紅外光譜法測定奶粉中三聚氰胺和尿素

白靜，王會(huì)

1(河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州，450042)2(河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，河南 鄭州，450042)

三聚氰胺[C3N3(NH2)3],俗稱密胺，蛋白精，含氮量高達(dá)66.6%，白色無味，在水中微溶，價(jià)格低，具有低毒性，不能作為添加劑加入到食品中。但是有些不法商販作為“蛋白精”，加入飼料，奶制品，增加產(chǎn)品表現(xiàn)出的蛋白質(zhì)含量，冒充蛋白質(zhì)[1]。研究表明反復(fù)過量服用三聚氰胺會(huì)導(dǎo)致大頭、腎結(jié)石等多種疾病，危害人體健康[2]。

尿素又名脲，其水溶液呈中性，是有機(jī)氮肥中的一種。在乳及乳制品中摻雜尿素，可以增加乳中的氮含量，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)檢測含量和增加密度。尿素含量測定在乳制品行業(yè)中具有十分重要的地位，其在乳及乳制品中的含量應(yīng)低于0.70 mg/g[3]。而如果奶粉中的尿素含量超過正常范圍，也會(huì)導(dǎo)致潰瘍、癌癥、消化不良、胃酸、腎功能疾病等健康問題[2]。

目前國內(nèi)外在測定奶粉中三聚氰胺和尿素的含量有很多種，如熒光光譜法[4]、近紅外成像技術(shù)[5]、紅外光譜法[6]、拉曼光譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、高效液相色譜法[9]、利用非線性化學(xué)指紋圖譜法[10]、同位素稀釋質(zhì)譜法[11]等。國標(biāo)中規(guī)定測定奶粉中三聚氰胺和尿素的方法多采用滴定法和高效液相色譜法。

雖然這些方法測定奶粉中三聚氰胺和尿素的含量具有可行性，但是在其處理方面都有相應(yīng)的缺陷。拉曼光譜法、非線性化學(xué)指紋圖譜法、熒光光譜法檢測速度快但易受干擾因素影響，成本較高且操作復(fù)雜；同位素稀釋法雖然精密度高，檢出限低，但是對(duì)操作要求過高，不能進(jìn)行推廣研究。

紅外光譜法對(duì)樣品檢測無需進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，建立模型后樣品可在1 min內(nèi)完成檢測，對(duì)樣品基本無損耗；分辨率高，但是對(duì)于光譜掃描得到的數(shù)據(jù)龐大，不易分析，因此常將紅外光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行研究。

本文在研究紅外光譜在奶粉摻三聚氰胺和尿素的應(yīng)用中，結(jié)合二階最小二乘法使用誤差項(xiàng)不相關(guān)的工具變量來計(jì)算有問題的預(yù)測變量的估計(jì)值，然后通過計(jì)算值來估計(jì)因變量的線性回歸模型。與常規(guī)的一元線性回歸相比，該方法能對(duì)復(fù)雜關(guān)系分析其顯著性并能去除異常點(diǎn)增加線性擬合程度[12]，對(duì)于奶粉中三聚氰胺和尿素的監(jiān)控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與樣品

雀巢全家營養(yǎng)奶粉市場購買；三聚氰胺(純度≥99%)，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；尿素(純度≥99%)，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；KBr(色譜純，純度≥99%)，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

尼高麗紅外光譜儀Nicolet 380FT-IR，馭锘實(shí)業(yè)(上海)有限公司；分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；瑪瑙研缽，湖南力辰儀器有限公司。

1.2 紅外光譜測定參數(shù)

IR光源，波數(shù)4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1、掃描速度0.632 9 cm/s、掃描次數(shù)32次，掃描之前均需先采集空白背景，紅外光譜儀預(yù)熱30 min以消除外界環(huán)境的影響,提高光譜數(shù)據(jù)的有效信息量[13]。對(duì)光譜數(shù)據(jù)采用平均平滑法進(jìn)行預(yù)處理，選用平滑窗口大小為15，在此條件下能很好地去除各種因素產(chǎn)生的高頻噪聲。樣品數(shù)據(jù)光譜為3次掃描的平均值。每次壓片測量都需要將ZnSe 晶體、壓片螺母、瑪瑙研缽等用無水乙醇洗干凈、并置于日光燈下烤干，壓片應(yīng)該透過性好并無裂痕。

1.3 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品梯度制備

將稱量瓶洗干凈放入烘箱中烘干，用分析天平(精度0.000 1)稱取不同質(zhì)量分析純的三聚氰胺和溴化鉀，先將KBr置于研缽中研磨至粉末，再與三聚氰胺以逐步混勻法混勻，得到12個(gè)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的梯度含量，置于稱量瓶中標(biāo)記，并按照1.2光譜條件測定。

1.4 尿素標(biāo)準(zhǔn)品梯度制備

先將稱量瓶洗干凈放入烘箱烘干，稱取不同質(zhì)量分析純的尿素和KBr，分別將KBr和尿素置于研缽研磨，再將尿素和KBr按照逐步混勻法混勻，得到12個(gè)尿素標(biāo)準(zhǔn)樣品的梯度含量，置于稱量瓶中標(biāo)記，并按照1.2光譜條件測定。

1.5 樣品測定

稱取不同質(zhì)量的三聚氰胺和奶粉，按照逐步混勻法混合均勻，得到3個(gè)摻入三聚氰胺的奶粉偽樣品三聚氰胺含量分別的為2.018 1、4.995 9、8.291 6 g/100g，置于稱量瓶中標(biāo)記，并按照1.2光譜條件測定。同時(shí)依據(jù)GB/T22388—2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法中規(guī)定的高效液相色譜法對(duì)三聚氰胺進(jìn)行測定。

稱取不同質(zhì)量的尿素和奶粉，按照逐步混勻法混合均勻，得到3個(gè)摻入尿素的奶粉摻偽樣品，尿素含量分別為1.574 4、4.409 2、6.452 4 g/100g，置于稱量瓶中標(biāo)記，并按照1.2光譜條件測定。同時(shí)依據(jù)GB/T 21704—2008乳與乳制品中非蛋白質(zhì)含量測定中規(guī)定的滴定法對(duì)尿素進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 三聚氰胺特征吸收峰確定

圖1 三聚氰胺和奶粉紅外光譜疊加圖Fig.1 Melamine and milk powder infrared spectrum superposition

三聚氰胺和奶粉是物理混合，對(duì)樣品混合的12組三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2.2 尿素特征吸收峰確定

圖2 尿素和奶粉紅外光譜疊加圖Fig.2 Infrared spectrum superposition diagram of urea and milk powder

由于尿素和奶粉是物理混合，對(duì)樣品混合的12組尿素標(biāo)準(zhǔn)品掃描后的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

對(duì)比尿素和奶粉紅外光譜疊加圖可以看出,尿素在538、1 157、1 450、1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1處吸光度大，比較奶粉紅外光譜圖可知在1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1四個(gè)點(diǎn)處吸光度較弱，并且隨著尿素含量的增大，吸光度在此4個(gè)點(diǎn)逐漸增大，符合朗伯比爾定律，因此對(duì)這4處吸收峰進(jìn)行回歸分析，進(jìn)而進(jìn)一步確定最佳特征吸收峰進(jìn)行定量分析。

2.3 奶粉摻三聚氰胺模型建立及回歸分析

三聚氰胺特征吸收峰為732、1 551 cm-1，按照1.2光譜條件進(jìn)行的紅外光譜分析數(shù)據(jù)如表1所示。根據(jù)表1對(duì)三聚氰胺在732、1 551 cm-1處吸光度進(jìn)行定量分析，建立一元線性回歸方程后發(fā)現(xiàn)在732 cm-1線性相關(guān)性為0.930 3，在1 551 cm-1線性相關(guān)性為0.993 3，因此選取1 551 cm-1為三聚氰胺特征吸收峰。

由表1可知，三聚氰胺的含量和1 551 cm-1吸光度呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)關(guān)系，關(guān)系式如公式(1)所示：

Y=ax+b+c

(1)

式中：Y表示1 551 cm-1吸光度；x表示三聚氰胺的含量；c表示其他因素對(duì)吸光度的影響總和，比如KBr的質(zhì)量、或者奶粉樣品的品種、噪聲對(duì)吸收峰的影響等，一般認(rèn)為他們是相互獨(dú)立且服從正態(tài)分布的隨機(jī)變量。

表1 三聚氰胺特征吸收峰含量和吸光度Table 1 Characteristic absorption peak lontent and absorbance of melamine

通過SPSS軟件讀取表1中三聚氰胺含量(工具變量)，1 551 cm-1吸光度(因變量)，KBr質(zhì)量(解釋變量)進(jìn)行二階最小二乘分析同時(shí)繪制出三聚氰胺含量和1 551 cm-1吸光度的散點(diǎn)圖(圖3)，得到復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.999 0，ANOVA(方差分析)表格中統(tǒng)計(jì)檢定值F為11.456，sig(顯著性)為0.007,說明三聚氰胺含量對(duì)吸光度影響顯著(sig小于0.05說明回歸效應(yīng)顯著，回歸方程成立)，存在回歸關(guān)系；系數(shù)表格中雖然KBr質(zhì)量對(duì)應(yīng)sig為0.007，但是對(duì)應(yīng)統(tǒng)計(jì)檢定值t(發(fā)生幾率)為-3.385，說明溴化鉀質(zhì)量對(duì)三聚氰胺含量和吸光度無影響。

圖3 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品原始數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of original data of melamine standard

應(yīng)用SPSS進(jìn)行回歸分析得到回歸標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)計(jì)值和回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差圖如圖4，由圖4可以看出，大部分點(diǎn)殘差在-2～+2，說明回歸方程顯著，但是S3點(diǎn)回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差值在+2～+3，標(biāo)準(zhǔn)化殘差異常，因此應(yīng)該去除S3進(jìn)行建立線性模型，以三聚氰胺含量(g/100g)作為橫坐標(biāo)，以吸光度作為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)得y=0.219 7x+0.700 4，R2=0.999 2，檢出限為0.744 2～3.986 1 g/100g。

圖4 三聚氰胺回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差圖Fig.4 Melamine regression standardized residual plot

圖5 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品線性擬合圖Fig.5 Melamine standard linear fitting diagram

2.4 奶粉摻尿素模型建立及回歸分析

對(duì)尿素在1 628、1 655、3 350、3 418、3 470 cm-1四個(gè)特征吸收峰進(jìn)行定量分析，按照1.2光譜條件進(jìn)行的紅外光譜分析數(shù)據(jù)如表2所示，建立回歸方程后比較可得5個(gè)峰值線性相關(guān)度分別為0.872 1、0.909 2、0.774 9、0.856 7、0.856 5，因此選取1 655 cm-1作為奶粉摻加尿素的特征吸收峰進(jìn)行定量分析。

表2 尿素特征吸收峰和吸光度Table 2 Characteristic absorption peak and absorbance of urea

由表2可知，三聚氰胺的含量和1 551 cm-1吸光度呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)關(guān)系，關(guān)系式如公式(2)所示：

Y=ax+b+c

(2)

式中：Y表示1 551 cm-1吸光度；x表示三聚氰胺的含量；c表示其他因素對(duì)吸光度的影響總和，比如KBr的質(zhì)量、或者奶粉樣品的品種、噪聲對(duì)吸收峰的影響等，一般認(rèn)為他們是相互獨(dú)立且服從正態(tài)分布的隨機(jī)變量。

通過SPSS軟件讀取表1中尿素含量(解釋變量)，1 655 cm-1吸光度(因變量)，KBr質(zhì)量(工具變量)進(jìn)行最小二乘分析同時(shí)繪制出尿素含量和1 655 cm-1吸光度的散點(diǎn)圖(圖6)，得到復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.954，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)為0.999 3，ANOVA表格中sig為0.168，統(tǒng)計(jì)檢定值F為2.207，說明尿素含量和吸光度呈現(xiàn)線性正相關(guān)，表格中溴化鉀質(zhì)量對(duì)應(yīng)sig為0.68，說明KBr質(zhì)量對(duì)尿素含量無影響。

圖6 尿素標(biāo)準(zhǔn)品原始數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖Fig.6 Scatterplot of raw data for urea reference

應(yīng)用SPSS進(jìn)行回歸分析得到回歸標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)計(jì)值和回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差圖如圖7，由圖7可知，大部分點(diǎn)殘差在-2～+2，說明回歸方程顯著，但是N1點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化殘差值在+2～+3，因此去除N1進(jìn)行線性擬合建模，以尿素含量(g/100g)為橫坐標(biāo)，以1 655 cm-1吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)，為y=0.089 5x+0.390 8，R2=0.999 3，由于N1號(hào)樣品吸光度異常，故檢出限為0.042 5～1.729 0 g/100 g。

圖7 尿素回歸標(biāo)準(zhǔn)化殘差圖Fig.7 urea regression standardized residual plot

圖8 尿素標(biāo)準(zhǔn)品線性擬合圖Fig.8 A linear fitting diagram of urea standards

2.5 奶粉摻三聚氰胺精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

取高效液相色譜法測定摻偽含量為2.018 1 mg/100g樣品1份，按照1.2分析條件進(jìn)行紅外光譜測定，平行測定3次，再將三聚氰胺摻偽特征峰處吸光度代入各自回歸分析方程中進(jìn)行測定得出其摻偽含量計(jì)算絕對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度用絕對(duì)誤差表示，精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示[15]，計(jì)算結(jié)果如表3所示。

表3 三聚氰胺精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision test results of melamine

2.6 奶粉摻三聚氰胺結(jié)果計(jì)算及加標(biāo)回收率

將1.4配制的奶粉摻偽三聚氰胺梯度樣品S1、S2、S3，按照1.2光譜條件進(jìn)行分析，并將1 551 cm-1吸收峰帶入回歸方程中計(jì)算摻偽含量并計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表4所示。

表4 三聚氰胺加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of melamine spiked recovery rate

2.7 奶粉摻三聚氰胺重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取含量為2.018 1 g/100g三聚氰胺，在間隔1、3、5天對(duì)3個(gè)樣品按照1.2紅外光譜條件進(jìn)行測量，再將三聚氰胺摻偽1 551 cm-1處吸光度代入回歸分析方程中進(jìn)行測定得出其摻偽濃度計(jì)算精密度，結(jié)果如表5所示。

表5 三聚氰胺重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Reproducibility test results of melamine

2.8 奶粉摻尿素精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

取滴定法法測定摻偽含量為1.574 4 g/100g樣品1份，按照1.2分析條件進(jìn)行紅外光譜測定，平行測定3次，再將其特征峰處吸光度代入回歸分析方程中進(jìn)行測定得出其摻偽含量并計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度[16]，結(jié)果如表6所示。

表6 尿素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Precision test results of urea

2.9 奶粉摻尿素結(jié)果計(jì)算及加標(biāo)回收率

將配制的奶粉摻偽尿素梯度樣品按照1.2光譜條件進(jìn)行分析，并將1 655 cm-1吸收峰帶入回歸方程中計(jì)算摻偽濃度并計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表7所示。

表7 尿素加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Experimental results of urea standard addition recovery rate

2.10 奶粉摻尿素重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取尿素含量為1.574 4 g/100g摻偽樣品，在間隔1、3、5 d對(duì)樣品按照1.2紅外光譜條件進(jìn)行測量，再將尿素?fù)絺? 655 cm-1處吸光度代入尿素回歸分析方程中進(jìn)行測定得出其摻偽濃度計(jì)算精密度，結(jié)果如表8所示。

表8 尿素重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of urea reproducibility experiment

3 結(jié)論

通過奶粉和三聚氰胺和尿素紅外光譜圖官能團(tuán)分析，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度的三聚氰胺圖譜確定特征吸收峰，通過SPSS軟件回歸分析和最小二乘法優(yōu)化處理建立三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y=0.219 7x+0.700 4，線性相關(guān)性為0.999 2，最低檢出限為0.744 2 g/100g，精密度RSD=0.50%，重現(xiàn)性RSD=3.12%，回收率為100.21%。尿素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.089 5x+0.390 8，線性相關(guān)性為0.999 3，最低檢出限為0.042 5 g/100g，精密度RSD=1.56%，重現(xiàn)性RSD=3.51%，回收率為99.66%。結(jié)果表明，此方法與國標(biāo)法相比可以很好的用于奶粉中三聚氰胺和尿素的定量分析，實(shí)現(xiàn)三聚氰胺和尿素快速無損檢測。