不同分子質量魔芋甘露聚糖的制備及功效活性分析

董振香，顧秋亞，李丹晨，孫馳翔，余曉斌

(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

魔芋作為食品和傳統(tǒng)藥材在中國，日本，東南亞廣泛種植。魔芋中75%的水溶性纖維多糖是魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan, KGM)，一般認為，魔芋葡甘露聚糖是由β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖以1∶1.69或1∶1.6 的比例通過β-1,4糖苷鍵鏈接而成相對分子質量在20萬～200萬的復合多糖[1-2]。KGM及其衍生物不能被人類腸道上表皮細胞的酶直接水解，因此KGM被認為是難消化的食用纖維[3]。天然魔芋膠分子質量過大，黏度高、溶解度小，使得KGM 的應用受到了限制，所以將天然 KGM 降解成魔芋低聚糖的研究成為熱點。

魔芋低聚糖(konjac oligosaccharides, KOGM)是指通過酶解、酸解、輻射等方法使天然魔芋葡甘露聚糖降解而得到的2～10個單糖單位組成的功能性低聚糖[4]。研究表明魔芋低聚糖具有促進腸道有益菌的增殖[5-6]；抑制淀粉老化，清除自由基，抑制致病菌的生長[7]；保持腸道菌群平衡，改善腸道功能，保持腸黏膜緊密完整，提高機體免疫[8]；減少盲腸內游離氨的含量[9]；降低膽固醇[10]；預防和治療痤瘡等功效[11]。

不同分子質量魔芋低聚糖具有的不同結構和功效，侯占偉等[12]對不同分子質量的魔芋甘露聚糖黃酰化證明分子質量在10 kDa～30 kDa時抗凝血性，抗腫瘤，抑菌效果最好；YOSHIMURA等[13]研究表明2.56×105，4.38×105，4.44×105，9.6×105四種不同分子質量KOGM相同條件下分子質量越大凝膠速度越快且凝膠的彈性模量和儲能模量越大；陳琴音等[14]利用纖維素酶和半纖維素酶酶解，經處理后得到分子質量為2 kDa～3 kDa(藥用特定分子質量)的魔芋低聚糖；SONG等[15]乙?；幚砻附夂蟮哪в蟮途厶遣⑼ㄟ^硅膠柱分離純化后去乙?；玫礁事短?葡萄糖-半乳糖，摩爾比為2∶1∶1的甘露三糖，對其進行ACE抑制活性試驗表明，P3對ACE也具有一定的抑制活性。目前少有報道單一聚合度功效差異比較，因此，探究不同分子質量魔芋葡甘露聚糖的抗氧化活性以及對腸道有益菌的促進生長作用具有重要意義，為特異性切割特定功能低聚糖提供指導作用。

本實驗采用自主構建的畢赤酵母產耐高溫β-甘露聚糖酶對魔芋膠進行水解，通過控制水解條件得到低聚糖最高水解率為43.56%的樣品，采用透析，超濾等分離技術得到不同分子質量KGM樣品。比較不同分子質量KGM功能性差異。采用ORAC法比較不同樣品抗氧化活性，并進行6種乳酸菌發(fā)酵實驗，測定乳酸菌生長過程的延滯期和ΔOD以及發(fā)酵結束后產乳機酸含量。為進一步探究乳酸菌對魔芋低聚糖的代謝利用機制以及特異性切割功能性聚合度益生元糖苷酶的改造奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和試劑

畢赤酵母工程菌GS115/Auman26A，由作者所在實驗室構建并保藏；乳酸菌L.acidophilus，L.rhamnosus，L.bulgaricus，P.acidilactici,E.lactis,E.faecium由作者實驗室實驗室提供；魔芋粉，購自武漢靖江魔芋制品有限公司；D-甘露糖、 瓜兒豆膠，購自阿拉丁；蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，葡萄糖，CH3COONa、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、 CaCO3、正丁醇、檸檬酸氫二銨、乙酸、 3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、Na2SO3、NaOH等，分析純，購自上海國藥集團；透析袋，上海橋星貿易有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉浸取物10.0，酵母提取液5.0，葡萄糖5.0，CH3COONa 5.0，檸檬酸氫二銨2.0，吐溫80 1.0， K2HPO42.0， MgSO4· 7H2O 0.2， MnSO4·7H2O 0.05， pH 6.2～6.4，sMRS培養(yǎng)基為不添加碳源MRS培養(yǎng)基。

1.3 儀器與設備

G180T滅菌鍋，美國致微儀器有限公司；高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；酶標儀，美國BioTek公司；Agilent-1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 魔芋膠溶液的制備[16]：

取1.00 g魔芋膠溶于100 mL pH 5.5的乙酸鈉緩沖液，25 ℃ 500 r/min 條件下磁力攪拌30 min，制成魔芋膠溶解液KGM樣品。

1.4.2 魔芋酶解液樣品的制備

1.4.2.1 魔芋膠的酶解[17]

用重組畢赤酵母菌產甘露聚糖酶水解魔芋膠得到魔芋低聚糖?？刂泼附鈼l件為：底物質量濃度20 g/L，酶添加量90 U/mL，pH 5.5，45 ℃條件下水解，每隔10 min取樣立即煮沸，10 000 r/min 離心10 min，取上清用DNS法測定還原糖的含量并計算水解率。

1.4.2.2 酶解產物的定性和定量分析

隨著酶解時間的加長，水解程度越來越高，得到具有不同水解度的樣品。通過薄層層析法對酶解產物進行定性半定量檢測。展開劑：V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)= 4∶4∶3，顯色劑：Orcinol， 115 ℃下顯色5 min[18]。樣品經0.2 kDa透析袋處理24 h除去樣品中單糖，通過高效液相色譜法進行水解液成分的定量分析，色譜條件為色譜柱：Agilent ZORBAX-NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：V(乙腈)∶V(水)=65∶35； 流速：1 mL/min； 柱溫：35 ℃； 進樣量：15 μL; 檢測器：RID檢測器[19]。

1.4.2.3 不同分子質量KGM樣品制備

樣品經0.2 kDa透析袋處理24 h除去樣品中單糖和小分子鹽得到樣品KOGMI，KOGMI經5 kDa超濾管離心得到相對分子質量大于5 000的截留樣品KOGMII以及分子質量小于5 000的透過液，透過液經3 kDa超濾管超濾得到樣品分子質量為3 000～5 000的截留樣品KOGMIII，以及小于3 000的透過樣品KOGMIV，將各樣品濃縮后凍干保存。

1.4.3 魔芋膠水解液的相對分子質量(MW)分布

取凍干保存的樣品用水復溶配成2 mg/mL樣品溶液，樣品過0.22 μm濾膜，高效液相法檢測樣品的各分子質量分布。色譜條件為色譜柱：Waters UltrahydrogelTMLlnear (7.8 mm×300 mm)；流動相：0.1 mol/L NaNO3溶液；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長250 nm。

1.4.4 不同聚合度魔芋低聚糖功能性差異

1.4.4.1 ORAC法測定抗氧化活性

使用氧自由基吸收能力-熒光素(ORAC-FL)測試估計總抗氧化能力，向96孔(黑)板各孔加入25 μL空白(PBS)和不同濃度(3.125、6.250、12.50、25、50、75 μmol/L)Trolox標準溶液，樣品用75 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋適當倍數，每孔加入150 μL FL(4×10-3mmol/L)溶液，37 ℃ 孵育10 min，然后迅速向每個孔中加入25 μL AAPH(153 mmol/L)?？刂萍ぐl(fā)波長485 nm和發(fā)射波長535 nm進行連續(xù)測定，每90 s測定1次各孔熒光強度，測定時間一般設定在熒光衰減呈基線后為止，約91次循環(huán)[20]。根據Trolox標準曲線方程，計算各樣品以Trolox當量(TE)計的自由基吸收能力，結果以μmol TE/g表示。測定結果以ORAC值表示，得到所有數據經Excel軟件處理，計算各樣品ORAC值。[21]

計算如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：f0，第1次熒光讀數；fi，第i次熒光讀數；AUC0，空白液熒光衰減下的面積；AUC1，Trolox標準液熒光衰減下的面積；AUC2，樣品熒光衰減下的面積；CTrolox，Trolox標準液的摩爾濃度，μmol/L；C樣，樣品質量濃度，mg/mL。

1.4.4.2 乳酸菌菌體生長曲線的測定[16]

將細菌菌株從冷凍原液(20%甘油，體積分數)中接種到MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃厭氧生長12 h。將1%(體積分數)接種量接種至3 mL含10 g/L葡萄糖的sMRS(s MRS不含碳源培養(yǎng)基)肉湯中，并在37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜。當生物量OD600=0.8時，取2 mL菌液于離心管中12 000 r/min 離心5 min，用1 mL pH 7.4的PBS(磷酸鹽)緩沖液重懸12 000 r/min，5 min離心洗滌2次。將PBS洗滌過的菌球用2 mL sMRS培養(yǎng)基重懸。

分別吸取125 μL重懸菌液于無菌潔凈的96孔板中，加入125 μL 2%糖樣品作為唯一碳源供乳酸菌菌體生長并向孔內添加50 μL無菌礦物油，將孔板放置37 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，每隔30 min測量乳酸菌OD600，每次測量前添加板振蕩30 s，每種碳水化合物進行3個獨立重復實驗。

1.4.4.3 乳酸菌產有機酸的測定

將乳酸菌發(fā)酵48 h培養(yǎng)液于12 000 r/min，5 min離心獲得上清，準確吸取2 mL發(fā)酵液上清，分別加入800 μL硫酸鋅(300 g/L)和800 μL亞鐵氰化鉀(106 g/L)，振蕩混勻，離心。上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾后通過HPLC檢測，檢測條件為色譜柱：Waters Atlantis T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：20 mmol/L NaH2PO4，用磷酸調pH=2.7；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：210 nm。

2 結果與分析

2.1 魔芋膠的酶解

控制底物質量濃度20 g/L，酶添加量90 U/mL，pH 5.5，45 ℃反應條件下每隔10 min取樣，樣品水解率隨時間變化如圖1所示，在0～50 min酶解反應迅速，隨著反應時間的延長樣品水解率不斷增大，在50～70 min水解率變化趨于平穩(wěn)，其中酶解反應50 min時樣品水解程度達到44.26%。

圖1 魔芋膠水解率隨時間的變化曲線Fig.1 The curve of the degree of hydrolysis of konjac gum with time

2.2 魔芋膠水解產物的定性定量分析

不同水解時間酶解產物進行TLC檢測，結果如圖2所示。隨反應不斷進行，魔芋膠水解率不斷增加，高聚合度糖在不斷減少，低聚合度三糖二糖單糖的含量在不斷增加，且水解后存在G-G，M-M，M-G，M-M-M，M-G-G，M-M-G等多種不同聚合形式的單糖聚合體。對水解樣品經過透析和超濾分離后經HPLC檢測結果如圖3所示。水解60 min后各聚合度低聚糖分布均勻，二糖含量23.65%，三糖27.76%，四糖28.08%，五糖11.72%，六糖8.79%，選用酶解60 min水解率為43.56%的樣品進行后續(xù)的樣品準備分析。

圖2 不同水解時間酶解產物的TLC圖Fig.2 TLC diagram of enzymatic hydrolysis products at different hydrolysis times

圖3 酶解產物組分的 HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of enzymatic product components

2.3 酶解產物樣品聚合度分析

目前報道的KGM重均分子質量在1×104～2×106[22]，通過酶解超聲等方式可以降低KGM的分子質量[23]。本實驗用不同分離方法得到KOGM樣品的GPC譜圖如圖4所示，從上到下依次為KGM，KOGMI， KOGMII，KOGMIII，KOGMIV。

圖4 不同KOGM樣品GPC譜圖Fig.4 GPC spectra of different KOGM samples

樣品的Mn，Mw及PDI如表1所示，酶解后魔芋膠分子質量大幅度降低，相對分子質量為1 306，經3 kDa超濾管超濾得到樣品KOGMIV相對分子質量最低為787，因此β-甘露聚糖酶水解KGM后超濾處理可快速有效地得到不同分子質量聚合的魔芋甘露聚糖樣品。

表1 凝膠滲透色譜法(GPC)測定魔芋樣品的相對分子質量Table 1 Relative molecular weights of konjac samples as determined by gel permeation chromatography(GPC)

2.4 不同分子質量KOGM功能性分析

2.4.1 ORAC法測定抗氧化活性

以Trolox濃度為橫坐標，凈面積為縱坐標計算并繪制Trolox標準溶液標準曲線，曲線方程y=0.262 7x+22.134，R2=0.998 1。ORAC法測定不同分子質量KOGM的抗氧化活性(n=6)如表2所示，同一濃度條件下，KOGMIII樣品(1.033 3 mg/mL)ORAC值最高，為870.303 7 μmol Trolox當量/g，水解后的魔芋低聚糖均具有一定的抗氧化活性，其中相對分子質量在3 000～5 000 KOGMIII抗氧化活性最高，是甘露糖的58.2倍，是葡萄糖的95.93倍。

2.4.2 酶解產物的乳酸菌生長發(fā)酵

實驗選取實驗室保藏的6株微生態(tài)飼料添加有益乳酸菌為實驗對象以不同糖樣品為唯一碳源進行發(fā)酵，以葡萄糖、甘露糖、菊粉、KGM作為對照，5種不同分子質量魔芋低聚糖為實驗樣品進行乳酸菌發(fā)酵，生長情況如圖5所示。由圖5-A得出除L.bulgaricus外，菌體代謝利用低聚糖樣品的速度相比代謝葡萄糖略慢。但圖5-B和圖5-C顯示，菌體代謝低聚糖使得菌體對數生長期延長，且菌體利用低聚糖樣品最終生物量ΔOD普遍高于代謝利用葡萄糖、甘露糖單糖，且KOGMIV的樣品促進生長作用最明顯。高效液相檢測發(fā)酵液中乳酸的含量，如圖6所示，乳酸菌發(fā)酵KOGMIV發(fā)酵結束后產乳酸含量最高。

表2 ORAC法測定不同分子量KOGM的抗氧化活性(n=6)Table 2 ORAC method for determination of antioxidant activity of different molecular weight KOGM (n=6)

A-乳酸菌生長延滯期；B-乳酸菌生長對數期；C-乳酸菌正常ΔOD圖5 六種乳酸菌發(fā)酵不同魔芋甘露聚糖樣品(n=3)Fig.5 Growth of different konjac mannan samples fermented by six types of lactic acid bacteria

圖6 六種乳酸菌發(fā)酵不同樣品生成乳酸的含量Fig.6 Contents of lactic acid produced by fermentation of six lactic acid bacteria in different samples

3 結論

魔芋甘露聚糖可以通過物理法化學法以及酶法水解制成不同分子質量聚合度的低聚糖[24]，然而不同方法得到的不同聚合度低聚糖結構和功效差異性較大[25]。因此本實驗旨在探究酶法制備的不同分子質量魔芋甘露聚糖抗氧化活性以及對乳酸菌促進作用的差異。利用實驗室自主構建保藏的畢赤酵母菌產β-甘露聚糖酶酶解魔芋甘露聚糖，控制水解條件為：底物質量濃度20 g/L，酶添加量90 U/mL，pH 5.5，45 ℃條件下水解60 min得到水解率為43.56%的樣品，經過除單糖以及不同孔徑超濾處理得到不同相對分子質量的樣品。對得到的樣品進行抗氧化能力分析以及6種飼料添加有益乳酸菌發(fā)酵實驗，結果顯示相對分子質量在3 000～5 000時魔芋甘露低聚糖抗氧化活性最高，6種乳酸菌均能利用魔芋甘露低聚糖作為唯一碳源進行生長代謝，且相對分子質量為787的低聚糖對乳酸菌促進生長效果最為顯著，且發(fā)酵結束后乳酸含量最高。為探究乳酸菌代謝魔芋低聚糖途徑以及定向切割特定聚合度低聚糖酶的改造提供依據。