淀粉酶對竹黃菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)竹紅菌素的影響

高瑞杰， 鄧華祥， 李韻雅， 管政兵， 廖祥儒， 蔡宇杰*

（1. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫214122）

竹黃（Shiraia bambusicola）是中國常見的一種藥用真菌，寄生于特定的竹子的嫩枝上[1]，其主要分布在中國的南部省份，國外的日本和斯里蘭卡也有報(bào)道[2-3]。

2008 年，第10 版的《真菌字典》將竹黃歸屬到子囊菌門（Ascomycota），座囊菌綱（Dothideomycetes），格孢菌目（Pleosporales）中科地位未確定的竹黃屬[4]。 Cheng 等研究人員通過對竹黃菌的18S rRNA和ITS-5.8S rRNA 的序列進(jìn)行分析， 提議將竹黃菌歸屬于格孢菌科（Phaeosphaeriaceae）[5]。

作為中國一種傳統(tǒng)的中藥材，竹黃菌的子座中含有多種具有生理活性的物質(zhì)。 竹紅菌素是竹黃中最主要的紅色色素組分，同時(shí)也是竹黃中最重要的生物活性物質(zhì)，是由多種苝醌類化合物所組成。 目前市場上的竹紅菌素軟膏產(chǎn)品，主要是由昆明振華制藥廠和云南白藥大理制藥廠兩家制藥廠家生產(chǎn)，其有效成分就是竹紅菌素。 竹紅菌素作為一種優(yōu)良的光敏劑， 在特定的光照條件下能夠產(chǎn)生活性氧，包括超氧自由基和單線態(tài)氧。 豐富的活性氧可以引起細(xì)胞的高氧化壓力， 損傷包括脂質(zhì)、DNA 和蛋白質(zhì)等生物大分子，進(jìn)而殺死細(xì)胞[6-8]。 竹紅菌素光敏活性的研究成為竹紅菌素研究的熱點(diǎn)，國內(nèi)外多個(gè)團(tuán)隊(duì)在這一方面展開了大量的研究工作。 竹紅菌素及其衍生物在抗菌、抗病毒、抗艾滋、抗癌（肝癌、肺癌、乳腺癌等）方面展現(xiàn)出良好的醫(yī)療效果[9-14]。

目前市場上的竹紅菌素主要是從竹黃子座中分離獲得，然而天然野生竹黃由于地域分布極不平衡，生長季節(jié)短暫，產(chǎn)量低而限制了竹紅菌素的開發(fā)利用，因而通過生物發(fā)酵法獲取竹紅菌素成為研究熱點(diǎn)。 相對于液態(tài)發(fā)酵而言，作為絲狀真菌的竹黃菌在進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)具有很大的優(yōu)勢：能量消耗低，生產(chǎn)成本低；無廢水排放，污染??；體積生產(chǎn)率高且不易染菌； 一些應(yīng)用無需進(jìn)行提取純化等工藝，例如作為著色劑可直接添加于飼料應(yīng)用。 因而通過固態(tài)發(fā)酵的方法來生產(chǎn)竹紅菌素成為本課題的研究重點(diǎn)。

作者所在課題組前期篩選到的竹黃菌Shiraiasp. SUPER-H168[15]能夠穩(wěn)定高產(chǎn)竹紅菌素，通過對其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵方面的初步探究，經(jīng)過對8 種農(nóng)作物的篩選后，發(fā)現(xiàn)玉米是生產(chǎn)竹紅菌素的最佳固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)[16]。玉米糝是由玉米的胚乳部分破碎制成，淀粉是玉米胚乳的主要組成成分， 玉米淀粉是由75%的支鏈淀粉和25%的直鏈淀粉組成。 為了提高對底物玉米淀粉的利用率，縮短發(fā)酵周期，提高竹紅菌素的產(chǎn)量，作者采用固態(tài)發(fā)酵的方法，研究了固態(tài)基質(zhì)的初次攪拌、攪拌時(shí)間間隔、外加淀粉酶（包括細(xì)菌高溫α 淀粉酶、細(xì)菌中溫α 淀粉酶、真菌α 淀粉酶和糖化酶）對竹紅菌素產(chǎn)量的影響，以期為商業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)竹紅菌素提供有益的參考及幫助。

1 材料與方法

1.1 菌種

竹黃菌 （Shiraia bambusicola）SUPER-H168：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏[15]。

1.2 培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20；pH 自然。

液態(tài)種子培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO42，MgSO4·7H2O 0.5；pH 自然。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（250 mL 錐形瓶）：玉米糝（粒徑0.8~1 mm）25 g， 麥秸稈3 g， 葡萄糖5%，NH4Cl 1% ，CuSO40.05% ，CaCl20.10% ，KH2PO40.05% ，K2HPO40.01%，MgSO40.20%， 初始含水量50%，初始pH 自然[17]。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃下濕熱滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸液的制備 斜面種子在30 ℃下培養(yǎng)5~7 d 至長出大量黑色孢子， 用20 mL 無菌水沖洗下黑色孢子，并用玻璃珠將黑色孢子充分打碎并配置成106個(gè)/mL 的孢子懸浮液。

1.3.2 種子液的培養(yǎng) 將1.3.1 所述的孢子懸液2 mL 接種于50 mL 的液態(tài)種子培養(yǎng)基中， 在30 ℃、200 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)24 h 以制備固態(tài)發(fā)酵的種子液。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng) 將2 mL 的種子液接種于固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中，在30 ℃的條件下培養(yǎng)15 d。 在進(jìn)行固態(tài)基質(zhì)攪拌優(yōu)化之前，每兩天對基質(zhì)進(jìn)行一次攪拌。

1.3.4 竹紅菌素的測定方法 將固態(tài)發(fā)酵物進(jìn)行攪拌后取樣，放置在烘箱中70 ℃烘干直至恒質(zhì)量，準(zhǔn)確稱取1.00 g，用研缽研碎，接著使用30 mL 無水乙醇在80 ℃下浸泡提取兩次，抽濾后得澄清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干后，用甲醇溶解并且適當(dāng)稀釋至一定濃度，稀釋后體積為V，然后用分光光度計(jì)在465 nm 處測定吸光值， 根據(jù)回歸方程y=0.036 4x+0.044 1（R2=0.999）計(jì)算色素的含量，其中y為吸光值，x為色素的質(zhì)量濃度（mg/L）。經(jīng)換算后得到每克干固態(tài)基質(zhì)的竹紅菌素的產(chǎn)量為x·V，單位為mg/g（每克干固態(tài)基質(zhì)）。

1.3.5 初次攪拌及攪拌間隔時(shí)間的優(yōu)化 首先對

初次攪拌時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別為第1 天、第2 天、第3 天和第4 天，此時(shí)隨后的攪拌間隔時(shí)間為2 d。 在初次攪拌時(shí)間確定后， 進(jìn)行攪拌間隔時(shí)間的優(yōu)化，分別為12、24、36、48 h。

1.3.6 外加淀粉酶的優(yōu)化 將固態(tài)發(fā)酵初始和發(fā)酵第3 天作為淀粉酶的加入時(shí)間點(diǎn)。 4 種淀粉酶包括細(xì)菌高溫α 淀粉酶、細(xì)菌中溫α 淀粉酶、真菌α淀粉酶和糖化酶，均購買于江蘇銳陽生物科技有限公司。 4 種淀粉酶分別在固態(tài)發(fā)酵初始或者第3 天加入，其中高溫α 淀粉酶是在固態(tài)基質(zhì)滅菌之前加入到基質(zhì)中，于95 ℃保溫30 min。 在對各淀粉酶的添加計(jì)量進(jìn)行優(yōu)化之前，α 淀粉酶的使用添加量為4 U/g （固態(tài)干基質(zhì)）， 糖化酶使用添加量為50 U/g（固態(tài)干基質(zhì)）。細(xì)菌中溫α 淀粉酶和真菌α 淀粉酶添加計(jì)量的優(yōu)化：1、2、3、4、5、6 U/g （固態(tài)干基質(zhì)）；糖化酶添加計(jì)量的優(yōu)化：10、20、30、40、50、60 U/g（固態(tài)干基質(zhì)）。

α 淀粉酶和糖化酶兩種酶對竹紅菌素產(chǎn)量的協(xié)同作用也進(jìn)行了進(jìn)一步的探究。 在研究完外加淀粉酶的影響后，發(fā)現(xiàn)中溫α 淀粉酶和糖化酶對竹紅菌素的產(chǎn)量的影響顯著。 利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)一步探究細(xì)菌中溫α 淀粉酶和糖化酶的最佳添加搭配。 采用軟件Design-expert 8.2 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，響應(yīng)面三維圖采用Origin 8.1 進(jìn)行模擬合成。 得到二次多項(xiàng)式方程后，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)菌中溫α 淀粉酶和糖化酶的最佳添加濃度。 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)中的中心組合設(shè)計(jì)因素和水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of the variables for response surface methodology experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 初次攪拌的優(yōu)化

攪拌是固態(tài)耗氧發(fā)酵最重要的參數(shù)之一，它可以通過固體基質(zhì)表面液體和氣體形成的分界面的氣體傳輸，以確保溫度和氣體等傳熱和傳質(zhì)的均一性。 在絲狀真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的過程中，攪拌會破壞真菌的菌絲， 尤其是在固態(tài)接種發(fā)酵后的初期，菌絲在固體基質(zhì)中正處于延伸定殖并最終覆蓋整個(gè)固體基質(zhì)的階段，過早的攪拌會干擾破壞菌絲的延伸， 不利于菌絲的延伸及固態(tài)發(fā)酵的順利進(jìn)行，因而本實(shí)驗(yàn)先對固態(tài)發(fā)酵的初次攪拌進(jìn)行了優(yōu)化。由圖1 可知，當(dāng)在第3 天進(jìn)行初始攪拌時(shí)，竹紅菌素的產(chǎn)量達(dá)到最高水平23.85 mg/g。 隨著初始攪拌從第1 天到第4 天進(jìn)行的變化，可以觀測到生物量也隨之增加， 尤其是在第4 天進(jìn)行初始攪拌時(shí)，整個(gè)固態(tài)基質(zhì)表面附著著大量白色氣生菌絲，且固態(tài)基質(zhì)結(jié)塊嚴(yán)重，不利于攪拌的進(jìn)行。

2.2 攪拌間隔時(shí)間的優(yōu)化

圖1 初始攪拌對竹紅菌素產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of first agitation time on hypocrellin production

在第3 天確定為最佳初始攪拌時(shí)間后，進(jìn)一步對攪拌間隔時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖2。當(dāng)攪拌間隔時(shí)間為36 h 時(shí)， 竹紅菌素的產(chǎn)量達(dá)到最高水平25.37 mg/g， 攪拌間隔時(shí)間過短或過長都不利于竹紅菌素的產(chǎn)生。 攪拌間隔時(shí)間過短時(shí)，攪拌對菌絲的損傷較大以至于影響到竹紅菌素的產(chǎn)量；當(dāng)攪拌間隔時(shí)間過長時(shí)，固態(tài)基質(zhì)結(jié)塊嚴(yán)重，不利于氣體流通和溫度傳遞，也不利于竹紅菌素的產(chǎn)生。

圖2 攪拌間隔時(shí)間對竹紅菌素產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of intermittent agitation time on hypocrellin production

2.3 外加單一淀粉酶的優(yōu)化

基于攪拌優(yōu)化的結(jié)果，選定固態(tài)發(fā)酵初始和發(fā)酵第3 天作為淀粉酶的加入時(shí)間點(diǎn)。 與對照組相比，4 種淀粉酶的7 種加入方式都在不同程度上提高了竹紅菌素的產(chǎn)量，見圖3。中溫α 淀粉酶或真菌α 淀粉酶在發(fā)酵初始時(shí)加入要比發(fā)酵第3 天加入的竹紅菌素產(chǎn)量要高。 其中細(xì)菌中溫α 淀粉酶在發(fā)酵初始時(shí)加入，竹紅菌素產(chǎn)量達(dá)到45.10 mg/g。當(dāng)糖化酶在發(fā)酵初始時(shí)加入，竹紅菌素產(chǎn)量（32.40 mg/g）要低于在發(fā)酵3 d 時(shí)加入（39.94 mg/g）。 細(xì)菌高溫α淀粉酶的加入處理，固態(tài)基質(zhì)結(jié)塊非常厲害且難于進(jìn)行攪拌處理， 竹紅菌素產(chǎn)量只有29.37 mg/g，因此，細(xì)菌高溫α 淀粉酶沒有進(jìn)行進(jìn)一步的研究處理。

圖3 外加單一淀粉酶對竹紅菌素產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of different amylase addition on hypocrellin production

2.4 淀粉酶添加量的優(yōu)化

在選定細(xì)菌中溫α 淀粉酶、真菌α 淀粉酶和糖化酶進(jìn)行進(jìn)一步研究后，對3 種淀粉酶的使用添加量進(jìn)行了優(yōu)化。中溫α 淀粉酶和真菌α 淀粉酶選定在發(fā)酵初始時(shí)加入，糖化酶選定在發(fā)酵3 d 后加入。當(dāng)細(xì)菌中溫α 淀粉酶的使用添加量為3 U/g 時(shí)，竹紅菌素產(chǎn)量達(dá)到48.12 mg/g； 當(dāng)真菌α 淀粉酶的使用添加量為4 U/g 時(shí)， 竹紅菌素產(chǎn)量達(dá)到41.99 mg/g，見圖4。 2 種α 淀粉酶加入處理所造成的竹紅菌素產(chǎn)量的不同， 可能是由于2 種酶的最適pH 和最適溫度的不同造成的，同時(shí)說明細(xì)菌中溫α 淀粉酶在固態(tài)發(fā)酵的條件下具有更好的活性，更利于竹黃菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)竹紅菌素的進(jìn)行， 因而選擇細(xì)菌中溫α淀粉酶以進(jìn)一步研究其對竹紅菌素產(chǎn)量的影響。

圖4 α 淀粉酶添加量對竹紅菌素產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of dose of α -amylase addition on hypocrellin production

當(dāng)糖化酶的使用添加量為30 U/g 時(shí)，竹紅菌素的產(chǎn)量達(dá)到40.64 mg/g。 伴隨著糖化酶使用添加量由30 U/g 到60 U/g 的增加， 竹紅菌素的產(chǎn)量逐漸下降，見圖5。 可能是由于酶量增加后，水解產(chǎn)生的大量葡萄糖造成了底物抑制。

2.5 淀粉酶協(xié)同加入的優(yōu)化

兩種α 淀粉酶（細(xì)菌中溫α 淀粉酶和真菌α 淀粉酶）和糖化酶的協(xié)同作用對竹紅菌素產(chǎn)量影響的探究。 當(dāng)α 淀粉酶在發(fā)酵初始時(shí)加入而糖化酶在發(fā)酵3 d 后加入時(shí)， 竹紅菌素的產(chǎn)量要高于α 淀粉酶和糖化酶二者同時(shí)在發(fā)酵初始時(shí)加入的處理。當(dāng)中溫α淀粉酶和糖化酶在發(fā)酵初始時(shí)同時(shí)加入，竹紅菌素的產(chǎn)量被抑制到21.01 mg/g，對照組為25.37 mg/g。 當(dāng)中溫α 淀粉酶在發(fā)酵初始時(shí)加入而糖化酶在發(fā)酵3 d 后加入時(shí)，竹紅菌素的產(chǎn)量達(dá)到最高，為55.26 mg/g，同時(shí)固態(tài)發(fā)酵周期由15 d 縮減到13 d，見圖6。

圖5 糖化酶添加量對竹紅菌素產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of dose of glucoamlase addition on hypocrellin production

圖6 淀粉酶協(xié)同加入對竹紅菌素產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of synergistic effect of two α-amylases and glucoamylase on hypocrellin production

2.6 細(xì)菌中溫α 淀粉酶和糖化酶的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

通過上述的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中溫α 淀粉酶和糖化酶對竹紅菌素的產(chǎn)量影響較大，因而選擇添加這兩種淀粉酶進(jìn)行響應(yīng)面研究，結(jié)果見表2。

利用軟件Design-Expert 8.0.6 對表2 中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得回歸方程為：

Y=68.93-2.19A-0.75B-2.64AB-7.27A2-8.06B2其中Y為響應(yīng)值（竹紅菌素產(chǎn)量，mg/g）；A（細(xì)菌中溫α 淀粉酶，U/g）和B（糖化酶，U/g）為響應(yīng)變量。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design matrix and yields of hypocrellin

從回歸方程的系數(shù)分析，其所對應(yīng)的拋物面開口向下， 因而Y具有最大響應(yīng)值。 利用軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 結(jié)果見表3。 該模型的P值為0.000 5，遠(yuǎn)小于0.05，說明此模型在95%的概率水平是顯著的；同時(shí)模型的失擬項(xiàng)不顯著（p=0.081 7，大于0.05）， 說明未知因素對該模型預(yù)測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾強(qiáng)度比較小， 不必要再引入更多的因素；相關(guān)系數(shù)R2=0.933 5，說明響應(yīng)值的變化在93.35%的概率上是由該模型決定的；R=0.966 1， 說明實(shí)驗(yàn)中竹紅菌素的產(chǎn)量的實(shí)際值與模型預(yù)測值有96.61%的一致性。 因此，該模型能較準(zhǔn)確的預(yù)測出竹紅菌素的產(chǎn)量。

對回歸方程進(jìn)行求導(dǎo)，結(jié)合圖7 的響應(yīng)面三維圖，求得該模型的最大響應(yīng)值為60.10 mg/g，此時(shí)對應(yīng)的中溫α 淀粉酶和糖化酶的添加量分別為2.85、

29.78 U/g。

經(jīng)過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定固態(tài)發(fā)酵中細(xì)菌中溫α 淀粉酶和糖化酶的添加量分別為2.85、29.78 U/g。 為了驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的精準(zhǔn)性，在此添加量下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵以進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。 在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，竹紅菌素的產(chǎn)量達(dá)到60.74 mg/g，與預(yù)測值接近，可見該模型能夠較好的反應(yīng)細(xì)菌中溫α 淀粉酶和糖化酶的使用添加量對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)竹紅菌素的影響。

表3 二次多項(xiàng)式回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

圖7 響應(yīng)面三維圖Fig. 7 Three dimensional graph of the surface response plot

3 結(jié) 語

作者在竹黃菌產(chǎn)竹紅菌素的固態(tài)發(fā)酵過程中，研究了攪拌（初始攪拌和攪拌間隔時(shí)間）和外加淀粉酶對竹紅菌素產(chǎn)量的影響。 確定了固態(tài)發(fā)酵的最佳攪拌方案和外加淀粉酶的種類及添加量：初始攪拌在發(fā)酵第3 天進(jìn)行， 此后的攪拌間隔時(shí)間為36 h， 外加淀粉酶以細(xì)菌中溫α 淀粉酶和糖化酶的復(fù)合添加為最佳，其中細(xì)菌中溫α 淀粉酶在固態(tài)發(fā)酵初始階段加入，添加量為2.85 U/g，糖化酶在發(fā)酵第3 天加入，添加量為29.78 U/g。 經(jīng)過攪拌和外加淀粉酶的研究后，竹紅菌素的產(chǎn)量到達(dá)了60.74 mg/g，是先前竹紅菌素產(chǎn)量[17]報(bào)道的3.66 倍，并且固態(tài)發(fā)酵的周期由15 d 縮減到了13 d。