在線自由基清除法引導(dǎo)具有抗氧化活力蛋白組分分離純化

張宏偉 ，郭 陽(yáng)，孫義玄，包怡紅*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

在線自由基清除法是靈敏、高效且簡(jiǎn)單的檢測(cè)抗氧化組分方法，通過(guò)分析色譜柱分離得到樣品組分測(cè)定在線自由基清除能力，確定具有自由基清除能力的組分[1-2]。該方法應(yīng)用于杜鵑花葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)、火龍果中酚類(lèi)抗氧化劑快速檢測(cè)，咖啡加工過(guò)程中抗氧化物質(zhì)變化和萬(wàn)壽菊花抗氧化成分分析等研究，從復(fù)雜天然物質(zhì)中高效篩選具有抗氧化能力物質(zhì)，并提高具有抗氧化活力蛋白分離純化效率，解決傳統(tǒng)分離純化過(guò)程需要長(zhǎng)時(shí)間確定并優(yōu)化填料型號(hào)、填充高度和分離純化條件等問(wèn)題[3-4]。

松仁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，蛋白含量14%～20%，脂肪含量31%～68%[5-6]。不同來(lái)源松子成分差異較大，取決于亞種之間差異及地理、氣候條件[7]。松仁富含油脂，保健功能良好、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，可生產(chǎn)高附加值松仁油，但榨油副產(chǎn)物松仁粕未得到充分利用，造成松仁蛋白資源浪費(fèi)。松仁蛋白具有抗氧化活力[8]，目前多數(shù)研究關(guān)注松仁中抗氧化肽和松仁蛋白水解后制備抗氧化肽[9-10]，而對(duì)具有抗氧化活力松仁蛋白研究較少。

本研究使用在線ABTS自由基清除法引導(dǎo)松仁粕中具有抗氧化活力蛋白組分分離純化。采用陰離子交換層析分離純化松仁粕水提物，運(yùn)用在線ABTS 自由基清除法分析餾分，快速篩選具有抗氧化能力蛋白餾分，根據(jù)分析結(jié)果選擇合適分離純化填料、柱子和收集策略，分子篩純化餾分，獲得具有較強(qiáng)抗氧化活力松仁蛋白組分。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

低溫壓榨紅松松仁粕，購(gòu)自黑龍江省宏泰松仁有限責(zé)任公司，使用自封袋分裝后于-18 ℃保存。松仁粕中粗蛋白含量33.5%，碳水化合物含量32.5%，粗脂肪含量9.2%。

石油醚（沸程30～60 ℃）、硫酸、苯酚、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、氯化鈉、磷酸等試劑，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 松仁粕水溶性蛋白提取

采用高速勻漿水提取法提取脫脂松仁粕中水溶性蛋白。采用索氏抽提方法利用石油醚對(duì)松仁粕脫脂。在水溫35 ℃條件下，按照液料比43.23 mL·g-1、20 000 r·min-1高速勻漿提取170 s，提取物在4 ℃條件下3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，濾紙過(guò)濾后得到松仁粕水溶性蛋白提取物。

1.2.2 陰離子交換分離

使用DEAE-Bestarose FF 填料對(duì)松仁粕水溶性蛋白提取物分離純化。柱體積約130 mL，柱子內(nèi)徑2.6 cm，上樣濃度10 mg·mL-1，上樣量0.4 柱體積（CV），上樣流速1 CV·h-1，洗脫流速3.5 CV·h-1，每1 min 收集1 管餾分。采用階梯式梯度洗脫，A 相為蒸餾水，B 相為0.5 mol·L-1NaCl 溶液，0%B洗脫1 CV，20%B 洗脫1 CV，40%B 洗脫1 CV，60%B 洗脫1 CV，100%B 洗脫1 CV，0%B平衡1 CV[11]。使用280 nm 波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)蛋白洗脫情況，電導(dǎo)率輔助監(jiān)測(cè)洗脫液電導(dǎo)率變化。

1.2.3 餾分分析

考馬氏亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量[12]。硫酸苯酚法測(cè)定碳水化合物含量[13]。

1.2.4 同步測(cè)定各組分分子質(zhì)量和ABTS自由基清除能力

具體方法基于Agilent 公司1100 液相色譜系統(tǒng)和自制反應(yīng)環(huán)（聚四氟乙烯材質(zhì)），系統(tǒng)配置如圖1 所 示[3,14-15]。

采用分子排阻色譜法（SEC）測(cè)定樣品中各組分分子質(zhì)量分布，使用TOSOH 公司G2000PWxl 排阻色譜柱分離，流動(dòng)相為0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液pH 6.8，流速1 mL·min-1，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量100 μL。樣品中蛋白濃度為1 mg·mL-1，過(guò)0.45 μm 纖維素膜后進(jìn)樣。吸取40 μL混合蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品溶于200 μL流動(dòng)相中作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品。

ABTS 自由基溶液配配置：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.97 mg ABTS，加入1 L pH 7.4 磷酸鹽緩沖液中（含8.00 g NaCl，1.40 g Na2HPO4，0.15 g KCl，0.27 g KH2PO4），加入2.00 g MnO2后于暗處室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10 min，生成綠色ABTS 自由基。1 000 g 離心5 min 后取上清過(guò)0.22 μm 尼龍濾膜，裝入棕色瓶中冷藏待用，4 ℃條件下至少可穩(wěn)定使用24 h。1 號(hào)紫外檢測(cè)器流出液進(jìn)入自制反應(yīng)環(huán)，衍生溫度35 ℃，ABTS自由基溶液泵入速度0.8 mL·min-1，使用2 號(hào)紫外檢測(cè)器檢測(cè)衍生系統(tǒng)流出液在414 nm 波長(zhǎng)下色譜圖。自制反應(yīng)環(huán)體積0.5 mL，通過(guò)反應(yīng)環(huán)液體流速為1.8 mL·min-1，造成延遲時(shí)間16.67 s。

1.2.5 分子篩分離純化

使用Sephacryl S-100 HR 填料對(duì)陰離子交換提取物作分子排阻純化。柱體積約80 mL，上樣量5 mL，使用0.1 mol·L-1NaCl 溶液洗脫，流速2 mL·min-1，每2 min收集1管餾分[16]。使用280 nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)蛋白洗脫情況。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測(cè)定

參照Re 和Fellegrini 等方法[17-18]，按實(shí)際情況適當(dāng)修改。使用20 mmol·L-1pH 4.5醋酸鈉緩沖溶液配制7 mmol·L-1ABTS儲(chǔ)備液，向ABTS 儲(chǔ)備液加入終濃度2.45 mmol·L-1過(guò)硫酸鉀，混合均勻后置于室溫黑暗處反應(yīng)12～16 h 制備ABTS 自由基儲(chǔ)備溶液。使用前將ABTS自由基儲(chǔ)備溶液20 mmol·L-1用pH 4.5 醋酸鈉緩沖溶液稀釋至734 nm 處吸光度為0.7±0.02。取3 mL 該溶液與100 μL 待測(cè)樣品充分混合，避光反應(yīng)6 min，以水為空白，在734 nm處測(cè)定吸光度值。按照公式（1）計(jì)算樣品ABTS 自由基清除率。

1.2.7 鐵離子還原能力測(cè)定

FRAP法參照Benzie等方法適當(dāng)修改[19-20]，F(xiàn)RAP試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配，由2.5 mL 10 mmol·L-1TPTZ，25 mL 0.3 mol·L-1pH 3.6 醋酸鹽緩沖液和2.5 mL 20 mmol·L-1FeCl3溶液混合而成。以蒸餾水作空白，取100 μL樣品加入3 mL FRAP試劑混合均勻，在37 ℃下反應(yīng)5 min后于593 nm處測(cè)定吸光值，

以 濃 度 為800、600、400、200、100 和50 μmol·L-1FeSO4溶液為標(biāo)準(zhǔn)液替代樣品，反應(yīng)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以FeSO4濃度為X 軸，以對(duì)應(yīng)吸光度值為Y 軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.6455x+0.0947（R2=0.9992）。樣品抗氧化活性（FRAP value）以達(dá)到同樣吸光度值所需FeSO4毫摩爾數(shù)表示。FRAP 值越大，說(shuō)明樣品抗氧化性越強(qiáng)。

1.2.8 鐵離子螯合能力測(cè)定

鐵離子螯合法參照Wong 等方法適當(dāng)修改[21]。取1 mL 20 μmol·L-1硫酸亞鐵與1 mL 500 μmol·L-1Ferrozine 混合均勻后再加入0.5 mL 樣品混合均勻，以蒸餾水作空白，于562 nm處測(cè)定吸光值，每個(gè)樣3組平行試驗(yàn)，按公式（2）計(jì)算鐵離子螯合能力。

式中，A-空白溶液吸光值；A1-反應(yīng)后樣品溶液吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰離子交換分離純化結(jié)果

由圖2 可知，在0～0.5 mol·L-1NaCl 洗脫條件下，松仁粕水溶性蛋白提取物被分為8個(gè)大峰，水洗脫階段，中性組分被洗脫形成1 號(hào)和2 號(hào)大峰；在20%B 洗脫階段，被洗脫組分形成3 號(hào)和4 號(hào)大峰；在40% B 洗脫階段，被洗脫組分形成5 號(hào)和6 號(hào)大峰；在60% B 洗脫階段，被洗脫組分形成7 號(hào)峰；在100% B 洗脫階段，被洗脫組分形成8號(hào)峰。

Zeta電位試驗(yàn)結(jié)果表明，松仁粕水溶性蛋白提取物電勢(shì)為負(fù)值，說(shuō)明松仁粕水溶性蛋白帶負(fù)電荷，因此運(yùn)用DEAE-Bestarose FF 填料作分離純化。洗脫圖譜表明，該填料可有效分離松仁粕水溶性蛋白提取物。

2.2 陰離子交換餾分組成分析結(jié)果

以1 管·min-1速率收集各餾分，測(cè)定每管餾分蛋白和碳水化合物，餾分分析見(jiàn)圖3?？芍?，1 號(hào)峰和2號(hào)峰碳水化合物含量較高，隨著洗脫液離子強(qiáng)度增大，洗脫下的峰中碳水化合物含量逐步降低，其中6、7 和8 號(hào)峰蛋白含量相對(duì)較高?？芍扇势芍兴苄缘鞍捉M分主要存在于較高離子濃度洗脫餾分中，研究重點(diǎn)為3～8號(hào)峰。

2.3 各餾分分子質(zhì)量分布和具有ABTS 自由基清除能力組分分析

根據(jù)2.2結(jié)果，將各峰蛋白濃度最大餾分分別命名為1～8 號(hào)餾分，分析其在線ABTS 自由基清除能力，結(jié)果如圖4～7 所示。a 圖譜為在線ABTS 自由基清除能力圖譜，具有ABTS自由基清除能力物質(zhì)在414 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)圖譜上出現(xiàn)負(fù)峰，負(fù)峰相對(duì)峰高或面積越大，代表ABTS自由基清除能力相對(duì)較強(qiáng)。b圖譜為相應(yīng)蛋白組分分子質(zhì)量分布圖譜。

如圖4 所示，1 號(hào)餾分幾乎無(wú)ABTS 自由基清除能力，因此不作進(jìn)一步研究。2 號(hào)餾分在10～13 min ABTS自由基清除圖譜中有3個(gè)具有ABTS自由基清除能力組分。第1個(gè)具有抗氧化活力組分峰時(shí)間10 min，其對(duì)應(yīng)組分分子質(zhì)量10 ku，該組分在280 nm 無(wú)紫外吸收，非蛋白或肽類(lèi)，具體成分有待后續(xù)研究。11 min 后有2 個(gè)具有ABTS 自由基清除能力組分，由于本研究所用排阻色譜柱分離極限為5～300 ku，峰時(shí)間大于11 min物質(zhì)在分離極限之外，因此僅通過(guò)其峰時(shí)間和具有280 nm紫外吸收判斷這些物質(zhì)是分子質(zhì)量低于6 ku 含氨基酸或肽鍵物質(zhì)，松仁水溶性蛋白中分子質(zhì)量最小為松仁2S 清蛋白，分子質(zhì)量為7 ku，因此這些組分可能為肽類(lèi)。本研究分離純化目標(biāo)為蛋白，因此不作進(jìn)一步研究。

如圖5所示，3號(hào)餾分基本無(wú)ABTS自由基清除能力，因此不作后續(xù)研究。4 號(hào)餾分在6～11 min-ABTS自由基清除圖譜中有2個(gè)相對(duì)較強(qiáng)具有ABTS自由基清除能力組分，第1個(gè)具有抗氧化活力組分峰時(shí)間在7 min，在280 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)排阻色譜圖中無(wú)對(duì)應(yīng)峰，應(yīng)不是蛋白或肽類(lèi)，具體成分有待后續(xù)研究。第2 個(gè)具有抗氧化活力組分峰時(shí)間10.5 min，峰展較寬，280 nm波長(zhǎng)檢測(cè)排阻色譜圖中對(duì)應(yīng)兩個(gè)峰，通過(guò)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知，峰時(shí)間為9.98 min 組分其分子質(zhì)量為14.7 ku，通過(guò)分子質(zhì)量分析，為松仁2S 清蛋白二聚體；峰時(shí)間為10.76 min組分其分子質(zhì)量為7.2 ku，通過(guò)分子質(zhì)量分析，為松仁2S清蛋白。通過(guò)ABTS自由基清除峰高比較，松仁2S清蛋白ABTS自由基清除能力強(qiáng)于松仁2S清蛋白二聚體，對(duì)松仁2S清蛋白進(jìn)一步分離純化。

如圖6所示，5號(hào)餾分基本無(wú)ABTS自由基清除能力，因此不作后續(xù)研究。6號(hào)餾分中存在2個(gè)具有相對(duì)較強(qiáng)ABTS 自由基清除能力蛋白組分。通過(guò)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知，峰時(shí)間為5.89 min大峰，分子質(zhì)量為203 ku，通過(guò)分子質(zhì)量分析，為松仁7S球蛋白三聚體。峰時(shí)間為10.76 min小峰，分子質(zhì)量為7.2 ku，通過(guò)分子質(zhì)量分析，為松仁2S清蛋白。

在ABTS 自由基清除圖譜中，峰時(shí)間6 min 清除峰峰展較大，因多個(gè)分子質(zhì)量相近組分所致，但280 nm 紫外圖譜對(duì)應(yīng)位置僅1 個(gè)峰。因此，在其后還存在具有ABTS 自由基清除能力未知組分。在使用分子篩制備該組分時(shí)，為提高純化產(chǎn)物蛋白含量和純度，僅收集峰前半部分，峰后半部分可用于下次分子篩純化。后面峰時(shí)間為10.76 和11.24 min 組分分子質(zhì)量相近，峰時(shí)間為10.76 min組分為松仁2S 清蛋白，為目標(biāo)組分，11.24 min峰組分分子質(zhì)量低于本研究所用排阻色譜柱分離范圍，為分子質(zhì)量低于6 ku 小肽。由于本研究主要純化具有抗氧化活力蛋白，需重點(diǎn)考慮如何分離分子質(zhì)量7.2 ku 松仁2S 清蛋白與分子質(zhì)量低于6 ku 小肽。常用Superdex 75 填料分離范圍3～70 ku，Sephacryl S-100 HR 填料分離范圍1～100 ku，Sephacryl S-200 HR 填料分離范圍5～250 ku，為兼顧松仁7S球蛋白三聚體和松仁2S清蛋白分離，選擇Sephacryl S-100 HR填料用于后續(xù)分離純化。

分子質(zhì)量為7.2 ku 松仁2S 清蛋白和分子質(zhì)量低于6 ku 小肽分子質(zhì)量相差較小，需較多分離塔板才能有效分離，在分離填料粒徑一定條件下僅依靠較長(zhǎng)分離距離保證較多分離塔板數(shù)。本研究使用直徑為16 mm XK16/60 柱裝入Sephacryl S-100 HR填料分子篩純化，高徑比設(shè)定為25∶1。由于松仁2S 清蛋白和分子質(zhì)量低于6 ku 小肽分子質(zhì)量相差較小，為提高純化產(chǎn)物蛋白含量和純度，僅收集峰前半部分。

如圖7所示，7和8號(hào)餾分具有相對(duì)較弱ABTS自由基清除能力。7號(hào)餾分有2個(gè)具有一定ABTS 自由基清除能力組分，但280 nm 紫外檢測(cè)圖譜上無(wú)對(duì)應(yīng)峰，因此不作后續(xù)研究。8號(hào)餾分有2個(gè)具有一定ABTS自由基清除能力組分，ABTS自由基清除圖譜中峰時(shí)間12 min ABTS 自由基清除峰有對(duì)應(yīng)具有280 nm 紫外吸收組分，由于該組分ABTS 自由基清除能力較弱，且可能為肽類(lèi)（分子質(zhì)量低于5 ku），因此不作后續(xù)研究。綜上，2、4和6號(hào)餾分中存在具有較強(qiáng)ABTS自由基清除能力組分，由于2 號(hào)餾分中具有較強(qiáng)ABTS 自由基清除能力組分為肽類(lèi)和未知組分，非蛋白組分，因此不對(duì)2號(hào)餾分作下一步純化研究。4 號(hào)餾分中具有較強(qiáng)ABTS 自由基清除能力蛋白組分為松仁2S 清蛋白和松仁2S清蛋白二聚體，且松仁2S清蛋白ABTS自由基清除能力強(qiáng)于松仁2S清蛋白二聚體，因此松仁2S清蛋白為分離純化目標(biāo)物質(zhì)。6號(hào)餾分中含有松仁7S球蛋白三聚體和松仁2S 清蛋白，對(duì)該組分進(jìn)一步純化可獲得松仁7S 球蛋白三聚體和松仁2S 清蛋白，選擇6號(hào)餾分進(jìn)一步純化。

2.4 分子篩分離純化結(jié)果分析

將6號(hào)餾分凍干后，配置成蛋白濃度5 mg·mL-1樣品液，每次上樣125 mg蛋白，按照2.3中確定分離純化方法，使用Sephacryl S-100 HR分子篩填料分離純化，結(jié)果如圖8所示。

6號(hào)餾分純化色譜圖中現(xiàn)3個(gè)峰，將1.3 CV洗脫峰命名為6#1p，將3 CV 洗脫峰命名為6#2p，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)2個(gè)峰作分子質(zhì)量分析，6#1p分子質(zhì)量約為189 ku，為松仁7S球蛋白三聚體，6#2p組分分子質(zhì)量為8.1 ku，為松仁2S清蛋白。4.4 CV洗脫峰峰面積相對(duì)較小，且分子質(zhì)量低于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，無(wú)法準(zhǔn)確確定其分子質(zhì)量，分子質(zhì)量應(yīng)低于6 ku，為肽類(lèi)，因此不作進(jìn)一步研究。

2.5 分子篩分離純化獲得蛋白組分分析

將得到收集液透析處理3次后凍干，6#1p中蛋白含量為86.2%, 6#2p 中蛋白含量為84.5%。將兩種蛋白分別配置成蛋白含量為1 mg·mL-1溶液后作排阻色譜分析。

圖9a 為6#1p 樣品排阻色譜圖，由圖可知分子篩分離純化效果良好，主峰占總峰面積99.5%，可認(rèn)為獲得具有單一組分松仁7S 球蛋白三聚體。圖9b 為6#2p 樣品排阻色譜圖，由圖可知分子篩分離純化效果較好，雖含其他蛋白組分，但是主峰占總峰面積96.5%，可認(rèn)為獲得較純凈松仁2S清蛋白。

將松仁粕水溶性蛋白提取物、松仁7S 球蛋白三聚體和松仁2S 清蛋白分別配置成蛋白含量1 mg·mL-1溶液，測(cè)定抗氧化能力，測(cè)定結(jié)果列于表1。

結(jié)果表明，分離純化得到松仁7S 球蛋白三聚體和松仁2S 清蛋白均具有一定抗氧化活力，且松仁7S 球蛋白三聚體抗氧化活性強(qiáng)于松仁2S 清蛋白。分離純化得到兩種蛋白ABTS自由基清除率和鐵離子還原能力均低于原始松仁粕水溶性蛋白提取物，除提取過(guò)程中損失活力外，松仁粕中還具有抗氧化活力非蛋白組分，導(dǎo)致純化后蛋白組分較原始松仁粕水溶性蛋白提取物抗氧化活力降低。

表1 抗氧化活力測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of antioxidant activity determination

3 討論與結(jié)論

3.1 抗氧化能力測(cè)定方法選擇

測(cè)定抗氧化能力方法較多，但用于在線測(cè)定抗氧化能力方法較少，在線測(cè)定抗氧化能力要求反應(yīng)速度快、靈敏度高、耐受鹽和有機(jī)相影響[3,20]。這些方法中DPPH 自由基清除法和ABTS 自由基清除法比較適合在線測(cè)定抗氧化能力[2-3]。

DPPH自由基清除法反應(yīng)速率較快，特別適合高有機(jī)相環(huán)境，反應(yīng)幾乎不受鹽離子影響，可使用梯度洗脫方法分析，但無(wú)法在有機(jī)相濃度低于20%體系中穩(wěn)定反應(yīng)，使用范圍受限[3]。ABTS 自由基清除法反應(yīng)速率高于DPPH自由基清除法、可在純水、pH 3～7 鹽溶液和純有機(jī)溶劑環(huán)境中反應(yīng)，可使用梯度洗脫方法分析，但蛋白在高濃度有機(jī)相中不穩(wěn)定，因此選擇ABTS自由基清除法為測(cè)試方法[2]。

ABTS 自由基在414 nm 吸收強(qiáng)度高于734 nm吸收強(qiáng)度，為排除干擾傳統(tǒng)測(cè)試方法常用734 nm測(cè)定ABTS 自由基清除能力[22-23]。本研究采用色譜柱分離組分，有助于減少干擾。為提高反應(yīng)靈敏度，本研究選擇414 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

3.2 在線自由基清除法引導(dǎo)與傳統(tǒng)分離純化方法比較

分離純化是天然物質(zhì)利用一種常見(jiàn)手段。經(jīng)典分離純化通常使用離子交換層析初步純化獲得餾分，采用各種試劑盒或者經(jīng)典分析方法對(duì)餾分分析，發(fā)現(xiàn)功能性餾分后，再對(duì)該餾分進(jìn)一步分離純化。由于天然物質(zhì)成分復(fù)雜，傳統(tǒng)方法難以有效辨別餾分中具有活性具體組分，僅依靠經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)后續(xù)試驗(yàn)方法或通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)方法驗(yàn)證和調(diào)整，影響后續(xù)分離純化效率。

本研究中，2、4和6號(hào)餾分中均含有具有較強(qiáng)ABTS 自由基清除能力組分，如果采用傳統(tǒng)抗氧化分析方法，需對(duì)2、4 和6 號(hào)餾分進(jìn)一步精細(xì)純化分析。2 號(hào)餾分中具有ABTS 自由基清除能力組分為肽類(lèi)和未知成分，并非本研究純化對(duì)象，如按照傳統(tǒng)方法測(cè)定抗氧化活力后開(kāi)展后續(xù)純化研究，通過(guò)分離純化僅能得到肽類(lèi)，由于無(wú)法收集具有抗氧化活力的未知組分，帶來(lái)純化產(chǎn)物抗氧化活力的較大損失，這種活力損失原因可能需反復(fù)試驗(yàn)才能找到，影響研究效率。

4 號(hào)餾分中具有ABTS 自由基清除能力組分為松仁2S清蛋白和松仁2S清蛋白二聚體，其中松仁2S清蛋白ABTS自由基清除能力更強(qiáng)，是下一步純化目標(biāo)，但在6 號(hào)餾分中也含有較多松仁2S清蛋白，從分離效率考慮不對(duì)4號(hào)餾分作后續(xù)純化。如按照傳統(tǒng)方法后續(xù)純化，通過(guò)嘗試不同分離范圍填料獲得較純松仁2S 清蛋白，但在6 號(hào)餾分完成后續(xù)純化研究后發(fā)現(xiàn)，4號(hào)餾分研究應(yīng)用價(jià)值有限。

6 號(hào)餾分中具有ABTS 自由基清除能力組分為松仁7S 球蛋白三聚體和松仁2S 清蛋白。通過(guò)ABTS 自由基清除圖譜分析，6 號(hào)餾分中含有松仁7S 球蛋白三聚體分子質(zhì)量相近未知組分，松仁2S清蛋白與附近小肽分子質(zhì)量較為接近，在后續(xù)純化過(guò)程中需考慮這2個(gè)干擾因素。如按照傳統(tǒng)方法后續(xù)純化研究，為獲得較高純度松仁7S 球蛋白三聚體和松仁2S 清蛋白，可能需探索填料種類(lèi)、分離柱長(zhǎng)度和收集位置等因素。

綜上所述，本研究以松仁粕水溶性蛋白中具有抗氧化活力蛋白組分分離純化過(guò)程為例，應(yīng)用排阻色譜結(jié)合在線ABTS自由基清除法直接獲得目標(biāo)組分ABTS自由基清除能力、分子質(zhì)量和目標(biāo)產(chǎn)物周?chē)s質(zhì)信息，依據(jù)該信息設(shè)計(jì)后續(xù)分離純化方法，最終獲得具有較強(qiáng)抗氧化活力松仁7S 球蛋白三聚體（純度99.5%）和松仁2S 清蛋白（純度96.5%）組分。將以往最短5～10 d 分離純化探索時(shí)間縮短為2～3 d，提高研究效率。排阻色譜結(jié)合在線ABTS自由基清除能力測(cè)定法可有效引導(dǎo)具有抗氧化活力蛋白組分分離純化過(guò)程，提高后續(xù)精細(xì)分離純化效率。