• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    海鮮菇栽培料中細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

    2020-05-11 12:30:11徐兵陸灝鈺韋雪銘張良冀宏
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:微生物群落高通量測序多樣性

    徐兵 陸灝鈺 韋雪銘 張良 冀宏

    摘要: 采用高通量測序技術(shù)研究海鮮菇栽培料中的細(xì)菌群落多樣性、微生物群落組成,結(jié)果表明,海鮮菇栽培料細(xì)菌16S rDNA的V3~V4區(qū)測序共獲得52 192條序列,10 588個(gè)OTU數(shù)目,栽培料中具有較多的微生物群落;群落中,變形菌門占92.71%,γ-變形菌綱占75.77%,假單胞菌目占69.76%,莫拉氏菌科占68.73%,不動(dòng)桿菌屬占66.30%。

    關(guān)鍵詞: 海鮮菇栽培料;微生物群落;多樣性;高通量測序;細(xì)菌

    中圖分類號: S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2020)05-0148-05

    海鮮菇別稱真姬菇,在分類學(xué)上隸屬白蘑科玉蕈屬[1],為藥食兩用菌,其營養(yǎng)豐富,味道鮮美,海鮮菇多糖具有提高免疫力、抗老化、降血脂等功效[2-3]。在海鮮菇工廠化生產(chǎn)中,栽培料的應(yīng)用具有悠久的歷史[4],其質(zhì)量、數(shù)量直接關(guān)系到海鮮菇的產(chǎn)量、質(zhì)量。栽培料主要營養(yǎng)提供者為農(nóng)業(yè)廢棄物,發(fā)酵時(shí)間相對較長,需要3個(gè)月左右,對環(huán)境要求高,這就大大增加了海鮮菇工廠化生產(chǎn)的場地空間、人工成本,從而導(dǎo)致企業(yè)生產(chǎn)成本增加。有研究表明,栽培料在天然堆肥條件下,微生物菌落生長受溫度變化的影響較大[5-6],研制出既適合海鮮菇生長,又能縮短堆料時(shí)間的菌劑顯得尤其重要,而開展海鮮菇栽培料中微生物群落研究具有更重要的意義[7-9]。目前,國內(nèi)外對海鮮菇栽培料主要研究其配比優(yōu)化,對海鮮菇栽培料細(xì)菌群落的研究鮮見報(bào)道。

    高通量測序技術(shù)是目前相對比較成熟的檢測手段,被廣泛應(yīng)用于微生物群落多樣性的研究。自2007年Orsouw等初次對玉米采用高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序[10]開始,便開啟了測序新世界的大門,2011年完成對橡膠樹、可可樹等多種植物的測序[11-12]。本研究利用高通量測序技術(shù),分析海鮮菇栽培料中的微生物群落組成和多樣性,剖析各類微生物的數(shù)量比例,明確優(yōu)勢菌群,了解優(yōu)勢菌群在栽培料中的主要作用,為主動(dòng)控制堆肥發(fā)酵過程、縮短堆料周期、減少企業(yè)生產(chǎn)成本、提高海鮮菇產(chǎn)量和質(zhì)量提供可靠的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試材料 堆料3個(gè)月的海鮮菇栽培料,其配比為玉米芯3%、甘蔗渣3%、木屑3%、麥麩1%、豆粕0.5%、玉米粉0.5%、生石灰0.025%,由昆山正興食用菌有限公司提供。

    1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Soil DNA Kit,由OMEGA公司生產(chǎn);Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒,由Life公司生產(chǎn);2×Taq Master Mix,由Vazyme公司生產(chǎn);MagicPure Size Selection DNA Beads,由Transgen公司生產(chǎn)。

    1.1.3 儀器與設(shè)備 臺(tái)式離心機(jī),由Thermo Fisher公司生產(chǎn);混勻型干式恒溫器,由深圳拓能達(dá)科技有限公司生產(chǎn);電泳儀、電泳槽,由北京六一儀器廠生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng),由UVP公司生產(chǎn);Qubit3.0熒光計(jì),由Invitrogen公司生產(chǎn);PCR儀,由BIO-RAD生產(chǎn);移液器,由Eppendorf公司生產(chǎn)。

    1.2 測定內(nèi)容與方法

    1.2.1 理化指標(biāo) 分別參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》(GB 5009.3—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》(GB 5009.4—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》(GB 5009.237—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》(GB 5009.5—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》(GB 5009.235—2016)測定海鮮菇栽培料的水分、灰分、pH值、蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量。采用DNS法測定還原糖、總糖含量。

    1.2.2 微生物指標(biāo) 分別參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》(GB 4789.2—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》(GB 4789.3—2016)、《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》(GB/T 13093—2006)測定海鮮菇栽培料中的菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、細(xì)菌總數(shù)。

    1.2.3 微生物多樣性

    1.2.3.1 樣品處理 取栽培料原始樣品200 mg,放入無菌的2 mL EP管中,加入濃度為70%的乙醇1 mL,混合,振蕩;室溫10 000 r/min離心3 min,丟棄上漿;添加1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS溶液),混勻,室溫10 000 r/min離心1 min,丟棄上層液體;倒置EP管在吸濕紙上1 min,直到?jīng)]有液體流出,將樣品管置于烘箱中55 ℃干燥10 min,使殘留乙醇完全揮發(fā)。

    1.2.3.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增 采用試劑盒提取海鮮菇栽培料中的細(xì)菌基因組DNA,提取的基因組DNA在細(xì)菌16S rDNA的V3~V4區(qū)進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增;待反應(yīng)完全結(jié)束,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,可得到清晰的條帶(圖1),DNA濃度達(dá)到擴(kuò)增所需要求,可用于后續(xù)的研究分析。

    1.2.3.3 測序數(shù)據(jù)處理優(yōu)化 運(yùn)用Qiime 1.8.0軟件過濾序列,去除3′端的引物接頭、引物錯(cuò)配比率>0.1的序列、樣本中序列尾部質(zhì)量值<20的堿基、含N的序列、長度<200 bp的序列、嵌合體序列,使用Mothur 1.30.1軟件中的Uchime去除嵌合體序列。

    1.2.3.4 多樣性分析 采用Usearch 5.2.236軟件對97%相似水平下的操作分類單元(OTU)進(jìn)行聚類分析,選擇豐度最高的序列作為OTU代表性序列;采用Mothur 1.30.1軟件分析得出Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Coverage指數(shù)等群落分布多樣性指數(shù)及Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)等群落分布豐度指數(shù)。

    1.2.3.5 群落結(jié)構(gòu)分析 采用序列比對分析軟件Blastn工具將OTU序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,篩選出OTU序列的最佳比對結(jié)果,并對比對結(jié)果進(jìn)行過濾,獲得樣品在門、綱、目、科、屬不同分類水平上的分類學(xué)比對情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 海鮮菇栽培料的理化性狀及微生物指標(biāo)

    試驗(yàn)結(jié)果表明,海鮮菇栽培料中水分含量、灰分含量、pH值、蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量、還原糖含量、總糖含量分別為60.27%、2.44%、7.20、3.98%、0.023%、0.18%、26.70%,菌落總數(shù)、細(xì)菌總數(shù)分別為1.3×107、1.2×108 CFU/g,大腸菌群未檢出。

    2.2 海鮮菇栽培料中的微生物多樣性

    試驗(yàn)結(jié)果表明,從16S rDNA基因的V3~V4測序中獲得56 422個(gè)序列,平均長度為462.26 bp,質(zhì)控后,共有52 192個(gè)序列,平均長度為424.26 bp;對97%相似水平下的序列進(jìn)行OTU統(tǒng)計(jì)分析,共獲得10 588個(gè)OTU數(shù);經(jīng)軟件分析,ACE、Chao1、Shannon、Simpson、Coverage指數(shù)分別為480 779.61、151 060.50、4.59、0.10、0.81,說明栽培材料中微生物群落的多樣性、總體豐富程度相對較高[13]。

    2.3 海鮮菇栽培料細(xì)菌群落在不同分類學(xué)上的分布

    2.3.1 門、綱 試驗(yàn)結(jié)果表明,海鮮菇栽培料中共鑒定出11個(gè)細(xì)菌門,主要的有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)9個(gè)細(xì)菌門,占比分別為92.71%、3.63%、3.37%、0.19%、0.02%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%。由圖2可見,變形菌門中的γ-變形菌綱占比相對最高,為75.77%,是細(xì)菌的主要種類。

    2.3.2 目、科 由圖3、圖4可見,海鮮菇栽培料中共鑒定出超過20種細(xì)菌目,其中,假單胞菌目 (Pseudomonadales)的比例相對最高,達(dá)到69.76%,而伯克氏菌目(Burkholderiales)、紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)分別為11.57%、4.72%,說明從目水平上看,假單胞菌目最為占優(yōu);在科水平上,莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)分別屬于假單胞目、伯克氏菌目,所占比例分別為68.73%、11.46%,而紅細(xì)菌目中紅桿菌科(Rhodobacteraceae)僅為4.72%,說明莫拉氏菌科最為占優(yōu)。

    2.3.3? 屬 由圖5可見,海鮮菇栽培料中共鑒定獲得超過49個(gè)細(xì)菌屬,主要有不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、芽孢桿菌屬(Gemmobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas),占比分別為66.30%、9.56%、3.43%、2.99%、1.55%、1.49%,其中,不動(dòng)桿菌屬最為占優(yōu)。

    3 結(jié)論與討論

    食用菌栽培料中的含水量一般控制在60%~65%[14-15];灰分含量的高低會(huì)直接影響海鮮菇中礦物質(zhì)含量的多少;pH值偏低,拌料操作中往往加入1%的石灰來調(diào)控[16],pH值偏高,可以在栽培料中添加含氮量較高的物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,海鮮菇栽培料中的水分含量、灰分含量、pH值分別為60.27%、2.44%、7.20,滿足海鮮菇工廠化生產(chǎn)的需求。栽培料中微生物生長有一部分是依靠其分解栽培料中的糖,糖含量高低至關(guān)重要,而發(fā)酵時(shí)間越長,糖含量會(huì)越少,因此,在早期發(fā)酵階段,應(yīng)盡可能滿足微生物的生長需求,使其充分發(fā)酵[17-18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,海鮮菇栽培料中蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量、還原糖含量、總糖含量分別為3.98%、0.023%、0.18%、26.70%,能較好滿足海鮮菇生長對養(yǎng)分的需求。

    海鮮菇生長所需養(yǎng)料是靠微生物分解栽培料中的營養(yǎng)物質(zhì)獲得,微生物扮演著重要的角色。γ-變形菌亞群在變形菌門中是重要的菌群,而變形菌門是革蘭氏陰性菌的主要組成部分[19]。Peters等分析由玉米秸稈、木屑組成的堆肥材料中的細(xì)菌群落發(fā)現(xiàn),其中存在大量的γ-變形菌亞群[20]。假單胞菌目在栽培料發(fā)酵過程中對加快腐熟發(fā)揮著重要的作用,王勝認(rèn)為,一個(gè)好的腐熟環(huán)境可以加快碳、氮、磷、鉀、硫等分解而被植物吸收,并在秸稈腐熟中加入沼澤紅假單胞菌以創(chuàng)造好的發(fā)酵環(huán)境[21]。不動(dòng)桿菌是兼性厭氧菌,能降解纖維素,在自然發(fā)酵過程中,栽培料中的氧含量會(huì)相對較低,對不動(dòng)桿菌而言可提高堆肥中纖維素的分解效率[22-23]。本試驗(yàn)采用高通量測序、微生物多樣性檢測技術(shù)分析海鮮菇栽培料中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性,結(jié)果表明,共獲得52 192條序列,10 588個(gè)OTU數(shù);栽培料中共鑒定得到細(xì)菌菌落11個(gè)門、20個(gè)目、49個(gè)屬,栽培料中的優(yōu)勢菌群分別是變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、莫拉氏菌科、不動(dòng)桿菌屬,其相應(yīng)占比分別為92.71%、75.77%、69.76%、68.73%、66.30%,說明栽培料中菌群有較好的多樣性和豐度,對海鮮菇生長十分有利。

    須補(bǔ)充的是,本次試驗(yàn)中未檢出大腸桿菌,說明海鮮菇栽培料被糞便污染的可能性很小,存在腸道病原微生物的可能性微乎其微,這在一定程度上減少了不利菌群對栽培材料潛在的危害。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Bolormaa Z,Kang M G,Seo G S,et al. Analysis of nutritional characteristics and physiological functionality of Hypsizygus marmoreus(brown cultivar)[J]. The Korean Journal of Mycology,2012,40(2):104-108.

    [2]Mori K,Kobayashi C,Tomita T,et al. Antiatherosclerotic effect of the edible mushrooms Pleurotus eryngii(Erngi),Grifola frondosa(Maitake)and Hypsizygus marmoreus(Bunashimeji)in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Nutrition Research,2008,28(5):335-342.

    [3]Ikekawa T. Beneficial effects of mushrooms,edible and medicinal,on health care[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms,2001,3(2/3):79.

    [4]Sato S,Hirakawa H,Isobe S,et al. Sequence analysis of the genome of an oil-bearing tree,Jatropha curcas L.[J]. DNA Research,2011,18(1):65-76.

    [5]周月明,雷陽明,夏家?guī)?,? 農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥化進(jìn)程與纖維素類物質(zhì)降解研究[J]. 三峽生態(tài)環(huán)境監(jiān)測,2018,3(1):32-40.

    [6]萬水霞,郭熙盛,朱宏賦,等. 自然堆肥過程中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(28):13710-13711,13749.

    [7]季家舉,謝 元. 工廠化海鮮菇瓶栽技術(shù)研究[J]. 輕工科技,2018,34(2):7-8,24.

    [8]謝春芹,賈 君,凡軍民,等. 海鮮菇優(yōu)良菌株篩選和栽培營養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[J]. 中國食用菌,2017,36(1):10-13.

    [9]黃 亮,王 玉,班立桐,等. 海鮮菇工廠化瓶栽優(yōu)良菌株的篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(20):135-137.

    [10]Orsouw N J V,Hogers R C J,Janssen A,et al. Complexity reduction of polymorphic sequences (CRoPSTM):a novel approach for large-scale polymorphism discovery in complex genomes[J]. PLoS One,2007,11:e1172.

    [11]Argout X,Salse J,Aury J M,et al. The genome of Theobroma cacao[J]. Nature Genetics,2011,43(2):101-108.

    [12]Shulaev V,Sargent D J,Crowhurst R N,et al. The genome of woodland strawberry (Fragaria vesca)[J]. Nature Genetics,2011,43(2):109-116.[HJ1.9mm]

    [13]張 敏,張 艷,黃麗麗,等. 基于16S rDNA高通量測序方法比較新疆西北部地區(qū)乳品中微生物的多樣性[J]. 食品科學(xué),2017,38(20):27-33.

    [14]巫仁高. 海鮮菇工廠化袋栽制袋關(guān)鍵技術(shù)集成研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,31(2):140-144.

    [15]李淑榮,王 麗,倪淑君,等. 海鮮菇營養(yǎng)成分分析[J]. 食品工業(yè),2018,39(2):311-313.

    [16]劉建軍,朱愛蓮,金 力,等. 栽培瓶培養(yǎng)料理化性質(zhì)對真姬菇生長的影響[J]. 浙江食用菌,2009,17(4):49-51.

    [17]王鴻磊,王紅艷,宋俊芬,等. 雙孢菇培養(yǎng)料工廠化發(fā)酵過程中微生物及物質(zhì)變化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(1):94-96.

    [18]常路路,申進(jìn)文. 平菇培養(yǎng)料發(fā)酵過程理化因素及微生物變化研究[J]. 中國食用菌,2012,31(4):34-36.

    [19]王 琪. 蘆筍老莖栽培食用菌和培養(yǎng)料堆制過程中微生物多樣性的研究[D]. 太原:山西大學(xué),2012.

    [20]Peters S,Koschinsky S,Schwieger F,et al. Succession of microbial communities during hot composting as detected by PCR-single-strand-conformation polymorphism-based genetic profiles of small-subunit rRNA genes[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66(3):930-936.

    [21]王 勝. 一種沼澤紅假單胞菌腐解劑及其在鹽堿地秸稈腐熟改土中的應(yīng)用:CN105110823A[P]. 2015-12-02.

    [22]朱燕華,王 倩,宋曉霞,等. 基于稻、麥秸稈工廠化栽培雙孢蘑菇的理化性質(zhì)變化研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2017,33(7):86-91.

    [23]丁曉飛,丁立功,郭悠然,等. 一種具有纖維素降解能力的兼性厭氧的不動(dòng)桿菌及其應(yīng)用:CN106497834A[P]. 2017-03-15.

    收 稿日期:2019-02-26

    基金項(xiàng)目:江蘇省蘇州市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(編號:SNG2017066)。

    作者簡介:徐 兵(1982—),男,江蘇常熟人,碩士,實(shí)驗(yàn)師,從事微生物學(xué)研究。E-mail:xubing@cslg.cn。

    通信作者:冀 宏,博士,教授,從事食、藥用菌研究。E-mail:595827676@qq.com。

    猜你喜歡
    微生物群落高通量測序多樣性
    微生物群落變化與妊娠結(jié)局關(guān)系的研究進(jìn)展
    川明參輪作對煙地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響
    多穗柯轉(zhuǎn)錄組分析及黃酮類化合物合成相關(guān)基因的挖掘
    人參根際真菌群落多樣性及組成的變化
    LncRNAs作為miRNA的靶模擬物調(diào)節(jié)miRNA
    土壤調(diào)理劑對植煙土壤微生物群落的影響
    新時(shí)期群文輔導(dǎo)工作的特征
    海洋微生物次生代謝的生物合成機(jī)制
    科技資訊(2016年19期)2016-11-15 10:39:12
    舞蹈表演的表現(xiàn)形式多樣性研究
    人間(2016年27期)2016-11-11 16:27:23
    水磨地區(qū)蕨類植物多樣性調(diào)查分析
    久久久久久大精品| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲色图av天堂| 国产午夜福利久久久久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产亚洲精品av在线| 成人欧美大片| 欧美大码av| 欧美另类亚洲清纯唯美| a在线观看视频网站| 黄色 视频免费看| 不卡一级毛片| 中文亚洲av片在线观看爽| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 日本一区二区免费在线视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 最近最新免费中文字幕在线| 变态另类丝袜制服| 天堂√8在线中文| 国产亚洲欧美在线一区二区| 9191精品国产免费久久| 亚洲精品久久国产高清桃花| 哪里可以看免费的av片| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久久久九九精品二区国产 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 97碰自拍视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 精品国产亚洲在线| 免费无遮挡裸体视频| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲专区字幕在线| 日韩精品青青久久久久久| 国产免费av片在线观看野外av| 久久久精品欧美日韩精品| 91国产中文字幕| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产伦在线观看视频一区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产不卡一卡二| www.999成人在线观看| 国产精品 国内视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 一级毛片精品| 两个人的视频大全免费| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久中文字幕人妻熟女| 免费在线观看成人毛片| 日本三级黄在线观看| 91在线观看av| 黄色毛片三级朝国网站| 免费在线观看日本一区| 国产午夜福利久久久久久| 久久人人精品亚洲av| 国产一区二区三区视频了| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 床上黄色一级片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一进一出好大好爽视频| 搡老岳熟女国产| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 午夜福利欧美成人| 黄频高清免费视频| 成人国语在线视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久香蕉激情| 伦理电影免费视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜福利18| 国产三级黄色录像| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 人人妻人人看人人澡| 久久国产精品影院| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美日本视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 三级毛片av免费| 亚洲午夜理论影院| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久久久久久久黄片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 黄色丝袜av网址大全| 少妇熟女aⅴ在线视频| 波多野结衣高清无吗| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 午夜精品久久久久久毛片777| 女警被强在线播放| 很黄的视频免费| 校园春色视频在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产一区二区三区视频了| 日韩免费av在线播放| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久久久久久久中文| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 在线播放国产精品三级| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 热99re8久久精品国产| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品在线美女| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费看日本二区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品国产高清国产av| 欧美日韩黄片免| 国产在线观看jvid| 我要搜黄色片| 中出人妻视频一区二区| 黑人操中国人逼视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品野战在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 香蕉丝袜av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲av成人一区二区三| 无遮挡黄片免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| bbb黄色大片| 无人区码免费观看不卡| 免费观看精品视频网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产视频内射| 国产熟女xx| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久国产欧美日韩av| 欧美成人性av电影在线观看| 日韩欧美在线二视频| 日韩精品中文字幕看吧| 色综合亚洲欧美另类图片| a级毛片在线看网站| 国产激情久久老熟女| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 又黄又粗又硬又大视频| 最好的美女福利视频网| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品久久蜜臀av无| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一区福利在线观看| a级毛片在线看网站| 国产精品永久免费网站| 熟女电影av网| 丰满人妻一区二区三区视频av | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 无遮挡黄片免费观看| 午夜亚洲福利在线播放| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产精品国产高清国产av| 一a级毛片在线观看| 国产成人精品无人区| 亚洲avbb在线观看| 在线a可以看的网站| 国产精品av视频在线免费观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产一区二区在线观看日韩 | 国语自产精品视频在线第100页| www日本黄色视频网| 两个人视频免费观看高清| 人妻久久中文字幕网| 成人国产综合亚洲| 久久天堂一区二区三区四区| 精品熟女少妇八av免费久了| 一本综合久久免费| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 禁无遮挡网站| 无人区码免费观看不卡| 国产成人欧美在线观看| 正在播放国产对白刺激| 看片在线看免费视频| 又黄又粗又硬又大视频| 日本成人三级电影网站| 18禁观看日本| 精华霜和精华液先用哪个| 国产成年人精品一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美黑人巨大hd| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲男人的天堂狠狠| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 美女午夜性视频免费| 亚洲五月天丁香| 18禁国产床啪视频网站| 久久中文字幕人妻熟女| 精品久久蜜臀av无| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲九九香蕉| 中文在线观看免费www的网站 | 免费看十八禁软件| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 男人舔女人的私密视频| 国产高清视频在线观看网站| 久久久久九九精品影院| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 两个人视频免费观看高清| 特大巨黑吊av在线直播| 日本三级黄在线观看| 亚洲在线自拍视频| 色综合婷婷激情| 国产精品1区2区在线观看.| 岛国在线观看网站| 老汉色∧v一级毛片| 欧美日韩黄片免| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久香蕉国产精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| a级毛片在线看网站| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产99久久九九免费精品| 久久久久久人人人人人| 香蕉丝袜av| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲精品在线美女| 九色成人免费人妻av| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品久久久久久久末码| 两人在一起打扑克的视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产主播在线观看一区二区| www.www免费av| 怎么达到女性高潮| 亚洲真实伦在线观看| 九九热线精品视视频播放| 女警被强在线播放| 一本综合久久免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久性视频一级片| 国产伦在线观看视频一区| 日本 av在线| 日韩大码丰满熟妇| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99热这里只有是精品50| 国产男靠女视频免费网站| 免费在线观看完整版高清| 丝袜人妻中文字幕| 在线国产一区二区在线| 国产精品一及| av片东京热男人的天堂| 久久国产精品影院| 99在线人妻在线中文字幕| aaaaa片日本免费| 人人妻人人看人人澡| av国产免费在线观看| 国模一区二区三区四区视频 | 两人在一起打扑克的视频| 日韩欧美在线乱码| 丰满的人妻完整版| x7x7x7水蜜桃| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av成人av| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲 国产 在线| 两个人视频免费观看高清| 两个人看的免费小视频| av天堂在线播放| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲专区字幕在线| 免费在线观看完整版高清| xxxwww97欧美| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日韩欧美免费精品| 精品第一国产精品| 无遮挡黄片免费观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 午夜激情福利司机影院| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美日韩精品网址| av欧美777| 一个人免费在线观看电影 | 99久久无色码亚洲精品果冻| www国产在线视频色| 国产激情欧美一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩欧美在线乱码| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 中亚洲国语对白在线视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲精品一区av在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 国产午夜精品论理片| 亚洲,欧美精品.| 性欧美人与动物交配| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久中文字幕人妻熟女| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美中文日本在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲国产欧美一区二区综合| 在线国产一区二区在线| 久久中文看片网| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产成人精品无人区| 一级毛片精品| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 美女大奶头视频| 一级作爱视频免费观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一进一出好大好爽视频| 国产高清有码在线观看视频 | 久久九九热精品免费| 国产99久久九九免费精品| 一a级毛片在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 国产免费男女视频| 欧美性猛交黑人性爽| 久99久视频精品免费| 久久 成人 亚洲| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 舔av片在线| 天堂影院成人在线观看| 美女免费视频网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产男靠女视频免费网站| 青草久久国产| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 中文字幕人成人乱码亚洲影| bbb黄色大片| 特级一级黄色大片| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 欧美日本视频| 亚洲精品色激情综合| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 两个人看的免费小视频| 免费看a级黄色片| 欧美乱妇无乱码| 日本熟妇午夜| 久久久久久大精品| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲片人在线观看| 午夜老司机福利片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品精品国产色婷婷| 九色国产91popny在线| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产99白浆流出| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日本黄大片高清| 欧美在线一区亚洲| 国产精品亚洲美女久久久| 天堂动漫精品| 天堂影院成人在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 一进一出抽搐动态| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品久久视频播放| 无限看片的www在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 正在播放国产对白刺激| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久国产成人免费| 国语自产精品视频在线第100页| 男人舔奶头视频| 午夜免费激情av| 日韩国内少妇激情av| 99在线人妻在线中文字幕| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜影院日韩av| 国产真实乱freesex| 国产精品一区二区精品视频观看| 91av网站免费观看| 黄色毛片三级朝国网站| 一a级毛片在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲五月天丁香| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久精品国产清高在天天线| 校园春色视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 男插女下体视频免费在线播放| 岛国在线观看网站| 免费观看人在逋| 国产1区2区3区精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产一区二区在线观看日韩 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 波多野结衣高清无吗| 制服诱惑二区| 精品国产亚洲在线| 久久精品成人免费网站| 免费无遮挡裸体视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲av片天天在线观看| 久久久国产精品麻豆| 国产99久久九九免费精品| 久久精品国产清高在天天线| 国产久久久一区二区三区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日韩高清综合在线| 国产乱人伦免费视频| 成人午夜高清在线视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲无线在线观看| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 两个人看的免费小视频| 视频区欧美日本亚洲| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品 国内视频| 动漫黄色视频在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩欧美精品v在线| 校园春色视频在线观看| 国产成年人精品一区二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 最新美女视频免费是黄的| а√天堂www在线а√下载| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩高清综合在线| 大型黄色视频在线免费观看| 精品久久蜜臀av无| 精品国产美女av久久久久小说| 怎么达到女性高潮| 我要搜黄色片| 小说图片视频综合网站| 一本一本综合久久| 女同久久另类99精品国产91| 中国美女看黄片| 欧美精品亚洲一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲午夜理论影院| 视频区欧美日本亚洲| 可以在线观看毛片的网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 香蕉久久夜色| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日韩欧美 国产精品| 国产97色在线日韩免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 女同久久另类99精品国产91| 无人区码免费观看不卡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久热在线av| 舔av片在线| 国语自产精品视频在线第100页| 精品欧美国产一区二区三| 男女午夜视频在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 天堂√8在线中文| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 99riav亚洲国产免费| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 丰满的人妻完整版| 国产成人精品久久二区二区免费| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美日韩国产亚洲二区| av超薄肉色丝袜交足视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美3d第一页| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 天堂影院成人在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日韩精品中文字幕看吧| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜福利18| 欧美大码av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 少妇熟女aⅴ在线视频| 69av精品久久久久久| av福利片在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 国产黄片美女视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产一区二区在线av高清观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一本一本综合久久| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲av成人精品一区久久| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成人特级黄色片久久久久久久| av片东京热男人的天堂| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 中国美女看黄片| 国产精品影院久久| 中文在线观看免费www的网站 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久这里只有精品19| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 怎么达到女性高潮| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲成人久久性| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲熟妇熟女久久| 国产亚洲精品av在线| 国产成人影院久久av| 男人舔奶头视频| 午夜成年电影在线免费观看| 露出奶头的视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 三级毛片av免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产熟女xx| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产三级在线视频| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品久久久久久久电影 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 色综合亚洲欧美另类图片| 中文资源天堂在线| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 看免费av毛片| 久久亚洲真实| 神马国产精品三级电影在线观看 | 久久久久久久午夜电影| 欧美日韩精品网址| 亚洲欧美激情综合另类| 在线免费观看的www视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 香蕉国产在线看| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 免费看十八禁软件| 在线视频色国产色| 可以在线观看毛片的网站| 日本 欧美在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 69av精品久久久久久| 嫩草影视91久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 午夜福利高清视频| 国产精品 欧美亚洲| av在线天堂中文字幕| 久久精品91蜜桃| 色av中文字幕| 精品熟女少妇八av免费久了| 无遮挡黄片免费观看| 正在播放国产对白刺激| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩大码丰满熟妇| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲,欧美精品.| 亚洲av成人一区二区三| 男女视频在线观看网站免费 | 后天国语完整版免费观看| 午夜福利在线在线| 午夜福利成人在线免费观看| 男女床上黄色一级片免费看| 搡老熟女国产l中国老女人| 1024视频免费在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩欧美三级三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 麻豆av在线久日| 久久精品人妻少妇| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲av成人av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久久国内视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影|