar R K. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.，2011，46（6）： 459-477

48?Yang D K，Chou C F，Chen L C. RSC Adv.，2018，8（34）： 19067-19074

49?Tsao S M，Lai J C，Horng H E，Liu T C，Hong C Y. Sci. Rep.，2017，7： 45478

50?Sypabekova M，Bekmurzayeva A，Wang R，Li Y，Nogues C，Kanayeva D. Tuberculosis，2017，104： 70-78

51?Rose K M，F(xiàn)erreira-Bravo I A，Li M，Craigie R，Ditzler M A，Holliger P，DeStefano J J. ACS Chem. Biol.，2019，14（10）： 2166-2175

52?Yang C，Wang Y，Ge M H，F(xiàn)u Y J，Hao R，Islam K，Naranmandura H. Biomater. Sci.，2019，7（3）： 938-950

53?Shubham S，Hoinka J，Banerjee S，Swanson E，Dillard J A，Lennemann N J，Przytycka T M，Maury W，Nilsen-Hamilton M. Sci. Rep.，2018，8： 12373

54?Li K，Xiu C L，Gao L M，Shi M，Zhai Y. J. South Med. Univ.，2016，36（12）： 1592-1598

55?Alshaer W，Ababneh N，Hatmal M，Izmirli H，Choukeife M，Shraim A，Awidi A. PloS one，2017，12（12）： 189558-189571

56?Donkor D A，Bhakta V，Eltringham-Smith L J，Stafford A R，Weitz J I，Sheffield W P. Sci. Rep.，2017，7： 2102

57?Yazdian-Robati R，Ramezani M，Khedri M，Ansari N，Abnous K，Taghdisi S M. Microchim. Acta，2017，184（10）： 4029-4035

58?Leblebici P，Leirs K，Spasic D，Lammertyn J. Anal. Chim. Acta，2019，1053： 70-80

59?Zhou W，Zhang Y，Zeng Y，Peng M，Li H，Sun S，Liu J. Biochimie，2018，151： 150-158

60?Fukasawa K，Higashimoto Y，Ando Y，Motomiya Y. Ther. Apher. Dial.，2018，22（1）： 61-66

61?Hu Y，Li X，An Y，Duan J，Yang X D. Oncotarget，2018，9（42）： 26605-26616

62?Nazari M，Gargari S，L M，Sahebghadam Lotfi A，Rassaee M J，Taheri R A. Biochemistry，2019，58（18）： 2373-2383

63?Alshaer W，Ababneh N，Hatmal M，Izmirli H，Choukeife M，Shraim A，Awidi A. PloS One，2017，12（12）： e0189558

64?Bhardwaj J，Chaudhary N，Kim H，Jang J. Anal. Chim. Acta，2019，1064： 94-103

65?Díaz-Fernández A，Miranda-Castro R，de-los-Santos-lvarez N，Rodríguez E F，Lobo-Castaón M J. Biosens. Bioelectron.，2019，128： 83-90

66?Yu F，Li H，Sun W，Zhao Y，Xu D，He F. Talanta，2019，193： 110-117

67?Ma Y，Li X，Li W，Liu Z. ACS Appl. Mater. Interfaces，2018，10（47）： 40918-40926

68?Liu M，Yin Q，Chang Y，Zhang Q，Brennan J D，Li Y. Angew. Chem. Int. Edit.，2019，58（24）： 8013-8017

69?Tucker W，Kinghorn A，F(xiàn)raser L，Cheung Y W，Tanner J. Int. J. Mol. Sci.，2018，19（3）： 763-778

70?Wang C，Du X，Xie T，Li H. J. Sep. Sci.，2019，42（23）： 3571-3578

71?Sedighian H，Halabian R，Amani J，Heiat M，Taheri R A，F(xiàn)ooladi A A I. Anal. Biochem.，2018，548： 69-77

72?Bayat P，Taghdisi S M，Rafatpanah H，Abnous K，Ramezani M. Talanta，2019，194： 399-405

73?Sedighian H，Halabian R，Amani J，Heiat M，Amin M，F(xiàn)ooladi A A I. J. Biotech.，2018，286： 45-55

74?Moreno M，F(xiàn)ernández-Algar M，F(xiàn)ernández-Chamorro J，Ramajo J，Martínez-Salas E，Briones C. Molecules，2019，24（7）： 1213-1229

75?Eissa S，Zourob M. Biosens. Bioelectron.，2017，91： 169-174

76?Heiat M，Ranjbar R，Latifi A M，Rasaee M J. Peptides，2016，82： 101-108

77?Chonco L，F(xiàn)ernández G，Kalhapure R，Hernáiz M J，Garcia-Oliva C，Gonzalez V M，Parboosing R. Nucleic Acid Ther.，2018，28（4）： 242-251

78?Stuart C H，Riley K R，Boyacioglu O，Herpai D M，Debinski W，Qasem S，Gmeiner W H. Mol. Ther. Nucl. Acids，2016，5： 386-395

79?Zhu C，Wang X，Li L，Hao C，Hu Y，Rizvi A S，Qu F. Biochem. Biophys. Res. Commun.，2018，506（1）： 169-175

80?Lisi S，F(xiàn)iore E，Scarano S，Pascale E，Boehman Y，Duconge F，Ravelet C. Anal. Chim. Acta，2018，1038： 173-181

81?Zhu C，Li L，Yang G，F(xiàn)ang S，Liu M，Ghulam M，Qu F. Anal. Chim. Acta，2019，1070： 112-122

82?Zhu C，Li L，Yang G，Irfan M，Wang Z，F(xiàn)ang S，Qu F. Talanta，2019，205： 120088

83?Wakui K，Yoshitomi T，Yamaguchi A，Tsuchida M，Saito S，Shibukawa M，Yoshimoto K. Mol. Ther. Nucl. Acids，2019，16： 348-359

84?Wakui K，Abe A，Yoshitomi T，F(xiàn)urusho H，Yoshimoto K. Anal. Sci.，2019，35（5）： 585-588

85?Le A T，Krylova S M，Kanoatov M，Desai S，Krylov S N. Angew. Chem. Int. Edit.，2018，58（9）： 2739-2743

86?Yang G，F(xiàn)eng Q，Abstract. BCEIA，2017

87?Sinha A，Gopinathan P，Chung Y D，Lin H Y，Li，K H，Ma H P，Lee G B. Biosens. Bioelectron.，2018，122： 104-112

88?Liu X，Li H，Jia W，Chen Z，Xu D. Lab Chip，2017，17（1）： 178-185

89?Park J W，Lee S J，Ren S，Lee S，Kim S，Laurell T. Sci. Rep.，2016，6： 27121

90?Olsen T R，Tapia-Alveal C，Yang K A，Zhang X，Pereira L J，F(xiàn)armakidis N，Lin Q. J. Electrochem. Soc.，2017，164（5）： B3122-B3129

91?Kim J，Olsen T R，Zhu J，Hilton J P，Yang K A，Pei R，Lin Q. Sci. Rep.，2016，6： 26139

92?Hong S L，Wan Y T，Tang M，Pang D W，Zhang Z L. Anal. Chem.，2017，89（12）： 6535-6542

93?Olsen T，Zhu J，Kim J，Pei R，Stojanovic M N，Lin Q. SLAS Technol.，2017，22（1）： 63-72

94?Kinghorn A B，Dirkzwager R M，Liang S，Cheung Y W，F(xiàn)raser L A，Shiu S C C，Tanner J A. Anal. Chem.，2016，88（14）： 6981-6985|

95?Yokoyama T，Tsukakoshi K，Yoshida W，Saito T，Teramoto K，Savory N，Ikebukuro K. Biotech. Bioengeer.，2017，114（10）： 2196-2203

96?Ahirwar R，Nahar S，Aggarwal S，Ramachandran S，Maiti S，Nahar P. Sci. Rep.，2016，6： 21285

97?Bavi R，Liu Z，Han Z，Zhang H，Gu Y. Biochem. Biophys. Res. Commun.，2019，509（4）： 937-942

98?Haghighi M，Khanahmad H，Palizban A. Molecules，2018，23（4）： 715-728

99?Fafińska J，Czech A，Sitz T，Ignatova Z，Hahn U. Nucleic Acid Ther.，2018，28（6）： 326-334

100?Takenaka M，Okumura Y，Amino T，Miyachi Y，Ogino C，Kondo A. Bioorg. Med. Chem. Lett.，2017，27（4）： 954-957

101?Nafissi-varcheh N，Kazemi B，Aboofazeli R，Shahhosseini S，Tabarzad M. Iran. J. Pharm. Res.，2017，16（2）： 734-741

102?Zhu C，Yang G，Ghulam M，Li L，Qu F. Biotechnol. Adv.，2019： ?107432

103?Lenshof A，Laurell T. Chem. Soc. Rev.，2010，39（3）： 1203-1217

104?Pappas D，Wang K. Anal. Chim. Acta，2007，601（1）： 26-35

105?Hybarger G，Bynum J，Williams R F. Anal. Bioanal. Chem.，2005，384（1）： 191-198

106?Cho M，Xiao Y，Nie J，Stewart R，Csordas A T，Oh S S，Soh H T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2010，107（35）： 15373-15378

107?Bae H，Ren S，Kang J，Kim M，Jiang Y，Jin M M，Kim S. Nucleic Acid Ther.，2013，23（6）： 443-449

108?Qian J，Lou X，Zhang Y，Xiao Y，Soh H T. Anal. Chem.，2009，81（13）： 5490-5495

109?Jiang Y，Zhu C，Ling L，Wan L，F(xiàn)ang X，Bai C. Anal. Chem.，2003，75（9）： 2112-2116

110?Allison D P，Hinterdorfer P，Han W. Curr. Opin. Biotech.，2002，13（1）： 47-51

111?Zlatanova J，Lindsay S M，Leuba S H. Prog. Biophys. Mol. Biol.，2000，74（1-2）： 37-61

112?Miyachi Y，Shimizu N，Ogino C，Kondo A. Nucleic Acids Res.，2009，38（4）： 21-21

113?Ye M，Hu J，Peng M，Liu J，Liu J，Liu H，Tan W. Int. J. Mol. Sci.，2012，13（3）： 3341-3353

114?Liu Y，Kuan C T，Mi J，Zhang X，Clary B M，Bigner D D，Sullenger B A. Biol. Chem.，2009，390（2）： 137-144

115?Sefah K，Shangguan D，Xiong X，Odonoghue M B，Tan W. Nat. Protoc.，2010，5（6）： 1169-1185

116?Blank M，Weinschenk T，Priemer M，Schluesener H. J. Biol. Chem.，2001，276（11）： 16464-16468

117?Shangguan D，Cao Z，Meng L，Mallikaratchy P，Sefah K，Wang H，Tan W. J. Proteome Res.，2008，7（5）： 2133-2139

118?Mallikaratchy P，Tang Z，Kwame S，Meng L，Shangguan D，Tan W. Mol. Cell. Proteomics，2007，6（12）： 2230-2238

119?He J，Wang J，Zhang N，Shen L，Wang L，Xiao X，Shangguan D. Talanta，2019，194： 437-445

120?Bing T，Shen L，Wang J，Wang L，Liu X，Zhang N，Xiao X，Shangguan D. Adv. Sci.，2019，6（11）： 1900143

121?Chen L，He W，Jiang H，Wu L，Xiong W，Li B，Zhou Z，Qian Y. Int. J. Nanomed.，2019，14： 149-159

122?Fernández G，Moraga A，Cuartero M I，García-Culebras A，Pea-Martínez C，Pradillo J M，Hernández-Jiménez M，Sacristán S，Ayuso M I，Gonzalo-Gobernado R. Mol. Ther.，2018，26： 2047-2059

123?Mai J，Li X，Zhang G，Huang Y，Xu R，Shen Q，Lokesh G L，Thiviyanathan V，Chen L，Liu H. Mol. Pharm.，2018，15： 1814-1825

124?Zhang S，Kumar K，Jiang X，Wallqvist A，Reifman J. BMC Bioinformatics，2008，9（1）： 126

125?Ma H，Liu J，Ali M M，Mahmood M A I，Labanieh L，Lu M，Wan Y. Chem. Soc. Rev.，2015，44（5）： 1240-1256

126?Zhou L，Ji F，Zhang T，Wang F，Li Y，Yu Z，Ruan B. Talanta，2019，197： 444-450

127?Opazo F，Levy M，Byrom M，Schfer C，Geisler C，Groemer T W，Rizzoli S O. Nat. Methods，2012，9（10）： 938-939

128?HUANG Zi-Ke，LIU Chao，F(xiàn)U Qiang-Qiang，LI Jin，ZOU Jian-Mei，XIE Si-Tao，QIU Li-Ping. Chinese J. Appl. Chem.，2018，35（1）： 28-39

黃子珂，劉 超，付強(qiáng)強(qiáng)，李 進(jìn)，鄒建梅，謝斯滔，邱麗萍. 應(yīng)用化學(xué)，2018，35（1）： 28-39

129?Hwang S Y，Sun H Y，Lee K H，Oh B H，Cha Y J，Kim B H，Yoo J Y. Nucleic Acids Res.，2012，40： 2724-2733

130?Zhang Y，Lai B S，Juhas M. Molecules，2019，24（5）： 941-963

131?Mufhandu H T，Gray E S，Madiga M C，Tumba N，Alexandre K B，Khoza T，Wibmer C K，Moore P L，Morris L，Khati M. J. Virol.，2012，86： 4989-4999

132?Kunii T，Ogura S I，Mie M，Kobatake E. Analyst，2011，136： 1310-1312

133?Berezovski M V，Lechmann M，Musheev M U，Mak T W，Krylov S N. J. Am. Chem. Soc.，2008，130（28）： 9137-9143

134?Jia W，Ren C，Wang L，Zhu B，Jia W，Gao M，Zeng F，Zeng L，Xia X，Zhang X，F(xiàn)u T，Li S，Du C，Jiang X，Chen Y，Tan W，Zhao Z，Liu W. Oncotarget，2016，7： 55328-55342