暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖AHP分離純化和結構研究

伍燕，朱家豪，汪偉，申利群,3*

1(興義民族師范學院，貴州 興義，562400) 2(廣西民族大學 化學化工學院, 廣西 南寧，550006)3(廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室, 廣西 南寧，550006)

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)俗稱 “黑牛肝菌”，隸屬牛肝菌目(Boletales)小牛肝菌科(Boletinellaceae)脈柄牛肝菌屬(Phlebopus)[1]，在我國主要分布在云南、貴州、四川和西藏等地[2]，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體較大，口感脆嫩，味道鮮美，富含多種氨基酸、糖類、脂肪、萜類、甾類和維生素等成分，經(jīng)常食用可增強機體免疫力、改善機體微循環(huán)[3]。蘭茂(明朝)所著《滇南本草》對牛肝菌的藥用價值也有記載，稱其有“主治清熱解煩，樣血和平”功效[4]，牛肝菌既有很好的食用價值，也有多種藥用功效，經(jīng)濟價值高。

牛肝菌一般屬外生菌根菌，人工栽培難以獲得，但因暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的營養(yǎng)方式兼具腐生和共生特點，已能實現(xiàn)人工栽培。目前國內(nèi)外對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的報道主要集中在栽培技術及營養(yǎng)成分的研究上，如KUMLA等混合高粱、雨樹鋸末、真菌宿主溶液成功獲得了人工栽培子實體[5]，劉靜等已成功實現(xiàn)了暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的人工和半人工栽培，在鳳凰木、咖啡、茶樹和荔枝樹下栽培均獲得了成功，在云南西雙版納已實現(xiàn)了一定規(guī)模的人工種植。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌極高的經(jīng)濟價值，促使研究優(yōu)良菌株的篩選、菌株交配系、仿生栽培、菌株發(fā)生地的特點和土壤分析方面的報道較多[6-9]。隨著暗褐網(wǎng)柄牛肝菌人工栽培技術取得的進展，已形成研究牛肝菌的模式種，如曹旸等進行了全基因組測序[10]，并采用簡單重復重復序列(simple sequence repeat，SSR)標記技術對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的5個多肽位點開發(fā)了標記，構建了相應的SSR指紋圖譜[11]。牛肝菌含多種生物活性成分，具有多種生理功能[12]，如趙云霞等研究指出，黑牛肝菌多糖能有效提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低丙二醛含量，對急性酒精損傷小鼠的心臟和脾臟有一定保護作用[13]，真菌多糖是活性的物質(zhì)基礎，但對于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(黑牛肝)多糖的結構特征研究還未見報道，本研究對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的多糖進行了分離純化和結構表征，為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的多糖活性物質(zhì)研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)新鮮菌體，9月份采集于貴州興義，命名為XY9-2。

DEAE-纖維素52、Sephadex G-100，上海瑞永生物科技公司；717陰離子柱、Dextran、葡萄糖、鼠李糖、巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖(均為分析純)，索萊寶試劑公司；三氟乙酸、H2SO4、氯仿、正丁醇、無水乙醇等其他試劑(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52-2型，上海亞榮生化儀器公司；Bio-Rad PCR擴增儀、凝膠成像儀，美國伯樂公司；安捷倫1200高效液相色譜儀、自動進樣器、G1352A RID檢測器、7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5色譜柱和質(zhì)譜檢測器，安捷倫科技有限公司；真空冷凍干燥機LGJ-10，北京松源華興科技有限公司；VERTEX 70傅里葉變換顯微紅外/拉曼光譜儀，德國Bruker公司；ThermoScientific Multiskan FC酶標儀，美國賽默飛公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取和ITS鑒定

采集的牛肝菌取菌蓋和菌柄無菌連接處，液氮研磨，提取總DNA[14]，真菌ITS1和ITS4通用引物擴增ITS序列，電泳檢測后送上海生工測序。

1.3.2 粗多糖的提取和純化

新鮮子實體250 g按1∶1質(zhì)量比加ddH2O勻漿，沸水煮60 min，過濾后重復1次，合并2次濾液[15]。經(jīng)熱水浸提后的濾液按體積比4∶1加入氯化717陰離子柱，50 ℃、180 r/min振蕩，保持4 h脫色，脫色后按Sevag法脫蛋白；將脫色、脫蛋白后的粗糖提取液100 mL過DEAE-52纖維柱，分別用ddH2O和不同濃度NaCl(0.05、0.1、0.2和0.3 mol/L)洗脫柱子(流速2 mL/min)，用蒽酮-硫酸法檢測多糖濃度并收集管中多糖溶液，在紫外620 nm處檢測并繪制洗脫曲線；收集主要洗脫峰裝入3 500 MW透析袋，用ddH2O脫鹽(4 ℃透析48 h)；透析后用Sephadex G-100柱子進一步純化(ddH2O洗脫)，多糖溶液經(jīng)低溫冷凍干燥得到精制多糖。

1.3.3 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖紅外光譜

取1 mg暗褐網(wǎng)柄牛肝菌精制多糖，常規(guī)壓片后進行紅外掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.4 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖分子質(zhì)量

1.3.4.1 標準曲線的繪制

分別稱取適量的Dextran標準品，將其配制成質(zhì)量濃度3 g/L的對照品溶液，逐一進行HPLC檢測，根據(jù)標準糖分子質(zhì)量的保留時間(retention time，RT)繪制標準曲線，得出回歸方程。

1.3.4.2 樣品色譜條件

準確稱取一定量的樣品，用ddH2O配制成1 g/L 的溶液，Millipore 0.45 μm水系濾膜過濾，進樣檢測。TSKgel@G5000PWXL凝膠色譜柱，柱溫20 ℃，0.002 mol/L NaH2PO4為流動相，流速0.6 mL/min。

1.3.5 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖單糖成分及摩爾比

1.3.5.1 多糖水解及柱前衍化

取10 mg多糖樣品于梨形瓶中，加入2 mL 2 mol/L H2SO4，充入N2并在油浴鍋里100 ℃水解8 h，水解結束后用0.3 mol/L NaOH中和至中性，離心取上清液200 μL，依次加入100 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和100 μL 0.3 mol/L NaOH，70 ℃水浴60 min，冷卻后加入100 μL 0.3 mol/L 的HCl，混勻后加入1 mL CCl3萃取，離心取上清。重復3次，過0.22 μm水相濾膜備用。標準品同法處理。

1.3.5.2 色譜條件

流動相為0.05 mol/LV(磷酸鹽)∶V(乙腈)=82 ∶12)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為250 nm，柱溫為30 ℃。

1.3.6 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖甲基化

1.3.6.1 甲基化及解聚

取2 mg多糖樣品置于梨型瓶中，加入1 mL DMSO，溶解后加入0.6 mL 0.375 mol/L的NaOH-DMSO懸液，冰浴、緩慢滴加碘甲烷1 mL，混勻后加入3 mL水振蕩終止反應。加入3 mL氯仿萃取，離心取下層有機相，向氯仿相加入少量無水Na2SO4，充分混合以除去殘留的水分，過0.45 μm有機濾膜，收集濾液后用N2吹干。將已完全甲基化的樣品溶于3 mL 90%的甲酸溶液中，密塞，100 ℃解聚3 h，向反應瓶中加入3 mL甲醇，40 ℃下減壓濃縮蒸干，解聚完成。

1.3.6.2 水解及乙?；?/p>

加入3 mL 2 mol/L三氟乙酸，120 ℃下水解4 h，冷卻至室溫，加入0.5 mL甲醇于40 ℃下減壓旋干，徹底去除三氟乙酸。干燥后的樣品加入1 mL濃度為1.6 mol/L鹽酸羥胺溶液(鹽酸羥胺溶于吡啶中)，密閉且充分振蕩，置于90 ℃真空干燥箱中氧化30 min。冷卻至室溫，加入0.2 mL 1-甲基咪唑和1 mL乙酸酐充分振蕩混合均勻。密閉，置于90 ℃真空干燥箱中反應30 min，冷卻至室溫形成乙?；难苌?。加入1 mL的三氯甲烷和1 mL的水，混勻后靜置數(shù)分鐘待分層，去除上層水相，得到的氯仿層加入適量無水Na2SO4去除水分，過0.45 μm的有機系濾膜，置于進樣瓶中進行氣相色譜分析。

1.3.7 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖核磁共振

稱取5 mg多糖樣品溶于0.8 mL D2O中，并測定氫譜。

1.3.8 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖掃描電鏡鏡像

取少量真空干燥的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖樣品固定在樣品架上，真空鍍金，使樣品處于導電狀態(tài)，10 kV電壓下進行電鏡掃描。

2 結果與分析

2.1 子實體鑒定

新鮮子實體菌蓋肥厚，直徑可達4.5～26.0 cm；菌柄粗壯，基部膨大(4.2～9.1)cm×(3.3～6.0)cm，參照《中國真菌志》第22卷《牛肝菌科I》進行形態(tài)學鑒定[16]；圖1為基于ITS序列比對結果，在NCBI上Blast N顯示XY9-2與暗褐網(wǎng)柄牛肝菌HQ687223有100%同源性，經(jīng)過形態(tài)學和分子生物學鑒定，該野生子實體為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)。

圖1 基于ITS序列構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 NJ Phylogenetic tree based on ITS sequence

2.2 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖的分離純化

如圖2所示，粗多糖過DEAE-纖維素柱，不同濃度NaCl洗脫后得到3個組分，收集較多的組分I經(jīng)透析袋(3 500 Mw)透析后凍干，用ddH2O復溶后過葡聚糖G-100凝膠柱純化，ddH2O洗脫后根據(jù)洗脫曲線收集均一組分凍干，得到精制多糖AHP，如圖3所示。

圖2 AHP的DEAE-纖維素離子交換柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of AHP with DEAE-cellulose ion exchange column chromatography

圖3 AHP過凝膠柱G-100Fig.3 Elution curve of AHP with G-100 exchange column chromatography

2.3 紅外光譜分析

如圖4所示，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖具有明顯的多糖特征吸收峰，3 409.58 cm-1處較寬的峰是—OH伸縮振動峰，2 923.60 cm-1是糖C—H伸縮振動峰，1 650.79 cm-1是酰胺羰基鍵，1 461.64 cm-1是C—H變角振動峰，1 246.52 cm-1為非對稱的硫酸酯(S=O)伸縮振動特征峰，在1 138.66、1 064.76和1 038.07 cm-13處吸收峰是糖環(huán)上的C—O—C和C—O—H伸縮振動峰，表明存在D-吡喃環(huán)，964.15 cm-1是D-吡喃環(huán)非對稱環(huán)伸縮振動峰，816.30 cm-1是甘露糖吸收峰，762.36 cm-1是D-吡喃環(huán)對稱環(huán)伸縮振動峰[17-19]。紅外分析暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖AHP為吡喃糖，糖苷鍵類型為α構型。

圖4 AHP紅外圖譜Fig.4 Infrared spectroscopy of AHP

2.4 核磁光譜氫譜

核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance spectra，1H-NMR)主要用于表征糖苷鍵的構型[20]，如圖5所示，C1質(zhì)子化學位移位于δ 4.8～5.2 ppm，說明暗褐網(wǎng)柄牛肝菌含α型吡喃己糖，與紅外結果相符。在δ 1.25 ppm處為C—6位脫氧糖的甲基質(zhì)子信號峰。δ 3.5～4.25 ppm多個密集信號峰為不同糖殘基非異頭質(zhì)子的亞甲基和次甲基上的質(zhì)子共振峰交互重疊產(chǎn)生，表明暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖結構復雜。

圖5 AHP的1H-NMR圖譜Fig.5 1H-NMR spectroscopy of AHP

2.5 單糖組成

將多糖酸水解并衍生化后，在相同的高效液相色譜條件下進行單糖與混合單糖標準品比較，結果如圖6所示，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖組成，單糖摩爾比為1.54∶0.07∶0.25∶1.72∶0.96，甘露糖和半乳糖含量較多，與前面紅外分析一致。

圖6 AHP的高效液相水解色譜圖Fig.6 HPLC analysis of AHP polysaccharide hydrolysate

2.6 多糖純度及分子質(zhì)量測定

如圖7所示，高效凝膠滲透色譜(high performance gel-permeationchromatography,HPGPC)檢測暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖呈單一狹窄對稱峰，表明多糖AHP為均一組分，依據(jù)標準曲線得到回歸方程：lgMw=-0.411x+10.414，R2=0.997 5，在保留時間為14.86 min時，分子質(zhì)量為2.03×104Da。

圖7 AHP純度及HPGPC圖Fig.7 Distribution of purity and HPGPC of AHP

2.7 多糖甲基化分析

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chrmatography mass spectrometry，GC-MS)對甲基化的AHP糖苷鍵進行分析，結果如表1所示，AHP是雜多糖，存在9種連接方式：葡萄糖是→1,3)- Glcp連接，含量占20.56%；半乳糖主要是→1,6)- Galp，含量占32.71%；半乳糖還存在→1)- Galp，→1,3)- Galp殘基，占所有殘基的14.01%，其中→1)- Galp為非還原性末端基；其他巖藻糖和鼠李糖含量低，主要是→1,6)-Fucp和→1,3)- Rhap；甘露糖存在→1,2)- Manp，→1,6)- Manp和→2,4)- Manp 3種殘基，占所有殘基的27.68%；以上結果表明主鏈鍵型是1,3-或1,6-連接的多糖，單糖組成與前面HPGPC單糖組成分析一致。

表1 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖甲基化實驗結果Table 1 Methylation analysis data of P. portentosus polysaccharide

2.8 掃描電鏡分析

如圖8所示，掃描電鏡下觀察到暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖AHP以疏松多孔的網(wǎng)格狀為主，間隙分布有球狀和少量絲狀結構，在500倍電鏡下，可見大面積具長鏈的多分枝結構，分子間交叉相連，說明暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖的分子質(zhì)量較大；在2 000倍電鏡下可見網(wǎng)狀結構邊緣是光滑、平整的，說明分子間有相互作用力，能形成緊密而穩(wěn)定的結構。

a-500放大倍率；b-1 000放大倍率;c-2 000放大倍率圖8 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖AHP的SEM圖像Fig.8 SEM images of AHP polysaccharide

3 結論

從暗褐網(wǎng)柄牛肝菌中分離到的多糖AHP，色澤乳白，質(zhì)地較輕、能溶于水。精制多糖AHP的分子質(zhì)量為2.03×104Da，分子質(zhì)量較大對保證多糖的生理活性具有重要作用，水解后單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖，單糖摩爾比為1.54∶0.07∶0.25∶1.72∶0.96，真菌提取的多糖甘露糖含量相對較多，說明甘露糖對維持真菌多糖大分子結構有重要作用[21-33]。甲基化表明AHP主鏈結構復雜，鍵型有→1,6)- Galp半乳聚糖，占32.71%；→1,3)- Glcp葡聚糖占20.56%，→2,4)- Manp甘露聚糖占19.62%，此外還有→1,3)鼠李糖，→1,6)-巖藻糖和部分→1)、→1,3)半乳糖和少量→1,2)、→2,4)甘露糖形成的糖苷鍵，多糖中多位點連接在掃描電鏡下顯示出交錯而又致密的結構。本研究對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖進行了分離純化和結構表征，為進一步研究暗褐網(wǎng)柄牛肝菌多糖的活性奠定了理論基礎，也可為真菌多糖的衍生化研究提供依據(jù)。