多環(huán)境下水稻株型相關(guān)性狀QTL解析

劉化龍，楊洛淼，徐善斌，劉華東，鄒德堂

（寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

水稻是世界重要糧食作物，理想株型可促進(jìn)水稻充分利用光合，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和籽粒產(chǎn)量形成具有重要作用。水稻株型涉及分蘗數(shù)、分蘗角度、株高等指標(biāo)。株高決定水稻生物量和收獲指數(shù)[1]，較高的株高改善水稻通風(fēng)和葉片光照條件，但易引起倒伏，反之則降低光合效率[2]。分蘗形態(tài)（分蘗數(shù)、分蘗夾角等）影響水稻生長(zhǎng)空間、光合作用及產(chǎn)量，且受環(huán)境影響較大。因此，水稻株型構(gòu)成因素需達(dá)到平衡點(diǎn)才可保障產(chǎn)量潛力，發(fā)掘具有攜帶優(yōu)異株型遺傳位點(diǎn)的水稻株型育種工作具有重要意義。

水稻株高是受多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，目前已有1 000多個(gè)和株高相關(guān)的QTL被報(bào)道，已克隆株高基因超過(guò)100 個(gè)。分蘗角度既受主效基因調(diào)控，也受微效多基因調(diào)控，在植物數(shù)量遺傳研究中，大量和分蘗角度有關(guān)的主效基因被報(bào)道。la是首個(gè)被報(bào)道與水稻分蘗夾角有關(guān)的基因[3]，隨后又報(bào)道有er等基因[4]。與分蘗數(shù)相關(guān)基因目前已克隆不足10個(gè)，MOC1是單蘗基因[5]，而TAD1與MOC1共表達(dá)，促進(jìn)分蘗發(fā)生[6]，另外，D27、D10和D17參與獨(dú)腳金內(nèi)酯合成，D3 和HTD2 則通過(guò)對(duì)獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)組分作用促進(jìn)分蘗[7-8]。雖部分基因的功能得到驗(yàn)證，但水稻株型塑造需從株高、分蘗數(shù)、分蘗角度等性狀共同展開(kāi)，目前同時(shí)控制不同株型相關(guān)性狀表達(dá)的基因尚未克隆。因此需要不斷利用新材料挖掘具有連鎖遺傳的多效性區(qū)間，找到株型相關(guān)性狀的熱點(diǎn)區(qū)間，提高水稻株型改良效率。

水稻株型建成是多基因共同協(xié)作的結(jié)果[9]，利用遺傳背景一致材料對(duì)不同株型性狀同時(shí)開(kāi)展研究，可從遺傳圖譜上獲得多個(gè)連鎖位點(diǎn)。同時(shí)，多環(huán)境下表型鑒定有助于QTL 穩(wěn)定性檢測(cè)，對(duì)于水稻株型變異位點(diǎn)挖掘具有重要意義。因此，本研究利用重組自交系群體，通過(guò)多年多點(diǎn)環(huán)境鑒定，研究包括株高、分蘗數(shù)、分蘗角度在內(nèi)的3個(gè)株型相關(guān)性狀，并作QTL 和QTL×環(huán)境分析，通過(guò)性狀和遺傳相關(guān)聯(lián)合分析，旨在發(fā)掘同時(shí)控制多個(gè)株型相關(guān)性狀的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)，為水稻理想株型育種及相關(guān)位點(diǎn)精細(xì)定位奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 群體材料及遺傳圖譜

研究所選材料以空育131為父本，東農(nóng)422為母本，配制重組自交系，其中空育131株型為矮稈緊湊型，東農(nóng)422為高稈披散型。通過(guò)構(gòu)建和改良群體遺傳圖譜，最終有155個(gè)SSR標(biāo)記覆蓋該群體190個(gè)株系。

1.2 田間種植及調(diào)查

將群體及親本材料分別于2016、2017 和2018年在海南崖城南繁基地（Hainan）和哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地（Harbin）種植。共6 個(gè)環(huán)境，定義Hainan 三年試驗(yàn)環(huán)境為E1（2016 年夏）、E2（2017 年夏）和E3（2018 年夏），Harbin 三年試驗(yàn)環(huán)境為E4（2016 年春）、E5（2017 年春）和E6（2018年春）。其中，Hainan 采用水育苗移栽，Harbin 采用旱育苗移栽。插秧規(guī)格為行長(zhǎng)2 m，2 行區(qū)，株距10 cm，行距30 cm。水稻返青結(jié)束進(jìn)入分蘗期后，調(diào)查每個(gè)株系分蘗動(dòng)態(tài)及株高動(dòng)態(tài)，采用掛牌方式從每個(gè)株系中選取均勻一致的3 個(gè)植株掛牌，每隔1 周調(diào)查1 次分蘗數(shù)（Tillering number，TN）、分蘗角度（Tillering angle，TA）及株高（Plant height，PH），直至穗抽出后，停止調(diào)查，此時(shí)分蘗數(shù)、株高和分蘗夾角穩(wěn)定，最后1次調(diào)查數(shù)據(jù)用于分析。分蘗數(shù)以總分蘗計(jì)算，分蘗角度用量角器測(cè)量，測(cè)量選取同一株系中距離最遠(yuǎn)的兩個(gè)分蘗間夾角，測(cè)量角度除以2即為分蘗角；株高測(cè)量以根基部到主莖倒一葉葉尖距離為準(zhǔn)。

1.3 表型分析與統(tǒng)計(jì)

利用Sigmaplot 12.5 分析性狀相關(guān)性及描述性統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 18.0 軟件一般線性模型（GLM），以基因型和環(huán)境為固定因子，性狀為因變量作方差分析，作基因型方差（σ2G）、基因型×環(huán)境（σ2GE）和誤差方差（σ2E）評(píng)價(jià)，參照Hallauer 等方法計(jì)算廣義遺傳力[10]，計(jì)算公式為：

式中，n表示環(huán)境數(shù)量，r表示重復(fù)數(shù)。

1.4 QTL及環(huán)境互作分析

利用ICIMapping 4.2 完備區(qū)間作圖法（Inclusive composite interval mapping，ICIM）分析加性QTL，以LOD值≥3.0作為QTL存在最小閾值，基因×環(huán)境互作利用QTL Network 2.0 混合線性模型復(fù)合區(qū)間作 圖 法（Multi-model composite interval mapping，MCIM）分析。

不同性狀QTL 之間相關(guān)性利用超幾何概率函數(shù)計(jì)算[11]。

其中，n-遺傳圖譜長(zhǎng)度2倍與兩性狀QTL置信區(qū)間平均數(shù)之和比值，m-兩性狀重合QTL 數(shù)目（兩性狀QTL置信區(qū)間大于50%重疊QTL數(shù)目），l-QTL數(shù)目較多性狀檢測(cè)到QTL數(shù)目，s-QTL數(shù)目較少性狀檢測(cè)到QTL數(shù)目[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型變異

由表1可知，通過(guò)在哈爾濱和海南連續(xù)3年表型鑒定可知，雙親在株高、分蘗數(shù)和分蘗角上存在顯著差異，且單個(gè)性狀在6 個(gè)環(huán)境中差異不顯著，表明環(huán)境因素對(duì)雙親性狀影響較小。母本東農(nóng)422 株高和分蘗角度高于父本空育131，分蘗數(shù)低于空育131，二者互為兩種株型，空育131 株型偏緊湊，東農(nóng)422株型較散。由此可知，該雙親衍生后代群體適于水稻株型相關(guān)性狀遺傳解析。后代群體3 個(gè)性狀在6 個(gè)環(huán)境中均值介于親本之間，從RIL 表型變異范圍可知，極端值介于雙親之外，表現(xiàn)超親現(xiàn)象，變異較明顯。偏度值和峰度值絕對(duì)值小于1，表明3 個(gè)性狀在6 個(gè)環(huán)境下表型分布呈近似正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀典型特征，適于QTL分析。遺傳力分析表明，性狀表型變異主要由基因方差決定，環(huán)境因素對(duì)表型影響較小。

表1 株高、分蘗數(shù)和分蘗角度在6個(gè)環(huán)境下表型變異Table 1 Phenotypic variation of plant height,tiller number and tiller angle in six environments

由圖1可知，株高和分蘗數(shù)在6個(gè)環(huán)境下均存在顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.206、0.443、0.540、0.683、0.829 和0.677，分蘗數(shù)和分蘗角度在E2（P=0.030）、E3（P=0.018）、E5（P=0.045）下具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而株高和分蘗角度相關(guān)性不顯著（P＞0.05），但其相關(guān)系數(shù)在5個(gè)環(huán)境中為負(fù)值。由此可知，株高同分蘗數(shù)及分蘗角度可能存在遺傳相關(guān)。

2.2 QTL及基因×環(huán)境互作

通過(guò)分析3個(gè)性狀在6個(gè)環(huán)境下QTL，在ICIM方法檢測(cè)中共發(fā)現(xiàn)13 個(gè)位點(diǎn)LOD 值大于3，其中株高檢測(cè)到4 個(gè)位點(diǎn)，除qPH1，其余3 個(gè)位點(diǎn)（qPH7、qPH11、qPH12） 均在多環(huán)境下檢出，qPH11在海南兩個(gè)環(huán)境中檢出，qPH12在哈爾濱兩個(gè)環(huán)境中檢出，而qPH7 同時(shí)在兩個(gè)地點(diǎn)共4 個(gè)環(huán)境中檢出，該位點(diǎn)位于7 號(hào)染色體RM1362～RM1306 區(qū)間，貢獻(xiàn)率分別為22.78%、16.79%、28.15%和28.86%，且加性效應(yīng)來(lái)自于高值親本東農(nóng)422，該位點(diǎn)在4 個(gè)環(huán)境下分別增加株高8.64、3.60、6.35 和6.38 cm。分蘗數(shù)共有3 個(gè)位點(diǎn)檢出，qTN7-1 和qTN7-2 分別在6 個(gè)和3 個(gè)環(huán)境中檢出，qTN7-1 平均貢獻(xiàn)率為25.08%。分蘗角度共檢出6個(gè)位點(diǎn)，分別為qTA2、qTA7-1、qTA6、qTA7-2、qTA12 和qTA8，其 中qTA2、qTA7-2、qTA12 和qTA8 在多個(gè)環(huán)境中檢出。由表2 可知，qPH7、qTN7-1、qTN7-2、qTA2和qTA8加性效應(yīng)來(lái)自于東農(nóng)422，可增加株高、分蘗數(shù)和分蘗角，qPH12、qTA7-2和qTA12加性效應(yīng)來(lái)自于空育131，可減少株高和分蘗數(shù)。這13 個(gè)位點(diǎn)在染色體上的分布如圖2所示。

通過(guò)對(duì)3個(gè)性狀不同QTL位點(diǎn)作超幾何概率函數(shù)計(jì)算，得出株高QTL 同分蘗數(shù)QTL 之間存在顯著相關(guān)性（P=0.046），分蘗數(shù)QTL 同分蘗角度QTL相關(guān)性達(dá)顯著水平（P=0.039），但在株高和分蘗角度QTL 之間并未檢測(cè)到相關(guān)性（P=0.293）。由此可知，利用東農(nóng)422和空育131為遺傳背景后代群體在株高和分蘗角度遺傳上可能不具備共性。

多環(huán)境聯(lián)合分析表明，除qTN11、qTN7-2 和qTA6，其余8 個(gè)位點(diǎn)均有顯著的加性×環(huán)境效應(yīng)，其中qPH7、qPH12、qTN7-1、qTA8 和qTA12 同時(shí)具有加性和加性×環(huán)境效應(yīng)，且區(qū)間RM1306-RM70加性×環(huán)境貢獻(xiàn)率最大，為3.90%（見(jiàn)表3和圖3）。說(shuō)明這類位點(diǎn)表達(dá)和環(huán)境互作共同決定性狀表現(xiàn)。

表2 基于完備區(qū)間作圖法株高、分蘗數(shù)和分蘗角度在6個(gè)環(huán)境下QTL統(tǒng)計(jì)Table 2 QTL statistics of plant height,tiller number and tiller angle in six environments based on the ICIM

表3 株高、分蘗數(shù)和分蘗角度的QTL及QTL×環(huán)境互作分析Table 3 Analysis of QTL and QTL×Environmental interaction between plant height,tiller number and tillering angle

3 討論與結(jié)論

株高、分蘗數(shù)和分蘗角度是水稻株型重要性狀，本研究為發(fā)掘和水稻株型相關(guān)QTL 位點(diǎn)，連續(xù)三年兩地環(huán)境下檢測(cè)表型，從后代群體表型可知，3 個(gè)性狀在海南表型均值高于哈爾濱（株高93.06＞91.48， 分 蘗 數(shù)13.63＞12.98， 分 蘗 角 度28.22＞27.74），但同一性狀在相同地點(diǎn)表型值差異不顯著，且三性狀廣義遺傳力均超過(guò)80%，說(shuō)明表型變異主要受基因型主導(dǎo)。從相關(guān)性分析看，不同性狀間相關(guān)性因環(huán)境而異，環(huán)境因素改變性狀間相關(guān)性，但卻影響其相關(guān)程度。在獲得的QTL中，qPH7和qTN7-1貢獻(xiàn)率超過(guò)20%，作為本研究發(fā)現(xiàn)的主效位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)參與環(huán)境互作，但主要受基因型調(diào)控。

控制不同性狀QTL 常位于相同區(qū)間，可能是數(shù)量性狀位點(diǎn)一因多效或成簇分布的遺傳現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)的13個(gè)加性QTL位點(diǎn)中，RM1306標(biāo)記分別同株高和分蘗數(shù)連鎖，且該標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)株高平均貢獻(xiàn)率為24.15%，對(duì)分蘗數(shù)平均貢獻(xiàn)率為25.08%。因此，該標(biāo)記可作為本研究發(fā)現(xiàn)的重要主效QTL，通過(guò)與物理圖譜對(duì)比后，發(fā)現(xiàn)RM1362～RM1306 區(qū)間包含2 個(gè)注釋基因（Os07g0668300 和Os07g0668200），基因產(chǎn)物分別為GDSL-脂肪酶/?；饷负拖佘账岘h(huán)化酶。與分蘗數(shù)連鎖的區(qū)間RM1306-RM70 曾報(bào)道株高連鎖位點(diǎn)，如Ph7a[13]、qPH7-2[14]、和OsBZR1[15]等，但這些位點(diǎn)均未發(fā)生遺傳重合。由此可知，RM1306-RM70可能存在控制水稻株高的重要位點(diǎn)，但該區(qū)間內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)水稻分蘗數(shù)遺傳相關(guān)位點(diǎn)，因此該位點(diǎn)可作為本研究中株高及分蘗產(chǎn)生共同連鎖新區(qū)間。同時(shí)，這2個(gè)性狀的遺傳相關(guān)（P=0.046）和表型相關(guān)（P＜0.01，見(jiàn)圖1）具有一致性，驗(yàn)證研究可靠性。另外，本研究還檢測(cè)到1個(gè)區(qū)間（RM214～RM1377）同時(shí)與分蘗數(shù)及分蘗角度有關(guān)，該區(qū)間通過(guò)物理位置比對(duì)，僅有300 bp距離（12 783 492～12 783 710 bp），該區(qū)間已報(bào)道8 個(gè)和水稻性狀相關(guān)的位點(diǎn)，分別為gp7a、gw7、yd7a、tp7b[16]、qah7[17]、dth7.1[18]、qHd-7[19]和rn7a[20]，其中僅tp7b 和分蘗數(shù)連鎖，并未發(fā)現(xiàn)有分蘗角度位點(diǎn)存在，因此該位點(diǎn)可能與本研究檢測(cè)到的qTN7-2 是同一位點(diǎn)。通過(guò)超幾何概率函數(shù)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，分蘗數(shù)和分蘗角度之間遺傳相關(guān)（P=0.039）與性狀相關(guān)（P＜0.05）存在一致性。而剩余QTL 僅與一個(gè)性狀連鎖，其中，與qPH11 連鎖的RM206 標(biāo)記被證實(shí)是分布于粳稻資源中等位基因最多的標(biāo)記，與qTN1 連鎖的標(biāo)記RM1331 則被報(bào)道和水稻葉色連鎖[21-22]，同樣，qTA8 連鎖標(biāo)記RM310 和水稻葉邊顏色連鎖[23]，而與qTA2 連鎖的標(biāo)記RM561 則與水稻耐冷性有關(guān)[24]，其余位點(diǎn)并未檢測(cè)到和水稻性狀連鎖的遺傳位點(diǎn)，可能是研究發(fā)現(xiàn)的新位點(diǎn)。

水稻表型方差不但受基因型方差控制，還與環(huán)境方差及基因型×環(huán)境方差有關(guān)，基因和環(huán)境互作是水稻數(shù)量性狀普遍存在的遺傳模式[25-26]，本研究通過(guò)連續(xù)三年在兩個(gè)地點(diǎn)開(kāi)展水稻株型相關(guān)形狀遺傳位點(diǎn)挖掘，分析環(huán)境因素對(duì)表型變異的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一性狀在不同環(huán)境下可能存在不同環(huán)境效應(yīng)影響表型方差，如本研究檢測(cè)到qPH7，僅在兩個(gè)環(huán)境下具有顯著的基因×環(huán)境互作效應(yīng)，其余4 個(gè)環(huán)境均未檢測(cè)到，而qTN7-2、qTN11和qTA6則在任何環(huán)境下均未檢測(cè)到基因×環(huán)境互作效應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在2016 年哈爾濱和海南兩個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到的基因×環(huán)境互作效應(yīng)最多，而2017 年和2018 年4 個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到較少，可能與年際間環(huán)境差異有關(guān)。完備區(qū)間作圖法檢測(cè)到的13 個(gè)加性QTL 中，5 個(gè)在混合線性模型中得到驗(yàn)證，但在多環(huán)境中同時(shí)檢測(cè)到的位點(diǎn)卻并未受環(huán)境影響，如qTN7-1 在6 個(gè)單環(huán)境中均檢測(cè)到，但僅E4和E5產(chǎn)生顯著環(huán)境互作效應(yīng)，說(shuō)明其余4個(gè)環(huán)境下性狀表型主要受基因型控制，而在E4和E5條件下，表型變異還受環(huán)境方差調(diào)控。由此可知，水稻數(shù)量性狀遺傳較復(fù)雜，基因表達(dá)不但受遺傳背景控制，還與環(huán)境相關(guān)。因此僅在特定作圖群體中獲得的穩(wěn)定遺傳位點(diǎn)才可廣泛應(yīng)用于水稻性狀遺傳改良，而未經(jīng)過(guò)多環(huán)境驗(yàn)證的位點(diǎn)則難以保證其真實(shí)可靠性。

本研究通過(guò)6個(gè)環(huán)境表型鑒定，在7號(hào)染色體相鄰區(qū)間（RM1362～RM1306，RM1306～RM70）發(fā)現(xiàn)和水稻株高及分蘗數(shù)相關(guān)主效位點(diǎn)，而分蘗角度相關(guān)位點(diǎn)雖在多環(huán)境下檢出（qTA2、qTA7-2、qTA12 和qTA8），但并無(wú)穩(wěn)定位點(diǎn)和株高及分蘗數(shù)重合，因此將RM1306臨近區(qū)間作為株型相關(guān)連鎖區(qū)間，為今后基因定位和功能驗(yàn)證奠定理論基礎(chǔ)。