拮抗凡隆氣單胞菌的海洋放線菌AC08F5的鑒定及活性物質(zhì)初步研究

陳靜 夏艷秋 朱強(qiáng)

摘要： 從21株分離自海洋環(huán)境的放線菌中篩選出1株放線菌菌株AC08F5，該菌株對凡隆氣單胞菌溫和生物型（Aeromonas veronii biovar sobria）NQ菌株有明顯抑制作用;通過顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察、生理生化反應(yīng)和16S rDNA分子鑒定，將其鑒定為鏈霉菌屬。試驗(yàn)對該菌株的活性物質(zhì)對熱、pH和紫外照射的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示，在70 ℃以下、pH值4～10條件下抑菌活性相對穩(wěn)定，并具有很強(qiáng)的抗紫外線照射能力。

關(guān)鍵詞： 海洋放線菌;鑒定;凡隆氣單胞菌;穩(wěn)定性

中圖分類號： S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0175-06

水產(chǎn)病原微生物中出現(xiàn)大量抗生素耐藥類型主要是由于在水產(chǎn)養(yǎng)殖中大量使用合成抗生素和藥物導(dǎo)致的[1]。利用微生物代謝產(chǎn)物來有效防治水產(chǎn)動物疾病，已經(jīng)成為當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖工作的重要方向。在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，隨著研究的深入發(fā)展，人們越來越重視來源于海洋的有益微生物資源及其代謝產(chǎn)物的開發(fā)和應(yīng)用。目前，海洋細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物用于水產(chǎn)抗病和水環(huán)境保護(hù)等方面的研究比較多。

海洋放線菌是新化學(xué)結(jié)構(gòu)物質(zhì)豐富的來源，在海洋放線菌研究方面，一是以篩選抗病毒、抗腫瘤活性產(chǎn)物為主要研究目標(biāo)，二是以篩選抗菌、抑菌菌株應(yīng)用于農(nóng)作物病害的研究較多[2-6]。而海洋放線菌應(yīng)用于防治水產(chǎn)病原菌病害研究相對較少，但已有諸多研究者將海洋放線菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌引起病害的預(yù)防。中山大學(xué)游建嵐等報(bào)道了利用海洋放線菌治療和預(yù)防由致病性弧菌引起的蝦病害，具有抑制弧菌菌膜的形成，在養(yǎng)殖水體可以降解淀粉、蛋白等大分子，產(chǎn)抗菌類物質(zhì)以及形成耐熱耐干燥的孢子的優(yōu)點(diǎn)，海洋放線菌具有成為益生菌的潛力[7-8]。Das等將海洋鏈霉菌作為益生菌應(yīng)用于斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）養(yǎng)殖，發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)蝦生長的作用[9]。Kumar等研究人員則將從海洋放線菌中提取的抗菌物質(zhì)與食物一同喂養(yǎng)凡納濱對蝦，對蝦產(chǎn)生具白斑綜合征病毒的抗病毒效應(yīng)[10]。隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)海洋放線菌及其次級代謝產(chǎn)物已成為尋找新抗生素的重要來源[11]，而直接使用放線菌作為益生菌，相對來說其出現(xiàn)抗性基因橫向轉(zhuǎn)移機(jī)會低，值得在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用[12]，且具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

凡隆氣單胞菌是近些年確定的氣單胞菌科的新種，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上逐漸成為危害性較大的病原菌。由于該菌的感染，曾引發(fā)孟加拉國魚類的流行性潰瘍綜合癥，國內(nèi)丁[XCZ26.tif;%118%118]、羅非魚、中華絨螯蟹及泥鰍、甌江彩鯉等水產(chǎn)動物也因此患病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失[13]。本研究對凡隆氣單胞菌有較好抑制作用的海洋放線菌菌株AC08F5進(jìn)行了鑒定并對其抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究，以期為開發(fā)水產(chǎn)微生物活性制劑提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

出發(fā)菌株：筆者所在課題組從連云港海域海泥、蛤池泥、日照多島海海泥等樣品中分離21株放線菌，并保存于淮海工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

病原指示菌：凡隆氣單胞菌溫和生物型（Aeromonas veronii biovar sobria）NQ菌株（由江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院秦蕾博士提供）。

1.1.2 培養(yǎng)基

病原指示菌培養(yǎng)基（TSA培養(yǎng)基）：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂粉15.0～20.0 g，K2HPO4 2.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

放線菌斜面培養(yǎng)基（海水高氏1號）：可溶性淀粉20.0 g，KNO3 1.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，MgSO4 0.5 g，瓊脂粉15.0～20.0 g，陳海水1 000 mL，pH值7.2～7.4。

放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，黃豆粉 20.0 g，淀粉10.0 g，（NH4）2SO4 2.5 g，蛋白胨 5.0 g，玉米漿2.5 g，MgSO4.7H2O 0.25 g，K2HPO4 0.02 g，NaCl 4.0 g，CaCO3 6.0 g，陳海水1 000 mL，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 拮抗凡隆氣單胞菌NQ菌株的放線菌株篩選

（1）試驗(yàn)菌無菌濾液制備：在容量100 mL三角燒瓶內(nèi)裝量30 mL的放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，無菌操作接入活化斜面菌種1～2環(huán)，20 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，得發(fā)酵液;將發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min、5 min 離心，上清液再經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾，得無菌濾液備用。

（2）病原指示菌的制備：用無菌生理鹽水配制濃度為107 CFU/mL的指示菌菌懸液備用。

（3）雙層平板牛津杯篩選法：制備底層為10 mL 2%的水瓊脂培養(yǎng)基，上層為7 mL TSA培養(yǎng)基的雙層平板，取病原指示菌懸液100 μL涂布，然后在平板上放入牛津杯;在牛津杯中加入10 μL試驗(yàn)菌無菌濾液，每菌做3個(gè)平行，28 ℃培養(yǎng)24 h，測抑菌圈直徑。

1.2.2 菌株AC08F5的初步鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征觀察[14]

用扦片法培養(yǎng)，并在顯微鏡下觀察菌絲、孢子絲和孢子等的形態(tài)。

1.2.2.2 培養(yǎng)特征

采用蒸餾水和陳海水分別配制葡萄糖天門冬素瓊脂、高氏一號、察氏培養(yǎng)基、淀粉瓊脂、葡萄糖酵母膏瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂6種培養(yǎng)基制成平板。將菌株AC08F5三區(qū)劃線接種上述6種不同的鑒定培養(yǎng)基上。然后在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7、14、30 d，對氣生菌絲的顏色、基內(nèi)菌絲的顏色、生長狀況、有無可溶性色素產(chǎn)生及產(chǎn)生可溶性色素的顏色進(jìn)行觀察記錄。

1.2.2.3 部分生理生化反應(yīng)

采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管（購自北京陸橋生物），每管中接入50 μL對數(shù)期菌株懸液，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，對照說明書觀察并記錄和判斷結(jié)果。

1.2.3 菌株AC08F5的16S rRNA PCR擴(kuò)增與測序

按照文獻(xiàn)[15-16]提取菌株基因組，然后用細(xì)菌16S rDNA通用引物，正向引物5′-[JP9]AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（E. coli 8 to 27），反向引物5′-[JP9]TACCTTGTTACGACTT-3′（E. coli 1507 to 1492）進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR產(chǎn)物用UNIQ-10柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（購自上海生工）提純后送上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司雙向測序;將所測定序列通過NCBI中Nucleotide-nucleotide BLAST程序比對，并下載與試驗(yàn)菌株親緣關(guān)系較近并已經(jīng)確證的序列，用Clustal X軟件進(jìn)行比對分析和MEGA 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 菌株AC08F5發(fā)酵清液中抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性研究

1.2.4.1 發(fā)酵清液的制備

將放線菌新鮮成熟孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，20 ℃ 180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)96 h。在冷凍離心機(jī)將發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min，離心5 min，離心上清液再經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾，得到發(fā)酵上清液備用。

1.2.4.2 熱穩(wěn)定性

各取發(fā)酵上清液3 mL于24個(gè)試管內(nèi)，每組3支試管分別置于20、30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴60 min，然后冰水中迅速冷卻，采用雙層平板牛津杯法測定各處理樣的抑菌活性，以 20 ℃ 下的抑菌活性作為100%進(jìn)行相對活性比較。

1.2.4.3 pH穩(wěn)定性

取發(fā)酵上清液5 mL于21個(gè)25 mL小燒杯中，采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將各燒杯中發(fā)酵液pH值分別調(diào)節(jié)至2、4、6、7、8、10、12，每個(gè)pH值設(shè)3個(gè)平行，室溫下放置 24 h，期間定時(shí)混勻幾次，再全部調(diào)回中性。用雙層平板牛津杯法測抑菌活性，并以pH值為7時(shí)的抑菌活性作為100%。

1.2.4.4 紫外照射穩(wěn)定性

分別取5 mL發(fā)酵上清液于21個(gè)直徑90 mm平皿里，在超凈工作臺內(nèi)，敞口放置于紫外燈（20 W）下，距離30 cm處照射0、5、10、15、30、45、60 min后取出，采用雙層平板牛津杯法測抑菌活性，以照射0 min的抑菌活性作為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 21株海洋放線菌對凡隆氣單胞菌抑制效果

由表1可知，有18株海洋放線菌對凡隆氣單胞菌有抑菌效果，其中以AC08F5抑菌圈最大，其抑菌直徑達(dá)（18±0.4） mm，表明菌株AC08F5的胞外代謝產(chǎn)物對病原指示菌凡隆氣單胞菌NQ菌株有較強(qiáng)的抑制作用。

2.2 AC08F5菌株分類地位的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

菌株AC08F5用扦片法培養(yǎng)后，觀察其氣生菌絲、孢子和孢子絲形態(tài)，在1 000倍油鏡下，氣絲呈現(xiàn)如樹枝直或者彎曲狀、孢子絲短、孢子鏈生成串（圖1），這些是鏈霉菌屬[17-18]的一些典型特點(diǎn)，因此，通過顯微觀察可以初步判斷菌株AC08F5屬鏈霉菌。

2.2.2 培養(yǎng)特征

放線菌菌株在不同的菌種鑒定培養(yǎng)基上會表現(xiàn)出不同的培養(yǎng)特征，其氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、有無可溶性色素產(chǎn)生及生長狀況均有一定差異。由表2可見，菌株AC08F5在蒸餾水培養(yǎng)基上培養(yǎng)和在陳海水培養(yǎng)基上培養(yǎng)的氣生菌絲、基內(nèi)菌絲和可溶性色素有一定的差別，而且海水培養(yǎng)基上的生長狀況總體上也稍好，說明海水中所含的礦物質(zhì)對菌株AC08F5的菌絲生長和可溶性色素有一定的影響。而且菌株AC08F5在高氏一號培養(yǎng)基上生長良好，菌絲呈細(xì)粉狀，結(jié)合“2.2.1”節(jié)顯微觀察結(jié)果，也符合鏈霉菌屬的特點(diǎn)。

2.2.3 生理生化反應(yīng)

由表3可知，菌株AC08F5能夠產(chǎn)生蛋白酶液化明膠，能使淀粉水解，能夠產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)生纖維素酶。同時(shí)，試驗(yàn)考慮到菌株來源于海洋，所以還添加了無鹽胰胨水和3.5% NaCl胰胨水反應(yīng)，以考察菌株是否嚴(yán)格需鹽菌，結(jié)果顯示菌株在無鹽和3.5% NaCl下都生長。這說明菌株AC08F5并非嚴(yán)格意義的專性海洋菌，為將來的菌種應(yīng)用于淡水養(yǎng)殖也提供了可能。

2.2.4 AC08F5菌株的DNA測序

將菌株AC08F5的16S rDNA雙向測通后拼裝得序列共1 396 bp，提交GenBank，檢索號為MK 396649，并進(jìn)行序列比對分析，采用ClustalX和MEGA軟件對菌株測序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析并作進(jìn)化樹，由圖2可知，菌株歸屬鏈霉菌屬，最近緣的為Streptomyces griseoplanus（strain M42）、Streptomyces cavourensis subsp.（strain NBRC15391）、Streptomyces nitrosporeus（strain 126186），難以確切的分類到具體的種，所以目前將其命名為Streptomyces sp. strain AC08F5。

2.3 菌株AC08F5發(fā)酵清液中抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性

2.3.1 熱穩(wěn)定性

由圖3可知，在70 ℃以下處理后菌株AC08F5所產(chǎn)生的抑菌活性受溫度影響變化不大，70 ℃處理60 min可保留抑菌活性約77%，但當(dāng)溫度超過80 ℃處理，抑菌活性受溫度影響較大，90 ℃處理的相對活性僅有40%，說明溫度在70 ℃以下條件，抗菌活性物質(zhì)是相對穩(wěn)定的，而高溫易導(dǎo)致發(fā)酵液抑菌活性喪失。

2.3.2 酸堿穩(wěn)定性分析

由圖4可知，發(fā)酵液清液在pH值為4和10時(shí)，其相對抑菌相對活性分別為66.6%和72.1%，而當(dāng)pH值為2～<4和pH值為10～<12時(shí)，發(fā)酵液中的活性物質(zhì)的活性下降迅速，在pH=2、pH=12時(shí)，其相對活性只保存約20%～30%，結(jié)果說明強(qiáng)酸強(qiáng)堿容易導(dǎo)致發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)失活。

2.3.3 紫外照射穩(wěn)定性

由圖5可知，菌株AC08F5代謝產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)在試驗(yàn)設(shè)定的紫外燈照射條件下，保持60 min，其相對抑菌活性仍能夠保持80%以上，初步說明該菌株所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)在紫外燈照射下有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

3 討論

通過篩選試驗(yàn)從21株海洋放線菌菌株中，發(fā)現(xiàn)18株對病原指示菌凡隆氣單胞菌NQ菌株有抑菌效果，其中以菌株AC08F5抑菌活性最強(qiáng)，而且同課題組的研究發(fā)現(xiàn)該菌株對嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌均有一定的抑制作用，所以本試驗(yàn)對菌株AC08F5作進(jìn)一步的鑒定。放線菌的鑒定一般以《放線菌的分類和鑒定》為指導(dǎo)，綜合菌株的培養(yǎng)特征、顯微形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)以及16S rDNA基因序列來進(jìn)行鑒定。本試驗(yàn)中菌株AC08F5經(jīng)鑒定屬鏈霉菌屬但未歸結(jié)到具體的種。Zheng等研究從臺灣海峽的海洋動植物表面、皮層以及腸道等分離的具有抗菌活性的放線菌的種屬分布情況，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)具有抗菌活性的海洋放線菌為鏈霉菌屬[6]。事實(shí)上，更多研究報(bào)道也表明，研究的產(chǎn)生活性產(chǎn)物的海洋放線菌中鏈霉菌占多數(shù)[19]。

海洋環(huán)境的獨(dú)特性，使得海洋微生物能夠產(chǎn)生豐富的、結(jié)構(gòu)新穎的活性天然產(chǎn)物，海洋放線菌雖不是海洋微生物中主要的區(qū)系，卻廣泛分布在海洋各種環(huán)境中，隨著研究的逐漸深入，海洋放線菌及其次級代謝產(chǎn)物已成為尋找新抗生素的重要來源[11]，具有非常重要的價(jià)值。而隨著科學(xué)的發(fā)展，分離純化方法的先進(jìn)和鑒定技術(shù)的精準(zhǔn)，從海洋放線菌分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的化合物越來越多，這些新化合物在抗菌、抗瘧、抗腫瘤和殺蟲等方面具有很好的活性[19]。本試驗(yàn)對于菌株AC08F5代謝產(chǎn)物僅作了初步研究，表明發(fā)酵清液在70 ℃以下、pH值為4～10條件下，拮抗病原凡隆氣單胞菌的活性相對穩(wěn)定，并對紫外燈照射穩(wěn)定。但具體的拮抗病原凡隆氣單胞菌的活性物質(zhì)為哪一類或哪幾類，以及該菌株的次級代謝產(chǎn)物的具體化學(xué)成分有待研究。

目前，考慮到放線菌應(yīng)用與水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要作用機(jī)制是放線菌代謝所產(chǎn)生的各類抗生素抑菌和抗病，將海洋放線菌應(yīng)用于防治水產(chǎn)病害研究相對還是較少，但已有諸多成功的先例，如You等[7-8]、Das等[9]、Kumer等[10]成功地將海洋放線菌應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中，分別用于治療和預(yù)防致病性弧菌引起的蝦病害[7-8]、作為益生菌應(yīng)用于促進(jìn)斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）的生長[9]和從海洋放線菌提取的抗菌物質(zhì)混合飼料喂養(yǎng)凡納濱對蝦促進(jìn)產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)[10];王勇分離獲得1株抗菌譜廣、活性較強(qiáng)的拮抗水產(chǎn)病原菌的海洋放線菌弗氏鏈霉菌DL-4菌株并對其抑菌活性物質(zhì)進(jìn)一步研究，為進(jìn)一步應(yīng)用于水產(chǎn)病害防治提供基礎(chǔ)[11]。水產(chǎn)微生物中出現(xiàn)大量抗生素耐藥類型是因?yàn)樵谒a(chǎn)養(yǎng)殖中大量使用合成的抗生素和藥物所造成的[1]，而直接使用放線菌作為益生菌，相對出現(xiàn)抗性基因橫向轉(zhuǎn)移機(jī)會低，值得在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用[12]。目前，尚未見有將海洋放線菌用于防治凡隆氣單胞菌引起的病害的報(bào)道，對于筆者所在課題組分離自連云港海域高公島海底泥的放線菌菌株AC08F5能否真正在水產(chǎn)養(yǎng)殖中起到抗病防病的作用，以及是否會造成凡隆氣單胞菌等水產(chǎn)病原菌出現(xiàn)耐藥性等還有待研究。

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收 稿日期：2019-01-29

基金項(xiàng)目：江蘇省連云港市科技局農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（編號：CN1407）;江蘇省連云港市科技局農(nóng)業(yè)支撐項(xiàng)目（編號：KK15007）;江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研創(chuàng)新項(xiàng)目（編號：CXKT20180118）。

作者簡介：陳 靜（1973—），女，江蘇宿遷人，碩士，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事海洋微生物及其活性物質(zhì)研究。E-mail：chenj@hhit.edu.cn。