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    海鮮菇栽培料中細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

    2020-05-11 12:30:11徐兵陸灝鈺韋雪銘張良冀宏
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:微生物群落高通量測序多樣性

    徐兵 陸灝鈺 韋雪銘 張良 冀宏

    摘要: 采用高通量測序技術(shù)研究海鮮菇栽培料中的細(xì)菌群落多樣性、微生物群落組成,結(jié)果表明,海鮮菇栽培料細(xì)菌16S rDNA的V3~V4區(qū)測序共獲得52 192條序列,10 588個(gè)OTU數(shù)目,栽培料中具有較多的微生物群落;群落中,變形菌門占92.71%,γ-變形菌綱占75.77%,假單胞菌目占69.76%,莫拉氏菌科占68.73%,不動(dòng)桿菌屬占66.30%。

    關(guān)鍵詞: 海鮮菇栽培料;微生物群落;多樣性;高通量測序;細(xì)菌

    中圖分類號: S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2020)05-0148-05

    海鮮菇別稱真姬菇,在分類學(xué)上隸屬白蘑科玉蕈屬[1],為藥食兩用菌,其營養(yǎng)豐富,味道鮮美,海鮮菇多糖具有提高免疫力、抗老化、降血脂等功效[2-3]。在海鮮菇工廠化生產(chǎn)中,栽培料的應(yīng)用具有悠久的歷史[4],其質(zhì)量、數(shù)量直接關(guān)系到海鮮菇的產(chǎn)量、質(zhì)量。栽培料主要營養(yǎng)提供者為農(nóng)業(yè)廢棄物,發(fā)酵時(shí)間相對較長,需要3個(gè)月左右,對環(huán)境要求高,這就大大增加了海鮮菇工廠化生產(chǎn)的場地空間、人工成本,從而導(dǎo)致企業(yè)生產(chǎn)成本增加。有研究表明,栽培料在天然堆肥條件下,微生物菌落生長受溫度變化的影響較大[5-6],研制出既適合海鮮菇生長,又能縮短堆料時(shí)間的菌劑顯得尤其重要,而開展海鮮菇栽培料中微生物群落研究具有更重要的意義[7-9]。目前,國內(nèi)外對海鮮菇栽培料主要研究其配比優(yōu)化,對海鮮菇栽培料細(xì)菌群落的研究鮮見報(bào)道。

    高通量測序技術(shù)是目前相對比較成熟的檢測手段,被廣泛應(yīng)用于微生物群落多樣性的研究。自2007年Orsouw等初次對玉米采用高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序[10]開始,便開啟了測序新世界的大門,2011年完成對橡膠樹、可可樹等多種植物的測序[11-12]。本研究利用高通量測序技術(shù),分析海鮮菇栽培料中的微生物群落組成和多樣性,剖析各類微生物的數(shù)量比例,明確優(yōu)勢菌群,了解優(yōu)勢菌群在栽培料中的主要作用,為主動(dòng)控制堆肥發(fā)酵過程、縮短堆料周期、減少企業(yè)生產(chǎn)成本、提高海鮮菇產(chǎn)量和質(zhì)量提供可靠的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試材料 堆料3個(gè)月的海鮮菇栽培料,其配比為玉米芯3%、甘蔗渣3%、木屑3%、麥麩1%、豆粕0.5%、玉米粉0.5%、生石灰0.025%,由昆山正興食用菌有限公司提供。

    1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Soil DNA Kit,由OMEGA公司生產(chǎn);Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒,由Life公司生產(chǎn);2×Taq Master Mix,由Vazyme公司生產(chǎn);MagicPure Size Selection DNA Beads,由Transgen公司生產(chǎn)。

    1.1.3 儀器與設(shè)備 臺(tái)式離心機(jī),由Thermo Fisher公司生產(chǎn);混勻型干式恒溫器,由深圳拓能達(dá)科技有限公司生產(chǎn);電泳儀、電泳槽,由北京六一儀器廠生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng),由UVP公司生產(chǎn);Qubit3.0熒光計(jì),由Invitrogen公司生產(chǎn);PCR儀,由BIO-RAD生產(chǎn);移液器,由Eppendorf公司生產(chǎn)。

    1.2 測定內(nèi)容與方法

    1.2.1 理化指標(biāo) 分別參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》(GB 5009.3—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》(GB 5009.4—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》(GB 5009.237—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》(GB 5009.5—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》(GB 5009.235—2016)測定海鮮菇栽培料的水分、灰分、pH值、蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量。采用DNS法測定還原糖、總糖含量。

    1.2.2 微生物指標(biāo) 分別參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》(GB 4789.2—2016)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》(GB 4789.3—2016)、《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》(GB/T 13093—2006)測定海鮮菇栽培料中的菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、細(xì)菌總數(shù)。

    1.2.3 微生物多樣性

    1.2.3.1 樣品處理 取栽培料原始樣品200 mg,放入無菌的2 mL EP管中,加入濃度為70%的乙醇1 mL,混合,振蕩;室溫10 000 r/min離心3 min,丟棄上漿;添加1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS溶液),混勻,室溫10 000 r/min離心1 min,丟棄上層液體;倒置EP管在吸濕紙上1 min,直到?jīng)]有液體流出,將樣品管置于烘箱中55 ℃干燥10 min,使殘留乙醇完全揮發(fā)。

    1.2.3.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增 采用試劑盒提取海鮮菇栽培料中的細(xì)菌基因組DNA,提取的基因組DNA在細(xì)菌16S rDNA的V3~V4區(qū)進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增;待反應(yīng)完全結(jié)束,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,可得到清晰的條帶(圖1),DNA濃度達(dá)到擴(kuò)增所需要求,可用于后續(xù)的研究分析。

    1.2.3.3 測序數(shù)據(jù)處理優(yōu)化 運(yùn)用Qiime 1.8.0軟件過濾序列,去除3′端的引物接頭、引物錯(cuò)配比率>0.1的序列、樣本中序列尾部質(zhì)量值<20的堿基、含N的序列、長度<200 bp的序列、嵌合體序列,使用Mothur 1.30.1軟件中的Uchime去除嵌合體序列。

    1.2.3.4 多樣性分析 采用Usearch 5.2.236軟件對97%相似水平下的操作分類單元(OTU)進(jìn)行聚類分析,選擇豐度最高的序列作為OTU代表性序列;采用Mothur 1.30.1軟件分析得出Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Coverage指數(shù)等群落分布多樣性指數(shù)及Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)等群落分布豐度指數(shù)。

    1.2.3.5 群落結(jié)構(gòu)分析 采用序列比對分析軟件Blastn工具將OTU序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,篩選出OTU序列的最佳比對結(jié)果,并對比對結(jié)果進(jìn)行過濾,獲得樣品在門、綱、目、科、屬不同分類水平上的分類學(xué)比對情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 海鮮菇栽培料的理化性狀及微生物指標(biāo)

    試驗(yàn)結(jié)果表明,海鮮菇栽培料中水分含量、灰分含量、pH值、蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量、還原糖含量、總糖含量分別為60.27%、2.44%、7.20、3.98%、0.023%、0.18%、26.70%,菌落總數(shù)、細(xì)菌總數(shù)分別為1.3×107、1.2×108 CFU/g,大腸菌群未檢出。

    2.2 海鮮菇栽培料中的微生物多樣性

    試驗(yàn)結(jié)果表明,從16S rDNA基因的V3~V4測序中獲得56 422個(gè)序列,平均長度為462.26 bp,質(zhì)控后,共有52 192個(gè)序列,平均長度為424.26 bp;對97%相似水平下的序列進(jìn)行OTU統(tǒng)計(jì)分析,共獲得10 588個(gè)OTU數(shù);經(jīng)軟件分析,ACE、Chao1、Shannon、Simpson、Coverage指數(shù)分別為480 779.61、151 060.50、4.59、0.10、0.81,說明栽培材料中微生物群落的多樣性、總體豐富程度相對較高[13]。

    2.3 海鮮菇栽培料細(xì)菌群落在不同分類學(xué)上的分布

    2.3.1 門、綱 試驗(yàn)結(jié)果表明,海鮮菇栽培料中共鑒定出11個(gè)細(xì)菌門,主要的有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)9個(gè)細(xì)菌門,占比分別為92.71%、3.63%、3.37%、0.19%、0.02%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%。由圖2可見,變形菌門中的γ-變形菌綱占比相對最高,為75.77%,是細(xì)菌的主要種類。

    2.3.2 目、科 由圖3、圖4可見,海鮮菇栽培料中共鑒定出超過20種細(xì)菌目,其中,假單胞菌目 (Pseudomonadales)的比例相對最高,達(dá)到69.76%,而伯克氏菌目(Burkholderiales)、紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)分別為11.57%、4.72%,說明從目水平上看,假單胞菌目最為占優(yōu);在科水平上,莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)分別屬于假單胞目、伯克氏菌目,所占比例分別為68.73%、11.46%,而紅細(xì)菌目中紅桿菌科(Rhodobacteraceae)僅為4.72%,說明莫拉氏菌科最為占優(yōu)。

    2.3.3? 屬 由圖5可見,海鮮菇栽培料中共鑒定獲得超過49個(gè)細(xì)菌屬,主要有不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、芽孢桿菌屬(Gemmobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas),占比分別為66.30%、9.56%、3.43%、2.99%、1.55%、1.49%,其中,不動(dòng)桿菌屬最為占優(yōu)。

    3 結(jié)論與討論

    食用菌栽培料中的含水量一般控制在60%~65%[14-15];灰分含量的高低會(huì)直接影響海鮮菇中礦物質(zhì)含量的多少;pH值偏低,拌料操作中往往加入1%的石灰來調(diào)控[16],pH值偏高,可以在栽培料中添加含氮量較高的物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,海鮮菇栽培料中的水分含量、灰分含量、pH值分別為60.27%、2.44%、7.20,滿足海鮮菇工廠化生產(chǎn)的需求。栽培料中微生物生長有一部分是依靠其分解栽培料中的糖,糖含量高低至關(guān)重要,而發(fā)酵時(shí)間越長,糖含量會(huì)越少,因此,在早期發(fā)酵階段,應(yīng)盡可能滿足微生物的生長需求,使其充分發(fā)酵[17-18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,海鮮菇栽培料中蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量、還原糖含量、總糖含量分別為3.98%、0.023%、0.18%、26.70%,能較好滿足海鮮菇生長對養(yǎng)分的需求。

    海鮮菇生長所需養(yǎng)料是靠微生物分解栽培料中的營養(yǎng)物質(zhì)獲得,微生物扮演著重要的角色。γ-變形菌亞群在變形菌門中是重要的菌群,而變形菌門是革蘭氏陰性菌的主要組成部分[19]。Peters等分析由玉米秸稈、木屑組成的堆肥材料中的細(xì)菌群落發(fā)現(xiàn),其中存在大量的γ-變形菌亞群[20]。假單胞菌目在栽培料發(fā)酵過程中對加快腐熟發(fā)揮著重要的作用,王勝認(rèn)為,一個(gè)好的腐熟環(huán)境可以加快碳、氮、磷、鉀、硫等分解而被植物吸收,并在秸稈腐熟中加入沼澤紅假單胞菌以創(chuàng)造好的發(fā)酵環(huán)境[21]。不動(dòng)桿菌是兼性厭氧菌,能降解纖維素,在自然發(fā)酵過程中,栽培料中的氧含量會(huì)相對較低,對不動(dòng)桿菌而言可提高堆肥中纖維素的分解效率[22-23]。本試驗(yàn)采用高通量測序、微生物多樣性檢測技術(shù)分析海鮮菇栽培料中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性,結(jié)果表明,共獲得52 192條序列,10 588個(gè)OTU數(shù);栽培料中共鑒定得到細(xì)菌菌落11個(gè)門、20個(gè)目、49個(gè)屬,栽培料中的優(yōu)勢菌群分別是變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、莫拉氏菌科、不動(dòng)桿菌屬,其相應(yīng)占比分別為92.71%、75.77%、69.76%、68.73%、66.30%,說明栽培料中菌群有較好的多樣性和豐度,對海鮮菇生長十分有利。

    須補(bǔ)充的是,本次試驗(yàn)中未檢出大腸桿菌,說明海鮮菇栽培料被糞便污染的可能性很小,存在腸道病原微生物的可能性微乎其微,這在一定程度上減少了不利菌群對栽培材料潛在的危害。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Bolormaa Z,Kang M G,Seo G S,et al. Analysis of nutritional characteristics and physiological functionality of Hypsizygus marmoreus(brown cultivar)[J]. The Korean Journal of Mycology,2012,40(2):104-108.

    [2]Mori K,Kobayashi C,Tomita T,et al. Antiatherosclerotic effect of the edible mushrooms Pleurotus eryngii(Erngi),Grifola frondosa(Maitake)and Hypsizygus marmoreus(Bunashimeji)in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Nutrition Research,2008,28(5):335-342.

    [3]Ikekawa T. Beneficial effects of mushrooms,edible and medicinal,on health care[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms,2001,3(2/3):79.

    [4]Sato S,Hirakawa H,Isobe S,et al. Sequence analysis of the genome of an oil-bearing tree,Jatropha curcas L.[J]. DNA Research,2011,18(1):65-76.

    [5]周月明,雷陽明,夏家?guī)?,? 農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥化進(jìn)程與纖維素類物質(zhì)降解研究[J]. 三峽生態(tài)環(huán)境監(jiān)測,2018,3(1):32-40.

    [6]萬水霞,郭熙盛,朱宏賦,等. 自然堆肥過程中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(28):13710-13711,13749.

    [7]季家舉,謝 元. 工廠化海鮮菇瓶栽技術(shù)研究[J]. 輕工科技,2018,34(2):7-8,24.

    [8]謝春芹,賈 君,凡軍民,等. 海鮮菇優(yōu)良菌株篩選和栽培營養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[J]. 中國食用菌,2017,36(1):10-13.

    [9]黃 亮,王 玉,班立桐,等. 海鮮菇工廠化瓶栽優(yōu)良菌株的篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(20):135-137.

    [10]Orsouw N J V,Hogers R C J,Janssen A,et al. Complexity reduction of polymorphic sequences (CRoPSTM):a novel approach for large-scale polymorphism discovery in complex genomes[J]. PLoS One,2007,11:e1172.

    [11]Argout X,Salse J,Aury J M,et al. The genome of Theobroma cacao[J]. Nature Genetics,2011,43(2):101-108.

    [12]Shulaev V,Sargent D J,Crowhurst R N,et al. The genome of woodland strawberry (Fragaria vesca)[J]. Nature Genetics,2011,43(2):109-116.[HJ1.9mm]

    [13]張 敏,張 艷,黃麗麗,等. 基于16S rDNA高通量測序方法比較新疆西北部地區(qū)乳品中微生物的多樣性[J]. 食品科學(xué),2017,38(20):27-33.

    [14]巫仁高. 海鮮菇工廠化袋栽制袋關(guān)鍵技術(shù)集成研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,31(2):140-144.

    [15]李淑榮,王 麗,倪淑君,等. 海鮮菇營養(yǎng)成分分析[J]. 食品工業(yè),2018,39(2):311-313.

    [16]劉建軍,朱愛蓮,金 力,等. 栽培瓶培養(yǎng)料理化性質(zhì)對真姬菇生長的影響[J]. 浙江食用菌,2009,17(4):49-51.

    [17]王鴻磊,王紅艷,宋俊芬,等. 雙孢菇培養(yǎng)料工廠化發(fā)酵過程中微生物及物質(zhì)變化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(1):94-96.

    [18]常路路,申進(jìn)文. 平菇培養(yǎng)料發(fā)酵過程理化因素及微生物變化研究[J]. 中國食用菌,2012,31(4):34-36.

    [19]王 琪. 蘆筍老莖栽培食用菌和培養(yǎng)料堆制過程中微生物多樣性的研究[D]. 太原:山西大學(xué),2012.

    [20]Peters S,Koschinsky S,Schwieger F,et al. Succession of microbial communities during hot composting as detected by PCR-single-strand-conformation polymorphism-based genetic profiles of small-subunit rRNA genes[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66(3):930-936.

    [21]王 勝. 一種沼澤紅假單胞菌腐解劑及其在鹽堿地秸稈腐熟改土中的應(yīng)用:CN105110823A[P]. 2015-12-02.

    [22]朱燕華,王 倩,宋曉霞,等. 基于稻、麥秸稈工廠化栽培雙孢蘑菇的理化性質(zhì)變化研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2017,33(7):86-91.

    [23]丁曉飛,丁立功,郭悠然,等. 一種具有纖維素降解能力的兼性厭氧的不動(dòng)桿菌及其應(yīng)用:CN106497834A[P]. 2017-03-15.

    收 稿日期:2019-02-26

    基金項(xiàng)目:江蘇省蘇州市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(編號:SNG2017066)。

    作者簡介:徐 兵(1982—),男,江蘇常熟人,碩士,實(shí)驗(yàn)師,從事微生物學(xué)研究。E-mail:xubing@cslg.cn。

    通信作者:冀 宏,博士,教授,從事食、藥用菌研究。E-mail:595827676@qq.com。

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