基于納米材料改良酶聯(lián)免疫吸附法的研究進(jìn)展

張光胤 - 魯 迨 鄧放明 - 趙 倩 石星波 -

(1.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)是一種基于抗原與抗體的特異性相結(jié)合，以及酶催化反應(yīng)建立的方法，通過(guò)酶與抗體或抗原偶聯(lián)形成酶偶聯(lián)物，當(dāng)抗原與抗體特異結(jié)合時(shí)，酶偶聯(lián)物催化無(wú)色底物分子轉(zhuǎn)化為易于檢測(cè)的產(chǎn)物(例如有色產(chǎn)物)[1]。通過(guò)底物信號(hào)的變化可以判斷免疫反應(yīng)是否發(fā)生，進(jìn)而分析目標(biāo)物(抗原、抗體)的濃度[2]。由于操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低，高速通量且可以目測(cè)預(yù)判等優(yōu)點(diǎn)，ELISA已成為臨床診斷、食品質(zhì)量控制和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法[3]。但這種傳統(tǒng)的ELISA檢測(cè)性能在很大程度上取決于酶的催化活性和負(fù)載量。而傳統(tǒng)的生物酶耐熱性差、保質(zhì)期短、容易失活等，并且酶負(fù)載量有限，導(dǎo)致其檢測(cè)穩(wěn)定性與靈敏度較差[4]。

近年來(lái)，具有特殊的光、電、磁以及催化性質(zhì)的新型納米材料的成功合成為開發(fā)新型ELISA法帶來(lái)了新的機(jī)遇。目前，關(guān)于改良型ELISA的研究較多[5-6]，如利用金納米顆粒(AuNPs)作為比色信號(hào)底物與金納米棒(AuNRs)酶載體的改良型ELISA。但是，隨著基于納米材料構(gòu)建的改良型ELISA的迅速發(fā)展，相關(guān)綜述總結(jié)其進(jìn)展尚未見報(bào)道。

文章擬聚焦基于納米材料構(gòu)建的改良型ELISA，總結(jié)其在信號(hào)檢測(cè)模式(如比色法、熒光法、電化學(xué)和光熱傳感)方面的研究進(jìn)展，對(duì)其發(fā)展方向以及所面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行展望與分析，為ELISA在生物分子檢測(cè)方面提供新思路。

1 改良型比色ELISA

1.1 基于納米材料改良信號(hào)輸出比色ELISA

傳統(tǒng)酶底物的顏色響應(yīng)能力可以滿足高濃度目標(biāo)物的檢測(cè)需求，但不適用于痕量目標(biāo)物的高靈敏度檢測(cè)。納米材料特殊的光、電、磁以及催化性質(zhì)，使其可以作為信號(hào)底物的替代物，以改善肉眼的視覺感知，適合超靈敏檢測(cè)。

由于具有較大的摩爾消光系數(shù)和很強(qiáng)的局部表面等離子體共振(LSPR)效應(yīng)，AuNPs可以作為信號(hào)底物。其信號(hào)的產(chǎn)生主要基于AuNPs的聚集及原位生長(zhǎng)。表面修飾的抗體、核酸以及化學(xué)配體可以觸發(fā)金納米顆粒的聚集。Jiang等[7]構(gòu)建了辣根過(guò)氧化物酶(HRP)介導(dǎo)的碘化物催化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以調(diào)節(jié)AuNPs的分散/聚集。由圖1可知，在過(guò)氧化氫(H2O2)存在下，通過(guò)在抗體上修飾的HRP將碘化物氧化為碘單質(zhì)，從而發(fā)生半胱氨酸誘導(dǎo)的金納米粒子聚集，使溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色。與基于3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的ELISA相比，這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)可使肉眼讀出的靈敏度提高20倍。此外，Huang等[8]通過(guò)氧化氫酶(CAT)調(diào)節(jié)H2O2濃度介導(dǎo)的AuNPs生長(zhǎng)開發(fā)的改良型ELISA對(duì)赭曲霉毒素A(OTA)表現(xiàn)出極高的靈敏度，檢測(cè)限為5×10-20g/mL，比常規(guī)ELISA(10-11g/mL)低8個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖1 基于HRP介導(dǎo)的AuNPs可視ELISA示意圖[7]

與球形AuNPs相比，AuNRs對(duì)周圍電介質(zhì)環(huán)境的變化反應(yīng)更加靈敏，且具有更好的呈色性能[9-10]。研究[11]表明，一些氧化劑從AuNRs的末端開始刻蝕，使AuNRs出現(xiàn)不同長(zhǎng)寬比以呈現(xiàn)不同的顏色。根據(jù)這一現(xiàn)象，AuNRs作為信號(hào)輸出底物廣受研究者的青睞[12]。Ma等[13]利用Fe2+離子充當(dāng)催化劑，催化H2O2歧化以產(chǎn)生羥基自由基(·OH)，進(jìn)而刻蝕AuNRs，開發(fā)了一種用于檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)的改良型ELISA。利用固定在96孔板表面的單克隆抗體捕獲抗原(靶分子/蛋白質(zhì))，過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的多克隆抗體與抗原結(jié)合，在平板表面形成“抗體—抗原—第二抗體”夾心復(fù)合物[圖2(a)]。附著在板表面的過(guò)氧化氫酶起催化劑作用，催化H2O2分解為水和氧氣。在沒(méi)有AFP的情況下，F(xiàn)e2+催化H2O2歧化產(chǎn)生·OH刻蝕AuNRs使溶液的顏色為黃色，隨著AFP濃度的增加，溶液顏色逐漸由黃色變?yōu)闊o(wú)色，再變?yōu)榉凵?、綠色、橙色[圖2(b)]。AFP的可視檢查動(dòng)態(tài)范圍為0～120 ng/mL，可視檢測(cè)限為5.0 ng/mL。

由于其良好的光學(xué)性能，AuNPs、AuNRs、金納米星(AuNS)[14]、金納米雙錐體(Au NBP)[15]、銀納米顆粒(AgNPs)[16]、三角銀納米棱鏡(AgNPR)[17]被作為信號(hào)底物以改良比色ELISA。這類納米材料用于顯色底物，其顏色信號(hào)輸出豐富改善了比色ELISA的可視檢測(cè)能力和檢測(cè)靈敏度。

1.2 基于納米酶的改良型比色ELISA

納米酶具有易于制備，堅(jiān)固耐用，穩(wěn)定性好，可調(diào)節(jié)催化特性，增強(qiáng)夾心比色法的檢測(cè)靈敏度和效率等多種優(yōu)勢(shì)。這些基于納米酶的夾心比色法不僅可以檢測(cè)蛋白質(zhì)，還有檢測(cè)其他生物分子的潛在應(yīng)用空間?；诩{米酶的過(guò)氧化物酶活性，Huang等[18]以金納米簇(AuNCs)作為納米酶，以AuNPs作為顯色底物，設(shè)計(jì)了一種用于T3甲狀腺激素檢測(cè)的改良型ELISA(圖3)。利用AuNCs催化H2O2分解，在HAuCl4存在的情況下，得到不同顏色的AuNPs。該傳感器擁有超高的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了T3甲狀腺激素的痕量檢測(cè)，檢測(cè)限為2.0×10-15mg/mL。此類改良型ELISA不但簡(jiǎn)化了系統(tǒng)，還降低了成本，利于實(shí)際應(yīng)用。

圖2 基于AuNRs構(gòu)建的改良型ELISA示意圖[13]

Figure 2 Schematic diagram of improved ELISA based on AuNRs

圖3 T3甲狀腺激素檢測(cè)示意圖[18]

Figure 3 Schematic diagram of T3 thyroid hormone detection

此外，基于AgNPs的比色傳感器具有更高的消光系數(shù)和更低的價(jià)格等優(yōu)勢(shì)[19-20]，已被廣泛用于生物分子的比色測(cè)定。Chen等[21]利用3D-MnO2-PEG納米花和4-巰基苯甲酸與三聚氰胺改性的銀納米顆粒(4-MBA-MA-AgNPs)設(shè)計(jì)了一種改良型ELISA，用于檢測(cè)腸道病毒71型(EV71)(圖4)。采用3D-MnO2-PEG代替酶，并修飾抗體；捕獲目標(biāo)物后，利用VC還原3D-MnO2-PEG，釋放Mn2+；加入4-MBA-MA-AgNPs，通過(guò)Mn2+聚集AgNPs，溶液顏色和紫外—可見光譜發(fā)生變化，通過(guò)還原反應(yīng)釋放Mn2+以提高檢測(cè)靈敏度。

2 改良型熒光ELISA

Albert等[22-23]提出了熒光免疫概念，并應(yīng)用于肺炎球菌的檢測(cè)。近年來(lái)，基于新型熒光納米材料的改良型ELISA和熒光免疫測(cè)定(FELISA)引起了研究人員的廣泛關(guān)注。由于量子點(diǎn)(QD)特有的光學(xué)特性、高光穩(wěn)定性以及尺寸和形狀可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，引起了研究人員對(duì)提高FELISA靈敏度的關(guān)注[24-26]。Xu等[27]基于CAT調(diào)控的CdTe QD熒光轉(zhuǎn)換，開發(fā)了一種競(jìng)爭(zhēng)型FELISA，用于檢測(cè)伏馬毒素B1(FB1)(圖5)。巰基丙酸修飾的CdTe量子點(diǎn)(MPA-QD)的熒光被H2O2淬滅，CAT作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原的載體，調(diào)節(jié)H2O2的濃度實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。若體系中不存在FB1，CdTe QD的熒光被H2O2猝滅；若樣品中存在FB1，則體系中存在CAT，H2O2被分解，CdTe QD的熒光不會(huì)被猝滅。檢測(cè)限為0.33 ng/mL，為基于HRP的傳統(tǒng)ELISA的1/15。

圖4 EV71的免疫測(cè)定示意圖[21]

圖5 ELISA檢測(cè)FB1示意圖[27]

作為新興材料，碳點(diǎn)(CDs)具有易于合成、成本低、無(wú)毒和良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，其熒光特性和過(guò)氧化物酶特性被廣泛用于免疫測(cè)定[28-31]。Dong等[32]利用CDs的熒光特性和MnO2NSs的淬滅特性，建立了一種新型的FELISA。該方法中熒光CDs和MnO2NSs通過(guò)靜電吸附結(jié)合，由于CDs和MnO2NSs之間的熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)，CDs的熒光被淬滅。堿性磷酸酶(ALP)催化抗壞血酸2-磷酸酯(AAP)水解產(chǎn)生的AA可將MnO2NSs還原為Mn2+，釋放CDs?；谶@種熒光“開啟”機(jī)制，F(xiàn)ELISA實(shí)現(xiàn)了金剛烷胺的檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)0.035 ng/mL。此外，利用CDs的熒光特性與過(guò)氧化物酶特性，開發(fā)了一種結(jié)合熒光與比色的改良型ELISA法用于檢測(cè)AFP[29](圖6)。將CDs與抗AFP抗體(Ab2)通過(guò)戊二醛胺—胺偶聯(lián)，當(dāng)AFP存在時(shí)，加入Ab2后形成夾心復(fù)合物?；贑Ds的熒光特性，夾心免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度與AFP濃度呈正相關(guān)，檢測(cè)范圍為0～350 ng/mL，R2為0.995。而傳統(tǒng)免疫分析使用HRP的R2為0.964，熒光素異硫氰酸酯(FITC)的R2為0.973，表明CDs具有很大的潛力，可用于免疫分析的生物標(biāo)記。

Tan等[33]將Pd-Ir納米立方體作為納米酶及CDs信號(hào)讀出底物有機(jī)結(jié)合，開發(fā)了檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的FELISA(圖7)。在H2O2存在的情況下，納米酶催化鄰苯二胺(OPD)轉(zhuǎn)化為其氧化物(Ox-OPD)，在400 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，570 nm處有發(fā)射峰，Ox-OPD可吸附于CDs表面上，猝滅CDs的熒光。在cTnI存在的情況下，Ox-OPD在570 nm處的熒光峰增加，同時(shí)CDs在450 nm處的熒光峰減少，從而形成比例熒光信號(hào)用于cTnI的定量，F(xiàn)ELISA的檢測(cè)限為0.31 pg/mL。同理，Zhu等[34]利用Au@Pt納米材料作為OPD氧化的納米酶，Ox-OPD的顏色變化實(shí)現(xiàn)了比色檢測(cè)，而雙發(fā)射峰的熒光變化實(shí)現(xiàn)了cTnI的熒光檢測(cè)。因此，納米酶和納米底物共同構(gòu)建的FELISA可為生物分子檢測(cè)提供準(zhǔn)確、靈敏的免疫測(cè)定。

圖6 免疫吸附示意圖[29]

圖7 基于Pd-Ir納米酶與CDs的熒光免疫測(cè)定示意圖[33]

Figure 7 Schematic diagram of fluorescent immunoassay based on Pd-Ir nanozyme and CDs

3 其他改良型ELISA

近年來(lái)，除比色法和熒光法外，還探索了其他方法來(lái)改良ELISA，如電化學(xué)免疫測(cè)定(ECLISA)、光熱效應(yīng)技術(shù)(PTE)、表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)(SERS)和化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(CLIA)。這些技術(shù)與ELISA結(jié)合可得到更加靈敏和便捷的方法，滿足痕量檢測(cè)與降低成本的要求。

3.1 基于電化學(xué)免疫分析的改良型ELISA

作為快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中最有前途的方法，電化學(xué)免疫測(cè)定法既具有電化學(xué)傳感器價(jià)格低廉、攜帶方便、靈敏度高，又具有免疫分析工具便于操作和高選擇性，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)ELISA靈敏度不足、背景高和成本高的缺陷[35-37]。納米級(jí)PbS膠體(PbS CSs)被成功應(yīng)用于新型ECL ELISA的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了人附睪蛋白4(HE4)的超靈敏檢測(cè)[38]。將修飾了抗體的富勒烯—?dú)ぞ厶?C60-Chit)納米復(fù)合物固定于玻璃碳電極(GCE)，擴(kuò)大了Pb2+的檢測(cè)靈敏度；夾層結(jié)構(gòu)形成后，可從PbS CSs釋放的Pb2+側(cè)面反映HE4的濃度，其檢測(cè)限為3.4 fg/mL。Knopp等[39-41]開發(fā)了一種基于氣體的非接觸式電化學(xué)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了傳感器的重復(fù)使用，還提高了精度、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。將氫(H2)和鈀(Pd)納米材料結(jié)合，構(gòu)建了基于氣體的電化學(xué)生物傳感器，H2與Pd反應(yīng)形成PdHx，增加Pd電阻。氧氣的干擾是傳感器的固有局限性，為了減輕氧對(duì)靈敏度的影響，Knopp等[42]構(gòu)建了一種改良的ELISA傳感平臺(tái)。以包裹在Pd納米線表面的沸石咪唑鹽骨架(ZIFs-67)作為檢測(cè)探針，與抗AFP抗體偶聯(lián)用于AFP檢測(cè)，由于氧不能透過(guò)ZIFs-67，其檢測(cè)限達(dá)0.04 ng/mL[43]。

3.2 基于光熱效應(yīng)的改良型ELISA

近年來(lái)，光熱納米材料的光熱效應(yīng)(PTEs)是改良型ELISA的研究熱點(diǎn)之一[44-45]，以光熱納米材料為基礎(chǔ)已開發(fā)了使用普通溫度計(jì)對(duì)目標(biāo)進(jìn)行定量讀取的光熱免疫測(cè)定法(PTIA)[46]。同時(shí)，使用溫度計(jì)作為信號(hào)讀出系統(tǒng)的改良型ELISA也得到了廣泛發(fā)展，如將Fe3O4NP錨定在功能化的氧化石墨烯上并偶聯(lián)DNA制備成檢測(cè)探針，無(wú)目標(biāo)物PSA時(shí)，DNA與PSA適配體之間的雜交反應(yīng)捕獲信號(hào)探針，F(xiàn)e3O4NP轉(zhuǎn)化為普魯士藍(lán)納米顆粒(PB)，通過(guò)808 nm激光輻照將生物信號(hào)轉(zhuǎn)化為熱信號(hào)，實(shí)現(xiàn)PSA定量檢測(cè)，檢測(cè)限為0.31 ng/mL[47]。Jiao等[48]利用Au@Pt納米枝晶介導(dǎo)的多模信號(hào)輸出，開發(fā)了一種改良型ELISA?；谄溥^(guò)氧化物酶活性實(shí)現(xiàn)了比色及熒光信號(hào)讀出，同時(shí)因Au@Pt較強(qiáng)的光熱效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了808 nm照射下的熱信號(hào)讀出，完成了cTnI的定量免疫分析

3.3 基于表面增強(qiáng)拉曼散射的改良型ELISA

基于表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)的技術(shù)具有抗光漂白、較少的背景干擾、高靈敏度以及較好的穩(wěn)定性[49]。這些優(yōu)勢(shì)使SERS在生物學(xué)分析中具有潛在的應(yīng)用前景[50-53]。近年來(lái)，Yang等[54]將SERS技術(shù)與ELISA結(jié)合，開發(fā)了一種改良型ELISA檢測(cè)PSA。該方法利用Cu2-xSySe1-y納米顆粒作為納米酶，催化C≡C—PEG2CH2CH2NH2和N3—PEG3—CH2CH2NH2的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，有效避免了光漂白以及背景對(duì)結(jié)果的影響。Su等[55]利用結(jié)合了AuNPs的共價(jià)有機(jī)骨架(COF)復(fù)合材料作為納米酶，催化4-硝基苯硫酚(4-NTP)還原轉(zhuǎn)化為4-氨基硫酚(4-ATP)，構(gòu)建了一種新型SERS-ELISA。在NaBH4存在的情況下，新產(chǎn)生的4-ATP與AuNS觸發(fā)了拉曼信號(hào)“開啟”實(shí)現(xiàn)了β-乳球蛋白的高靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)限達(dá)0.01 ng/mL。

3.4 基于化學(xué)發(fā)光免疫分析的改良型ELISA

化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(CLIA)是基于底物吸收化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為化學(xué)發(fā)光的方法[56-57]。由于其背景干擾小，能有效避免背景光和光漂白，具有高靈敏度和寬線性范圍的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物傳感器和生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域[58-59]。Yang等[60]利用親和素化的磁納米顆粒(SA-MNP)開發(fā)了一種CLIA方法。在兔免疫球蛋白(rIgG)存在的情況下，加入K4Fe(CN)6使磁顆粒表面生成PB，提高了PB過(guò)氧化物酶樣活性，使魯米諾的CL信號(hào)增強(qiáng)，且CL強(qiáng)度與rIgG的濃度呈正相關(guān)，其檢測(cè)限分別為0.28 ng/mL，0.044 pmol。

4 總結(jié)與展望

文章簡(jiǎn)要分析了傳統(tǒng)ELISA作為檢測(cè)手段的局限性，重點(diǎn)總結(jié)了近年來(lái)基于納米材料開發(fā)的改良型ELISA方法。其中，以貴金屬納米材料(如金納米顆粒、金納米棒、銀納米顆粒等)作為底物輸出多色信號(hào)的策略已在很大程度上提高了比色ELISA的肉眼檢測(cè)能力和檢測(cè)靈敏度。以納米酶替代傳統(tǒng)生物酶為特點(diǎn)的新型ELISA不僅彌補(bǔ)了傳統(tǒng)ELISA中酶的耐熱性差、保質(zhì)期短、容易失活的缺陷，也為提高測(cè)定靈敏度和穩(wěn)定性，縮短測(cè)定時(shí)間等方面提供了解決思路，且檢測(cè)策略相對(duì)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜，展現(xiàn)出了較大的應(yīng)用前景。

雖然各種改良型ELISA在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境測(cè)量和食品行業(yè)中廣泛應(yīng)用，但對(duì)改良型ELISA的研究還存在以下不足：

(1)納米底物的引入很大程度上提高了比色ELISA的檢測(cè)靈敏度，但對(duì)于分析物濃度的微小變化導(dǎo)致的色度變化還難以區(qū)分。因此，提高納米底物對(duì)微小濃度變化的響應(yīng)能力，制備出響應(yīng)性能更佳，選擇性更好的納米底物，將是未來(lái)一個(gè)重要的研究方向。

(2)基于熒光的ELISA已被廣泛應(yīng)用于改良型ELISA，且具有較高的靈敏度，但在如何克服其他基質(zhì)背景干擾，熒光探針的光漂白現(xiàn)象，以及熒光漲落及淬滅現(xiàn)象方面需進(jìn)一步開發(fā)研究。

(3)新興的信號(hào)(電化學(xué)信號(hào)、光熱效應(yīng)、表面增強(qiáng)拉曼和化學(xué)發(fā)光)有足夠的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、較高的靈敏度以及低背景信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)，但其策略相對(duì)復(fù)雜，需要特定的設(shè)備與專業(yè)人員的操作，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。若能與智能手機(jī)，便攜式、高分辨率檢測(cè)器結(jié)合使用，有望實(shí)現(xiàn)便攜式信號(hào)讀取，進(jìn)而滿足現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)需求。