西瓜種子脂肪酸組分分析及種子油體顯微觀察

欒非時(shí) ，裴 爽 ，劉 爭 ，高 鵬 ，劉 識 ，朱子成 ，王學(xué)征

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

西瓜是世界上重要經(jīng)濟(jì)作物之一，含有豐富礦物鹽和多種維生素[1]。目前，籽用西瓜在西非、印度等國家廣泛栽培，由于高含油量和高不飽和脂肪酸含量受到消費(fèi)者喜愛，發(fā)展前景可觀。西瓜籽含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素、鈣、鎂、鉀、鐵、硒等營養(yǎng)元素[2]。西瓜籽中脂肪酸含量可達(dá)50%以上，其成分以亞油酸為主[3]。亞油酸是一種不飽和脂肪酸，具有降血脂、抗血栓、提高大腦記憶力和注意力等多種功能，亞油酸代謝與脂類代謝酶活性、類固醇激素生理功能及其他生命機(jī)能有關(guān)[4]，醫(yī)學(xué)研究表明，不飽和脂肪酸具有降低蛋白血清膽固醇的作用，減少高血壓及心臟病發(fā)生[5-6]。因此，這種不飽和脂肪酸對人體具有重要的保健作用及開發(fā)利用價(jià)值。

為滿足消費(fèi)者對西瓜種子中營養(yǎng)成分需求，學(xué)者在西瓜種子方面開展大量研究。王妍等研究發(fā)現(xiàn)，西瓜籽油中脂肪酸有7種，其中亞油酸含量最高為42.26%，其次為油酸、棕櫚酸和硬脂酸，不飽和脂肪酸有3種，含量為66.47%[3]。嚴(yán)小平研究發(fā)現(xiàn)，西瓜籽油提取率為50.8%，西瓜籽油脂肪酸主要由棕櫚酸和不飽和脂肪酸組成，不飽和脂肪酸占93.1%，其中亞油酸含量高達(dá)74.8%[7]。Mahla等在西瓜籽油中鑒定出11種脂肪酸，其中亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸和油酸為主要成分[8]。Prothro 等以PI560023 和PI279461 為親本材料，在F2分離群體中鑒定出4 個(gè)與種子油分含量相關(guān)主要QTL位點(diǎn)[9]。Meru等研究與西瓜籽脂肪酸組成相關(guān)基因組區(qū)間和候選基因，找到8個(gè)與脂肪酸組成有關(guān)QTL 位點(diǎn)，其中一個(gè)QTL 位點(diǎn)在6 號染色體上，由油酸和亞油酸共定位得到[10]。

本研究對20 份西瓜供試材料種子中主要脂肪酸組分和種子尺寸等9 個(gè)性狀作變異性、相關(guān)性、主成分及聚類分析，并對高低含油量西瓜品種種子貯藏細(xì)胞內(nèi)油體作顯微觀察。探討各品種性狀間差異及內(nèi)在關(guān)系，研究油體差異對種子含油量的影響，以期為籽用西瓜育種及改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

20 份供試西瓜品種（18 份栽培品種，2 份野生材料）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院西甜瓜分子遺傳育種研究室提供（見表1）。

表1 供試西瓜材料名稱與來源Table 1 Names and sources of watermelon materials

1.2 方法

試驗(yàn)于2019年5～11月開展，將20份西瓜種質(zhì)資源播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)與示范中心向陽基地西甜瓜育種棚內(nèi)，每份材料種植5株，株行距70 cm×60 cm，雙蔓整枝，每株留一個(gè)瓜，自交授粉，常規(guī)肥水管理，成熟后收獲種子，分別測定總油含量（Oil content，OC）、亞油酸含量（Linoleic acid content，LAC）、油酸含量（Oleic acid content，OAC）、棕櫚酸含量（Palmitic acid content，PAC）、硬脂酸含量（Stearic acid content，SAC）、種子長度（Seed length，SL）、種子寬度（Seed width，SW）、種子厚度（Seed thickness，ST）、種子百粒重（Weight of 100 seed，WHS）。

1.3 性狀調(diào)查及測定方法

1.3.1 種子尺寸相關(guān)性狀調(diào)查

種子長度、種子寬度及種子厚度利用電子游標(biāo)卡尺測量（精確到0.01 mm），種子百粒重利用電子天平測量（精確到0.01 g），3 次重復(fù)，計(jì)算平均值。

1.3.2 種子油分含量測定

準(zhǔn)確稱取去殼、粉碎的西瓜種子4.00 g，用脫脂濾紙包好置于索氏提取器中，以正己烷（150 mL）為提取溶劑，85 ℃條件下水浴4 h，所得提取液蒸餾30 min 回收溶劑，然后將油脂放置于電熱板上除去多余水分至恒重，計(jì)算含油率，3 次重復(fù)，求取平均值。

1.3.3 種子油脂肪酸含量測定

采取氣相色譜-質(zhì)譜連用（GC-MS）測定脂肪酸含量[11]。稱取50 μL油脂置于10 mL離心管內(nèi)，加入1 mL正己烷和苯混合試劑（1∶1），輕輕搖動(dòng)使之溶解，稀釋。上述溶液取50 μL置于10 mL離心管內(nèi)，加入2 mL正己烷和苯混合試劑（1∶1），輕輕搖動(dòng)使之溶解，再加入2 mL氫氧化鉀甲醇（0.5 mol·L-1）溶液，搖勻。室溫靜置30 min，加1 mL 蒸餾水使全部有機(jī)相甲醇溶液升至瓶頸上部。澄清后吸取上清液，所得清液過濾膜即可用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent，USA；GC-7890，MS-5975）分析。

色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣氦氣（He），流速1.0 mL·min-1。采用程序升溫方式，由室溫升至150 ℃保持2 min，然后以5 ℃·min-1升至250 ℃在此溫度下保持10 min。分流進(jìn)樣，分流比20∶1。進(jìn)樣量1 μL。溶劑延遲10 min。

質(zhì)譜條件：MS 離子源在225 ℃全掃描，電離方式：EI，電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍：50～500 amu。

1.3.4 西瓜種子透射電鏡樣品制作

西瓜種子去殼，修剪3 mm3小塊，立即用2.5%戊二醛和2%四氧化鋨液雙固定，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 6.8）沖洗，乙醇逐級脫水（50%、70%、90%、100%），環(huán)氧樹脂滲透包埋聚合，利用AOULTRACUTE 型超薄切片機(jī)修塊切片，經(jīng)檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾雙重染色后，置于H-7650 型（HITACHI）透射電鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 2010統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，SPSS 25.0對西瓜籽脂肪酸組分及種子尺寸相關(guān)性狀作相關(guān)性、主成分及聚類分析。聚類時(shí)將原始數(shù)據(jù)先作標(biāo)準(zhǔn)化變換，在歐氏距離水平上采用離差平方和法作系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜種子脂肪酸含量變異性和相關(guān)性分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)，以4 種脂肪酸甲酯為標(biāo)準(zhǔn)樣品，檢測西瓜籽中4種主要脂肪酸組分出峰時(shí)間（見圖1）。4 個(gè)色譜峰所代表脂肪酸組分依次是棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸，保留時(shí)間分別為12.62、15.69、15.79和16.24 min。

20 份西瓜材料在西瓜籽脂肪酸組成上無明顯差異，均可檢測到亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸4 種脂肪酸，但不同材料中脂肪酸含量存在較大差異（見表2），其中ZXG01286、ZXG00980、ZXG00194 亞油酸含量偏高，為86.96%～88.13%，ZXG01558、ZXG00027、W1-54、LSW-177亞油酸含量偏低，為67.49%～78.47%；ZXG00027、W1-54、LSW-177、ZXG01558油酸含量偏高，為12.86%～21.37%，ZXG00980、ZXG00194、ZXG00170油酸含 量 偏 低， 為4.42% ～5.97% ； ZXG01558 和ZXG00385 棕櫚酸含量偏高，分別為5.25%和5.04%，ZXG01243 和ZXG00485 棕櫚酸含量偏低，分別為3.06%和2.73%；ZXG00485、ZXG00885、ZXG01558 硬脂酸含量偏高，為5.31%～5.89%，ZXG00194 和ZXG01286 硬脂酸含量偏低，分別為2.56%和2.53%。供試材料9 個(gè)性狀中油酸含量變異系數(shù)最大，為39.90%。棕櫚酸含量、硬脂酸含量、種子寬度、種子厚度、百粒重變異系數(shù)次之，為14.15%～31.40%。亞油酸含量變異系數(shù)最小，為5.74%。由此可見，不同西瓜品種性狀具有不同程度差異，表現(xiàn)豐富的遺傳變異性。

相關(guān)性分析表明（見表3），9 個(gè)性狀間部分性狀相關(guān)性達(dá)極顯著水平。亞油酸含量與油酸、棕櫚酸、硬脂酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與種子厚度呈顯著負(fù)相關(guān)；油酸含量與棕櫚酸、硬脂酸含量呈極顯著正相關(guān)；硬脂酸含量與種子厚度、百粒重呈極顯著正相關(guān)；種子長度與種子寬度、百粒重呈極顯著正相關(guān)；種子寬度與百粒重呈極顯著正相關(guān)；種子厚度與百粒重呈極顯著正相關(guān)。

表2 不同西瓜品種種子主要性狀及含量Table 2 Main traits and contents of seeds of different watermelon varieties

表3 供試西瓜品種種子相關(guān)性狀間相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of seed-related traits of watermelon varieties

2.2 主成分分析

分析西瓜籽9 個(gè)性狀主成分，以特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn)提取主成分，前3 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)85.34%，可代表9個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)絕大部分信息，可用這3個(gè)主成分概括分析20份供試材料相關(guān)性狀（見表4）。

表4 西瓜種子相關(guān)性狀主成分貢獻(xiàn)率Table 4 Principal components contribution rates of watermelon seed

由表4 可知，第1 主成分特征值為3.67，方差百分比為40.79%，第1主成分主要由油酸含量、硬脂酸含量、百粒重構(gòu)成，可概括為品質(zhì)因子。第2主成分貢獻(xiàn)率為30.63%，主要由種子長度、種子寬度、亞油酸含量構(gòu)成，可概括為種子形態(tài)因子，這一主成分特征向量中油酸含量和棕櫚酸含量負(fù)向系數(shù)較大，說明種子尺寸與脂肪酸含量呈一定程度負(fù)相關(guān)。第3主成分貢獻(xiàn)率為13.92%，主要總油含量構(gòu)成，在這一主成分特征向量中種子長度和種子寬度負(fù)向系數(shù)較大，說明總油含量與種子尺寸呈一定程度負(fù)相關(guān)。

2.3 聚類分析

在歐氏距離水平上采用離差平方和法對供試品種的9個(gè)性狀作聚類分析，20份西瓜品種在歐氏距離為10.05時(shí)可劃分為4個(gè)類群（見圖2），第一類群包含7個(gè)品種，第二類群包含9個(gè)品種，第三類群包含3 個(gè)品種（ZXG01211、LSW-177、W1-54），第四類群包含1個(gè)品種（ZXG01558）。

由表5可知，第一類群總體籽粒較大，棕櫚酸含量低、亞油酸、油酸及硬脂酸含量適中，百粒重較大，總油含量高。屬于品質(zhì)中等，籽粒大類型?？杉?xì)分為兩個(gè)亞類，第一亞類（ZXG00980、ZXG00170、PI296341）與 第 二 亞 類（ZXG00485、ZXG01525、ZXG00885、ZXG00987）相比，總油含量及亞油酸含量相對較高，油酸含量、籽粒尺寸及百粒重相對較小。

第二類群總體亞油酸含量高，油酸、棕櫚酸及硬脂酸含量較低，籽粒尺寸及百粒重適中。屬于品質(zhì)高，籽粒中等類型?？杉?xì)分為兩個(gè)亞類，第一亞類（ZXG01286、ZXG00194、ZXG00191）與第 二 亞 類（ZXG00385、ZXG01269、ZXG01243、ZXG00927、ZXG00027、W1-64）相比，亞油酸含量相對較高，其他脂肪酸含量、籽粒尺寸及百粒重相對較小。

第三類群總體脂肪酸含量相對較高，總油含量適中，籽粒尺寸相對較小，百粒重小。屬于品質(zhì)高，籽粒小類型。

第四類群總體油酸、棕櫚酸及硬脂酸含量高，亞油酸含量及總油含量低，籽粒尺寸相對較大，百粒重大。屬于品質(zhì)低，籽粒大類型。

表5 各類群種子相關(guān)性狀平均值和標(biāo)準(zhǔn)差Table5 Mean and SD of relevant traits of various seed groups

2.4 不同含油量西瓜種子貯藏細(xì)胞內(nèi)油體顯微觀察

由圖3可知，西瓜種子子葉貯藏細(xì)胞內(nèi)油體形狀差異明顯，大多數(shù)為橢球形及不規(guī)則形狀，球形較少。高含油量品種ZXG00885單個(gè)子葉細(xì)胞內(nèi)蛋白體數(shù)量少，油體數(shù)量多且油體體積較大，大油體分布于細(xì)胞中央，小油體主要環(huán)繞在細(xì)胞壁周圍，或成為大油體之間填充。相對而言，低含油量品種ZXG01286 單個(gè)子葉細(xì)胞內(nèi)蛋白體數(shù)量多，油體數(shù)量少且油體體積較小，油體分布相對均勻，細(xì)胞壁周圍幾乎無小油體環(huán)繞。

3 討 論

3.1 遺傳變異性及相關(guān)性分析

不同性狀在遺傳過程中產(chǎn)生差異，變異系數(shù)反映性狀變異范圍，即變異系數(shù)越大性狀變異范圍越大[12]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，20份西瓜供試品種油酸含量變異系數(shù)最大，遺傳穩(wěn)定性相對較低，與Primomo 等在大豆中對油酸的研究結(jié)果一致[13-14]?？傆秃孔儺惣皝営退岷孔儺愝^小，變異系數(shù)分別為9.53%和5.74%，說明本研究供試材料中缺乏高含油量和高亞油酸含量種質(zhì)資源。百粒重和硬脂酸含量變異程度較高，說明本研究西瓜供試品種遺傳基礎(chǔ)豐富且類型多變，各性狀在不同西瓜品種間遺傳差異是品種選育關(guān)鍵。

相關(guān)性分析可知，亞油酸含量與油酸、棕櫚酸及硬脂酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，油酸含量與棕櫚酸含量呈極顯著正相關(guān)，與Meru 等研究結(jié)果一致[10]。Oyulu 等對西瓜籽脂肪酸研究結(jié)果表明，油酸含量與棕櫚酸含量呈極顯著正相關(guān)[15]。由此可見，可通過降低其他脂肪酸含量間接提高亞油酸含量的方法，改良西瓜籽油中脂肪酸組分配比。百粒重與種子長度、種子寬度及種子厚度呈極顯著正相關(guān)，與高美玲等研究結(jié)果一致[16]。

3.2 主成分分析

亞油酸具有預(yù)防糖尿病，減少血液中膽固醇，防止動(dòng)脈硬化和抑制癌癥作用[17-18]，油酸被營養(yǎng)學(xué)家稱之為“安全脂肪酸”，具有降低血液中有害膽固醇含量作用，且降低罹患心血管疾病和Ⅱ型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)[19-20]。主成分分析中，第1 主成分主要與油酸含量和硬脂酸含量有關(guān)，第2主成分主要與亞油酸含量和種子尺寸有關(guān)，第3主成分主要與總油含量有關(guān)。第1 主成分越大，油酸含量越高，亞油酸含量越低。因此，第1 主成分取中間值時(shí)，可平衡二者關(guān)系。本試驗(yàn)研究表明，第2主成分值越大，亞油酸含量和總油含量越高，種子越大。第3主成分值越大，總油含量越高，種子越小，說明種子尺寸影響總油含量高低，因此在選育籽用西瓜品種時(shí)不必過度追求大種仁。從選育高油分、高亞油酸含量西瓜品種角度考慮，第2主成分值越大越好，選用性狀較好的親本材料應(yīng)綜合考慮各性狀及主成分間的互補(bǔ)。

3.3 聚類分析

聚類分析應(yīng)用于多種作物種質(zhì)資源分類等方面，可科學(xué)評價(jià)材料優(yōu)劣[21-22]。通過聚類分析既可看出類群間相互關(guān)系，又可了解類群內(nèi)品系親疏遠(yuǎn)近[23]。本研究根據(jù)西瓜籽脂肪酸組分及種子尺寸相關(guān)性狀將20 份不同西瓜材料聚類為4 個(gè)類群，第一類群品質(zhì)中等，籽粒大，該類群包含7 個(gè)品種，占總數(shù)35.00%；第二類群品質(zhì)高，籽粒中等，該類群包含9 個(gè)品種，占總數(shù)45.00%；第三類群品質(zhì)高，籽粒小，該類群包含3個(gè)品種，占總數(shù)15.00%；第四類群品質(zhì)低，籽粒大，該類群包含1個(gè)品種，占總數(shù)5.00%。第二類群和第三類群可考慮作為高含油量、高亞油酸含量的優(yōu)良品種。因此，在西瓜品種選擇與利用上，應(yīng)深入研究和綜合評價(jià)各類群中綜合性狀優(yōu)良的品種，為西瓜品種推廣和選育提供優(yōu)異種質(zhì)資源。

3.4 油體形態(tài)顯微觀察及差異分析

植物種子中油體尺寸、油質(zhì)蛋白與含油量關(guān)系一直備受關(guān)注。Siloto 等研究表明，油質(zhì)蛋白積累情況決定種子中油體尺寸，且油體尺寸差異影響種子內(nèi)脂肪酸累積[24]。本試驗(yàn)對ZXG00885（高含油量）和ZXG01286（低含油量）種子子葉細(xì)胞內(nèi)油體作顯微觀察。結(jié)果表明，油體大多數(shù)為橢球形及不規(guī)則形狀，球形較少，油體排列分布密集，多數(shù)油體體積較大，與陳虹等在核桃種子油體特征差異分析的研究結(jié)果一致[25]。西瓜高油與低油品種子葉貯藏細(xì)胞內(nèi)油體形態(tài)無明顯差異，但數(shù)量和在細(xì)胞內(nèi)分布差異明顯。高油品種較低油品種相比單個(gè)子葉細(xì)胞內(nèi)蛋白體數(shù)量少，油體數(shù)量多且油體體積較大，與董勁松等研究結(jié)果相類似[26]。高油品種子葉細(xì)胞內(nèi)大油體分布于細(xì)胞中央，小油體主要環(huán)繞在細(xì)胞壁周圍，而低油品種子葉細(xì)胞內(nèi)油體分布相對均勻?？梢娪腕w數(shù)量、尺寸和細(xì)胞內(nèi)分布可能是影響種子含油量的重要因素。通過顯微觀察西瓜種子子葉細(xì)胞內(nèi)油體特征可作為一種判斷西瓜品種含油量的方法，有效節(jié)省時(shí)間成本，提高育種效率。因此，該方法在西瓜品質(zhì)育種中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究以20 份西瓜種質(zhì)資源為材料，分析西瓜籽脂肪酸組分及種子尺寸相關(guān)性狀，結(jié)果表明，不同材料中脂肪酸含量存在較大差異。亞油酸含量與油酸、棕櫚酸、硬脂酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；油酸含量與棕櫚酸、硬脂酸含量呈極顯著正相關(guān)。油體顯微觀察發(fā)現(xiàn)不同含油量西瓜品種子葉細(xì)胞內(nèi)油體形態(tài)和數(shù)量存在差異，上述研究結(jié)果可為籽用西瓜品質(zhì)育種提供理論依據(jù)。