等離子體處理對(duì)復(fù)合蛋白基成膜溶液性能的影響

高文婧，雷橋，2，3*，郄梓含，曹慶龍

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

乳清分離蛋白-酪蛋白酸鈉-甘油(whey protein isolate-sodium caseinate-glycerol，WPI-NaCas-GLY)復(fù)合蛋白薄膜作為一類(lèi)優(yōu)良的可食性薄膜，在食品的內(nèi)包裝方面，具備替代不可降解高分子聚合物PE等材料的潛力及優(yōu)勢(shì)[1]，尤其是其氣體阻隔性能達(dá)到49.92 cm3/(m2·d·0.1 MPa)，高于高阻氣性的PET塑料。此外，其基體改性的一級(jí)、二級(jí)空間也較大，具備優(yōu)良的遷移控釋性[2]，有望開(kāi)發(fā)出適合多類(lèi)食品包裝的薄膜。

然而，蛋白基薄膜作為生物極性聚合物，具有一定程度的親水性，相較于塑料等高分子聚合物，蛋白基薄膜具有較高的水溶性和水蒸氣透過(guò)率，因此，阻礙了其在高水分食品包裝及高濕環(huán)境中的應(yīng)用。成膜基質(zhì)的改性是提高蛋白基薄膜疏水性的重要手段，包括物理法和化學(xué)法等。采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化蛋白質(zhì)交聯(lián)，是其化學(xué)改性方法之一，能夠改善乳清蛋白濃縮物-羧甲基化殼聚糖薄膜的阻水性[3]；此外，添加羧甲基化殼聚糖、酪蛋白酸鈉、黃蓍膠等，同樣能夠達(dá)到改善蛋白基薄膜疏水性的效果[3-5]。相對(duì)而言，物理改性方法研究較少但也有效，如靜態(tài)超高壓處理成膜溶液的方法，能顯著降低抗菌復(fù)合蛋白膜的水蒸氣透過(guò)率，改善其疏水性[6]；介電屏障放電(dielectric barrier discharge, DBD)系統(tǒng)等離子處理，通過(guò)改進(jìn)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，也可提高薄膜的表面疏水性[7]。

等離子體(Plasma)技術(shù)是一種新興的非熱技術(shù)，它是利用含有離子、自由基、自由電子和中性物質(zhì)的氣相混合物在等離子體空間內(nèi)及聚合物-等離子體界面上誘發(fā)某些物理和化學(xué)反應(yīng)，以改變聚合物的性質(zhì)，Plasma與蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生的反應(yīng)包括氨基酸的二聚化、氧化、脫酰胺、硝化、磺化氧化、脫氫和/或羥基化等[8]。Plasma技術(shù)在包裝材料改性方面的研究顯示，Plasma處理玉米醇溶蛋白膜、凝膠膜和肌原纖維蛋白膜等，能夠有效改善薄膜疏水性、機(jī)械性能、結(jié)構(gòu)特性以及熱性能等[7，9-10]。然而，關(guān)于該技術(shù)是否會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生正面或負(fù)面影響的研究報(bào)道十分有限。在成膜溶液的Plasma處理方面，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，介電屏障放電系統(tǒng)等離子處理、大氣壓冷等離子體處理蛋白基溶液，能夠改善其保水性、溶解性、發(fā)泡和乳化能力[7,11]。

為了探索Plasma處理對(duì)成膜溶液的改性機(jī)制，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)疏水性的可食性薄膜，本研究在前期復(fù)合蛋白基薄膜的研究基礎(chǔ)上，探討了不同時(shí)長(zhǎng)的Plasma處理對(duì)WPI-NaCas-GLY成膜溶液色度、pH、粒度、表面張力、發(fā)泡性能、乳化能力的影響，并將其制備成膜研究了其機(jī)械性能、光學(xué)性能和阻隔性能的變化，以期研發(fā)滿足市場(chǎng)需求的新型綠色包裝材料，推動(dòng)可食性包裝薄膜的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展及應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乳清蛋白粉(蛋白質(zhì)>98%)，美國(guó)ISOPURE公司；酪蛋白酸鈉(蛋白>99.21%)，上海麥克林生化科技有限公司；丙三醇(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；環(huán)氧大豆油，上海麥克林生化科技有限公司；0.1% SDS十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液，福建領(lǐng)江生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

馬爾文MS3000激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司； Piezobrush PZ2等離子處理儀，德國(guó)RP plasma公司；U-3900紫外分光光度計(jì)，日本日立高新技術(shù)科學(xué)公司； CR-400色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)有限公司；T25數(shù)顯型高速分散機(jī)，德國(guó)艾卡公司；JC2000C接觸角測(cè)量?jī)x，上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司；OX-TRAN 2/2H型氧氣透過(guò)率測(cè)試儀，美國(guó)MOCON公司；PERMATRAN-W 1/50G型水蒸氣透過(guò)率測(cè)試儀,美國(guó)MOCON公司；XLW(EC)型智能電子拉力試驗(yàn)機(jī)，濟(jì)南藍(lán)光機(jī)電技術(shù)有限公司；WGT/S 透光率/霧度測(cè)定儀，上海精科儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 成膜溶液的制備及Plasma處理方法

稱(chēng)取6.84 g乳清分離蛋白粉以及5.11 g酪蛋白酸鈉，分別溶入100 mL去離子水中，于25 ℃恒溫磁力攪拌器攪拌1 h升溫至85 ℃攪拌30 min。待溶液靜置至室溫后，將兩者混合并且加入4.18 g甘油，將三者的混合物置于25 ℃磁力攪拌器攪拌1 h，再將溶液倒入抽濾瓶中進(jìn)行真空脫氣，制得蛋白質(zhì)溶液[12]。將成膜溶液均分成8組，用30 W Plasma等離子處理儀分別對(duì)溶液處理0、5、10、15、20、30、40、60 min。處理后，將樣品密封并在冷藏條件(4 ℃)下儲(chǔ)存12 h直至進(jìn)一步分析。

1.3.2 薄膜制備方法

將混合均勻的成膜溶液真空脫氣后，倒入平板中，置于65 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中5 h以烘干成膜。薄膜置于23 ℃、50% RH的恒溫恒濕箱中放置待測(cè)。

1.3.3 成膜溶液性能測(cè)試

1.3.3.1 色度

使用預(yù)校準(zhǔn)的L*，a*，b*比色計(jì)在離溶液1 cm處，測(cè)量其色度。顏色報(bào)告值為至少6次測(cè)量的平均值。使用描述黃色的b*參數(shù)來(lái)評(píng)估顏色的變化[11]。

1.3.3.2 pH值

使用pH計(jì)測(cè)量處理前后的成膜溶液和緩沖液的pH值，實(shí)驗(yàn)組重復(fù)6次，求其平均值[11]。

1.3.3.3 粒度

實(shí)驗(yàn)采用折射率為1.33的蒸餾水作為分散劑，測(cè)量過(guò)程在20 ℃下進(jìn)行。在樣品杯中裝入400 mL蒸餾水, 放置在馬爾文MS3000激光粒度儀進(jìn)樣器的正確位置，顆粒類(lèi)型為球形，折射率為1.4，吸收率設(shè)置為0.001，密度設(shè)置為1 g/cm3，加入混合均勻的測(cè)試樣品，在非超聲狀態(tài)下測(cè)量試樣[13]。每個(gè)樣品的測(cè)量次數(shù)設(shè)定為5次，每次測(cè)量時(shí)間為10 s，全部測(cè)試完成后取其平均值作為參考數(shù)據(jù)，使用累積方法找到溶液粒子的體積分布和顆粒的平均尺寸。

1.3.3.4 蛋白質(zhì)羰基的測(cè)定

蛋白質(zhì)羰基的量根據(jù)LEVINE等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。將2.4 mL的2,4-二硝基苯肼(在2 mol/L HCl中的量為10 mmol/L)添加至1.8 mL的蛋白質(zhì)溶液中。靜置60 min后，添加2.1 mL三氯乙酸(濃度10%)。將樣品在冰上孵育10 min后離心(12 000 r/min，3 min)。蛋白質(zhì)沉淀用6 mL乙醇和乙酸乙酯的混合物(體積比1∶1)洗滌3次，以去除過(guò)量的2,4-二硝基芊肼。將最終的沉淀溶解于3 mL的6 mol/L鹽酸胍中，使用紫外分光光度計(jì)記錄在370 nm處的吸光度。

1.3.3.5 游離巰基含量的測(cè)定

為了確定WPI樣品中游離巰基的濃度，使用了Ellman試劑(DTNB，5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))[15]。將0.5 mL的WPI樣品溶液添加到2.5 mL含8 mol/L尿素的三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸(Tris-Gly)緩沖液(10.4 g Tris，6.9 g Gly，1.2 g EDTA，pH 8.0)和0.02 mL Ellman's試劑(在Tris-Gly緩沖液中質(zhì)量濃度為4 mg /mL)中。避光靜置15 min后，使用紫外分光光度計(jì)在412 nm 處測(cè)量吸光度。游離巰基的濃度按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：SH，游離巰基濃度，μmol/g；A412，在412 nm的吸光度；C，WPI溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL；D，稀釋因子。

1.3.3.6 溶液表面張力

接觸角是指在氣、液、固三相的交界處作氣液界面與固液界面的切線，兩切線通過(guò)液體內(nèi)部所成的夾角θ即稱(chēng)為接觸角?？勺鳛楹饬恳后w對(duì)固體浸潤(rùn)能力的一個(gè)重要指標(biāo),是潤(rùn)濕程度的量度。實(shí)驗(yàn)采用懸滴法[16]，在恒溫恒濕的條件下，用接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定溶液的接觸角，再通過(guò)采用理論計(jì)算法獲得液體的表面張力。

根據(jù)Young’s 方程:

cosθα1=1+b(γc-γα1)

(2)

cosθα2=1+b(γc-γα2)

(3)

式中：θα1，成膜溶液在被測(cè)固體表面上的接觸角，°；θα2，蒸餾水在被測(cè)固體表面上的接觸角(93.2°，已知)，°；γc，固體表面的表面張力(承接材料為PE薄膜，表面張力為31.0 mN/m，已知)，mN/m；γα1，成膜溶液的表面張力，mN/m；γα2，蒸餾水的表面張力(72.02 mN/m，已知)，mN/m；b，系數(shù)。

實(shí)驗(yàn)中，將PE薄膜剪成4 cm×4 cm的平整塊狀放置于載玻片上；依次往薄膜上滴加不同的溶液樣品，測(cè)定其接觸角，每種溶液測(cè)試3次，取其平均值作為數(shù)據(jù)， 再由式(1)、式(2)推導(dǎo)出成膜溶液的表面張力。

1.3.3.7 發(fā)泡性

根據(jù)ONODENALORE[17]描述的方法評(píng)估溶液發(fā)泡能力。蛋白質(zhì)泡沫通常具有發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性。發(fā)泡能力是將空氣加入蛋白質(zhì)溶液的能力，可以通過(guò)測(cè)量泡沫體積的增加來(lái)確定。泡沫的穩(wěn)定性可以通過(guò)測(cè)量液體的排出速率或泡沫體積的下降速率來(lái)確定。使用均化器在燒杯中以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速將30 mL的成膜溶液均化2 min。根據(jù)公式(4)和公式(5)計(jì)算其發(fā)泡能力(foaming capacity，F(xiàn)C)和泡沫穩(wěn)定性(foaming stablity，F(xiàn)S)：

(4)

(5)

式中：VL，攪打前成膜溶液的體積，mL；VF0，攪打后立即(時(shí)間=0 min)測(cè)量的泡沫體積，mL；VF10，攪打后在室溫下靜置10 min后測(cè)量的泡沫體積，mL。

1.3.3.8 乳化性

實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究乳液的穩(wěn)定性來(lái)分析其乳化能力，乳液的穩(wěn)定性通過(guò)分光光度法進(jìn)行定量表征[18]。

在室溫下采用均質(zhì)機(jī)，將30 mL成膜溶液混合20%(體積分?jǐn)?shù))環(huán)氧大豆油在1 000 r/min下均質(zhì)2 min 制備乳狀液。之后使用1 g/L的SDS稀釋乳狀液體，獲得1∶500的最終稀釋度。將稀釋后的乳液立即注入比色皿中，在500 nm處進(jìn)行分光光度測(cè)定，并根據(jù)公式(6)計(jì)算其乳化活性指數(shù)(cmulsifying activityindex，EAI)：

(6)

1.3.4 薄膜性能測(cè)試

1.3.4.1 薄膜厚度測(cè)量

使用螺旋測(cè)微器測(cè)量膜的厚度，從每個(gè)薄膜樣品中在不同位置進(jìn)行5次測(cè)量，取平均值。

1.3.4.2 機(jī)械性能測(cè)試

用智能電子拉力試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行膜樣品的抗拉強(qiáng)度(tensile atregth，TS)和斷裂伸長(zhǎng)率(elongation at break，E)的測(cè)試[19]。將膜樣品裁成15 mm×50 mm的矩形，設(shè)置：初始夾持距離：50 mm，拉伸速度：500 mm/min。記錄薄膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率，每個(gè)樣品測(cè)試3次，取其平均值。

1.3.4.3 光學(xué)性能測(cè)試

使用透光率/霧度測(cè)定儀對(duì)薄膜樣品進(jìn)行透光率和霧度測(cè)定[20]。將膜裁成4 cm×4 cm的正方形大小，緊貼垂直放置于儀器夾具上，使光束垂直透過(guò)樣品膜。每個(gè)樣品測(cè)試3次，取其平均值。

1.3.4.4 透濕性能測(cè)試

根據(jù)ASTM E398[21]水蒸氣透過(guò)率測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)試。儀器參數(shù)設(shè)置：兩側(cè)相對(duì)濕度分別為10%和100%，測(cè)試溫度為37.8 ℃。水蒸氣透過(guò)系數(shù)(water vapor permeability，WVP)根據(jù)公式(7)計(jì)算:

(7)

式中：WVTR，水蒸氣透過(guò)率，%；n，樣品薄膜厚度，nm；Δp,氣體輸出壓力，0.20 MPa。

1.3.4.5 水溶性測(cè)試

使用RHIM[22]修改的方法測(cè)試薄膜水溶性(water solubility,WS)。將樣品切成30 mm×30 mm的小塊，在鼓風(fēng)干燥箱中于105 ℃干燥24 h后，記錄初始質(zhì)量W1(g)。干燥后，在室溫下，將薄膜置于50 mL蒸餾水中24 h。移出未溶解的薄膜樣品并于105 ℃下再次干燥，稱(chēng)量直至恒重(0.000 2 g)，最終質(zhì)量記為W2(g)。每個(gè)樣品測(cè)試均重復(fù)3次。薄膜水溶性(WS)根據(jù)公式(8)計(jì)算：

(8)

1.3.4.6 透氧性能測(cè)試

薄膜氧氣透過(guò)率參照GOUNGA[23]的方法進(jìn)行測(cè)試，通過(guò)氧氣滲透率測(cè)試儀測(cè)量對(duì)膜的氧氣滲透率。用樣品切割器將膜切成φ= 50 mm的樣品。在恒定溫度(23 ℃)下測(cè)定薄膜的透氧率(OTR)。將氣源的壓力調(diào)節(jié)至0.5 MPa。所選的薄膜不應(yīng)有物理?yè)p壞。每個(gè)樣品測(cè)試3次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白基成膜溶液特性變化

2.1.1 蛋白基成膜溶液的色度變化

成膜溶液顏色隨Plasma處理時(shí)間的變化如圖1所示，溶液黃色強(qiáng)度變化顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯顯示，膜液黃色強(qiáng)度的增加與處理時(shí)間正相關(guān)(P<0.05)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，b*值不斷上升。

圖1 溶液b*值的變化Fig.1 Change in b* value of solution注：不同小寫(xiě)字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

蛋白質(zhì)溶液中的氨基酸和還原糖之間有限的非酶促褐變反應(yīng)——美拉德反應(yīng)的早期產(chǎn)物，通常為弱黃色或無(wú)色，可導(dǎo)致膜液色澤的改變，然而，在4 ℃儲(chǔ)藏完成后，初始pH值為7.2的蛋白質(zhì)溶液中的乳糖含量可以忽略不計(jì)，該條件不利于發(fā)生美拉德反應(yīng)，因此非酶促褐變的影響作用不大。

2.1.2 pH值的變化

由圖2可知，Plasma處理后pH值先上升后下降，處理20 min后，成膜溶液pH開(kāi)始下降，并且有不斷下降的趨勢(shì)。

圖2 溶液pH值的變化Fig.2 Change in pH of solution

Plasma處理的前10 min，溶液pH值輕微上升。這可能是由于Plasma處理液體產(chǎn)生的活性氧和活性氮以及等離子體產(chǎn)生的電子與溶液中的大量水分碰撞形成的羥基，使得蛋白質(zhì)氧化，改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，產(chǎn)生游離的氨基，導(dǎo)致溶液pH上升[26]。

蛋白基成膜溶液的酸化可以解釋為亞硝酸(HNO2)和硝酸(HNO3)從NO到NO2的過(guò)程而導(dǎo)致的結(jié)果，以及離子通過(guò)水分子與過(guò)氧化氫(H2O2)在空氣或液體中反應(yīng)產(chǎn)生酸性H3O+[27-28]。除此之外，Plasma處理液體的酸度差異可能由若干因素引起，包括處理的體積、處理時(shí)間、緩沖能力、等離子體源和誘導(dǎo)劑氣體的類(lèi)型等。

2.1.3 粒度的變化

如圖3所示，D[4,3]、Dv(90)有明顯的差異與起伏(P<0.05)。

圖3 溶液的粒度變化Fig.3 Change in particle size of solution

與對(duì)照樣品相比，成膜溶液平均粒度的變化在Plasma處理5 min之內(nèi)時(shí)無(wú)顯著差異(P>0.05)。當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)10 min后，其顆粒尺寸和多分散指數(shù)都發(fā)生了變化，尺寸參數(shù)顯著提高，溶液中的大體積粒子的比例逐步上升這可能是由于成膜溶液中蛋白質(zhì)折疊展開(kāi)和蛋白質(zhì)間的網(wǎng)絡(luò)形成造成的。并且D[4,3]表示體積加權(quán)平均粒徑，此值對(duì)大顆粒存在敏感[13]，Dv(90)的數(shù)值隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增大，這與D[4，3]數(shù)值先平穩(wěn)后陡增的變化有所不同。等離子處理使得成膜溶液中的蛋白質(zhì)顆粒相互撞擊，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)并且相互連接，重聚形成了更大的蛋白質(zhì)粒子，此過(guò)程需要一定的時(shí)間積累，所以處理前期并無(wú)大幅變化。

2.1.4 蛋白質(zhì)羰基的變化

蛋白質(zhì)氧化可產(chǎn)生氨基酸殘基側(cè)鏈修飾和蛋白質(zhì)多肽主鏈變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)片段化、交聯(lián)、展開(kāi)和構(gòu)象變化。為了確定蛋白質(zhì)氧化的程度，采用測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)合的羰基的量來(lái)定量。

結(jié)果如圖4所示，Plasma處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基含量的大幅增加。未經(jīng)處理的成膜溶液含有少量羰基。Plasma處理后，羰基數(shù)值急劇增加；但是，延長(zhǎng)處理時(shí)間(30 min后)并未導(dǎo)致羰基含量的顯著增加(P>0.05)。

圖4 蛋白質(zhì)羰基的變化Fig.4 Change in protein carbonyl groups

羰基的形成可以歸因于許多氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾，尤其是通過(guò)亞氨基、氨基和肽鍵裂解修飾。此外，有研究表明，蛋白質(zhì)羰基的形成與溫度有關(guān)[29]。因此，Plasma中的反應(yīng)性物質(zhì)和溫度升高對(duì)蛋白質(zhì)的形成具有協(xié)同作用，使得羰基含量增加。

2.1.5 游離巰基的變化

含硫氨基酸側(cè)鏈極易被氧化，Plasma處理可以觸發(fā)巰基等氨基酸殘基側(cè)鏈的許多變化。圖5顯示了未經(jīng)Plasma處理和經(jīng)處理的成膜溶液中蛋白質(zhì)游離巰基的含量。結(jié)果表明，在處理的前幾分鐘內(nèi)巰基含量急劇降低，而在10～15 min之后下降速度變緩慢。這可以說(shuō)明Plasma處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸中巰基基團(tuán)的丟失。巰基基團(tuán)的減少可能是由于巰基被氧化為二硫鍵和不可逆地形成了磺酸衍生物[30]。

圖5 游離巰基的變化Fig.5 Change in free sulfhydryl groups

2.1.6 溶液表面張力的變化

圖6為蛋白質(zhì)溶液接觸角變化的影像圖。接觸角與表面張力之間為線性關(guān)系，接觸角越小，溶液的表面張力也就越低。

圖6 成膜溶液滴加在PE薄膜上的接觸角影像Fig.6 Contact angle image of solution with different treatment time on PE film

圖7 溶液表面張力的變化Fig.7 Change in surface tension of solution

計(jì)算獲得的表面張力數(shù)據(jù)如圖7所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Plasma處理的前5 min，膜液表面張力值有輕微的下降，并且在10～20 min時(shí)下降程度不顯著(P>0.05)。在5～10 min以及20 min之后的處理時(shí)間范圍，表面張力有明顯的下降(P<0.05)，其疏水性顯著提高。

成膜溶液中的酪蛋白酸鈉具有特殊的疏水性，有降低成膜溶液表面張力的作用。Plasma處理造成了蛋白質(zhì)在液體界面的吸附聚合，并通過(guò)分子間的相互作用在界面上形成連續(xù)的薄膜，從而賦予界面結(jié)構(gòu)剛性。蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散吸附的速率、分子間相互作用和堆積形成絡(luò)合物或結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化都是影響溶液表面張力的因素。

2.1.7 發(fā)泡性能的變化

如圖8所示， 在Plasma處理的前5 min，泡沫產(chǎn)生的能力顯著提升(P<0.05)，因該階段蛋白質(zhì)延展，構(gòu)象靈活，能夠分散吸附于空氣-水界面，形成泡沫。其展開(kāi)和部分表面變性涉及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾，膜液中分子重排以獲得最低的自由能構(gòu)象。然而，隨著Plasma處理時(shí)間的延長(zhǎng)，膜液的發(fā)泡能力有所下降，這可能是由于蛋白質(zhì)中聚集體的形成，在泡沫形成中產(chǎn)生了反作用。

圖8 溶液的發(fā)泡性能與泡沫穩(wěn)定性的變化Fig.8 Change in the foaming capacity and foaming stability of solution

蛋白質(zhì)吸附層的形成是泡沫形成及穩(wěn)定的關(guān)鍵[31]。為了形成吸附層，蛋白質(zhì)分子需要擴(kuò)散到空氣-水界面，并轉(zhuǎn)化為吸附狀態(tài)。蛋白質(zhì)更快地?cái)U(kuò)散和吸附到界面上，會(huì)產(chǎn)生更高的發(fā)泡能力。顆粒大小也是影響蛋白質(zhì)在空氣-水界面擴(kuò)散和吸附的重要因素，蛋白質(zhì)擴(kuò)散速率與粒徑呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合圖4可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液的粒度逐步增大，因而與之相對(duì)應(yīng)的發(fā)泡能力有降低的傾向。

同時(shí)，隨著Plasma處理時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液的泡沫穩(wěn)定性顯著提高(P<0.05)，發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性之間的變化趨勢(shì)相反。長(zhǎng)時(shí)間Plasma處理后增強(qiáng)的泡沫穩(wěn)定性可以通過(guò)蛋白質(zhì)的氧化和蛋白質(zhì)鏈之間的共價(jià)鍵的形成來(lái)解釋。界面表面彈性與泡沫穩(wěn)定性高度相關(guān)，高表面彈性使泡沫穩(wěn)定性得以改善，界面膜變得抗性更強(qiáng)并且構(gòu)成了抵御氣泡破裂和聚結(jié)的機(jī)械屏障。因此，Plasma處理導(dǎo)致的泡沫穩(wěn)定性提高，可能是蛋白質(zhì)聚集體形成的結(jié)果，蛋白質(zhì)由于強(qiáng)分子間交聯(lián)和高填充密度而產(chǎn)生高彈性的界面膜[32]，此結(jié)果與SEGAT等[11]研究的結(jié)果一致。

2.1.8 乳化性能的變化

Plasma處理前期，乳液穩(wěn)定性無(wú)較大變化(圖9)，處理10 min后，EAI值顯著上升(P<0.05)，表明乳液的穩(wěn)定性逐步增強(qiáng)，蛋白質(zhì)溶液的乳化性能逐漸提高，并且該曲線與溶液發(fā)泡穩(wěn)定性曲線存在較強(qiáng)的相關(guān)性。而隨著處理時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)(20 min后)EAI值呈下降趨勢(shì)。

圖9 溶液EAI值的變化Fig.9 Change in EAI values of solution

Plasma處理期間乳化能力的提高，是蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)暴露引起的表面疏水性的增強(qiáng)的結(jié)果。蛋白質(zhì)包含親水和疏水氨基酸殘基，后者通常隱藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部區(qū)域，而前者殘基位于表面。由于疏水性氨基酸在蛋白質(zhì)表面的暴露，表面疏水性提高。研究發(fā)現(xiàn)氧化是影響蛋白質(zhì)表面疏水性的重要因素，蛋白質(zhì)被氧化后，埋藏的疏水性氨基酸在表面展露，Plasma處理過(guò)程中產(chǎn)生的活性自由基會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化[33]，從而提高了蛋白質(zhì)表面的疏水性。此外，蛋白基成膜溶液中存在的大量水分子與等離子體產(chǎn)生的電子碰撞形成羥基自由基[34]，也造成了蛋白質(zhì)的氧化。

Plasma處理超過(guò)20 min后乳化能力降低，可以解釋為由于嚴(yán)重氧化而在氨基酸鏈之間形成聚集體，導(dǎo)致乳化能力下降。在輕度至中度氧化速率(羰基含量較低)下可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分展開(kāi)和變性，進(jìn)而可能提高乳化能力。而在較高的氧化速率(羰基含量較高)下，聚集體的形成可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能受損[35]。

此外，成膜溶液中的乳清蛋白和甘油單酯被吸附到油-水界面上，其相互作用也影響了乳液的物理化學(xué)性質(zhì)、乳液的穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。成膜溶液中的酪蛋白酸鈉是一種食品級(jí)的乳化劑，在油-水界面提供了良好的物理屏障，抑制了促氧化劑由水相滲透到油相，也進(jìn)一步改善了乳液的物理和氧化穩(wěn)定性。

2.2 蛋白基薄膜性能變化

2.2.1 機(jī)械性能的變化

由圖10可知，5 min處理組的抗拉強(qiáng)度減小，斷裂伸長(zhǎng)率增大，而長(zhǎng)時(shí)間(10 min后)對(duì)成膜溶液的Plasma處理顯著增加了薄膜的抗拉強(qiáng)度，降低了薄膜的斷裂伸長(zhǎng)率(P<0.05)。

可食用薄膜的結(jié)構(gòu)會(huì)影響其對(duì)等離子處理的結(jié)果。短時(shí)間的處理使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，降低了其結(jié)構(gòu)的抗性，而長(zhǎng)時(shí)間的處理會(huì)聚集蛋白質(zhì)分子。乳清分離蛋白由不同的必需氨基酸組成，例如纈氨酸、異亮氨酸和半胱氨酸，因此，巰基是聚合物中分子二硫鍵突出的主要基團(tuán)。游離巰基的減少表明形成了交聯(lián)的二硫鍵，從而增加了蛋白質(zhì)的聚集，與完整蛋白質(zhì)相比，蛋白質(zhì)聚集體的柔韌性較低，并且構(gòu)象穩(wěn)定性更高。因此蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的聚合和交聯(lián)可以被認(rèn)為是提高膜的拉伸強(qiáng)度以及降低薄膜斷裂伸長(zhǎng)率的重要因素[7]。

圖10 薄膜抗拉強(qiáng)度(TS)和斷裂伸長(zhǎng)率(E)的變化Fig.10 Change in tensile strength(TS)and elongation at break(E)of film

2.2.2 光學(xué)性能的變化

由表1可知，Plasma處理組制得薄膜的透光率有所降低，霧度上升。產(chǎn)生這一結(jié)果可能是由于隨著處理時(shí)間的增加蛋白質(zhì)分子顆粒尺寸變大(粒徑增長(zhǎng)至原來(lái)的2倍)，并且聚集的大分子蛋白質(zhì)增加了光散射，降低了薄膜的透光率，提高了霧度。

表1 薄膜透光率及霧度的變化Table 1 Change in light transmittance and haze of film

注：同一列不同小寫(xiě)字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

2.2.3 透濕性能和水溶性的變化

如圖11所示，Plasma處理后的成膜溶液所制備的復(fù)合薄膜，其水蒸氣透過(guò)系數(shù)以及水溶性顯著降低(P<0.05)。由此可以看出，Plasma處理成膜溶液具有降低薄膜水蒸氣滲透性和水溶性的能力，這可能是由于處理過(guò)程中羥基自由基與其他反應(yīng)性物質(zhì)的形成，使得肽和二硫鍵裂解氧化了氨基酸鏈，產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)。此外表面水分減少以及蛋白質(zhì)序列中氨基酸的疏水位點(diǎn)的暴露也使得薄膜降低了對(duì)水的敏感性[36]。

圖11 薄膜水蒸氣透過(guò)系數(shù)(WVP)的變化Fig.11 Change in water vapor permeability(WVP)of film

2.2.4 透氧性能的變化

如圖12所示，當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)15 min時(shí)，制得薄膜的氧氣透過(guò)率開(kāi)始顯著下降(P<0.05)，在Plasma處理60 min成膜溶液之后，制備所得的薄膜的氧氣透過(guò)率降低至0.53 cc/(m2·d)，相比于未處理組，其氧氣透過(guò)率降低了一半。Plasma處理后蛋白質(zhì)的交聯(lián)是改善蛋白基薄膜的氧氣阻隔性能的主要原因，聚合物鏈之間的交聯(lián)量的增加導(dǎo)致聚合物鏈之間的自由體積減小，因此，氧分子的擴(kuò)散減少[37]。

圖12 薄膜氧氣透過(guò)率的變化Fig.12 Change in oxygen transmission rate of film

3 結(jié)論

Plasma處理對(duì)WPI-NaCas-GLY成膜溶液的性能有顯著影響作用。研究結(jié)果顯示，在Plasma處理過(guò)程中，臭氧和其他活性氧以及氮物質(zhì)的形成使得成膜溶液黃度有所增強(qiáng)，與此同時(shí)由于他們的作用，成膜溶液pH值呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，顯示其在處理中逐步酸化。延長(zhǎng)Plasma處理時(shí)間，成膜溶液中蛋白質(zhì)羰基不斷增加，游離巰基不斷減少，蛋白質(zhì)氧化程度加深，溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)并重聚形成大尺寸的蛋白質(zhì)粒子，隨著蛋白質(zhì)顆粒的擴(kuò)散與吸附，蛋白質(zhì)聚合體形成，使得單位面積油-水界面上的蛋白質(zhì)聚合物增加，降低了其界面表面張力，溶液發(fā)泡能力下降，此外，溶液中蛋白質(zhì)的聚集和氧化使溶液泡沫穩(wěn)定性得以顯著提升(P<0.05)，在Plasma處理20 min時(shí)，溶液乳化能力表現(xiàn)為最佳。

經(jīng)Plasma處理后的成膜溶液制備所得WPI-NaCas-GLY復(fù)合膜擁有相對(duì)較高的抗拉強(qiáng)度、較低的斷裂伸長(zhǎng)率以及透光率，其氧氣透過(guò)率、水蒸氣透過(guò)率以及水溶性均有所降低。由此得出，利用Plasma對(duì)復(fù)合蛋白基成膜溶液進(jìn)行適時(shí)處理，能夠有效改善成膜溶液的疏水性、發(fā)泡性和乳化能力，并得到機(jī)械性能較強(qiáng)、阻隔性良好的復(fù)合蛋白膜。