東北紅松蘑多糖提取及抗氧化活性研究

金志民 柴軍紅 何婷婷

摘要：為研究東北牡丹江地區(qū)紅松蘑（Gomphidius rutilus）多糖抗氧化活性，采用水提-醇沉法從東北產(chǎn)紅松蘑中提取子實(shí)體多糖，體外抗氧化模型研究其抗氧化能力，紅外光譜研究其多糖基本結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，其多糖濃度在1 mg/mL時(shí)對(duì)超氧離子自由基（·O2-）的清除率為96.96%;多糖濃度在1 mg/mL時(shí)對(duì)羥基自由基（·OH）的清除率為94.95%;多糖對(duì)DPPH自由基的清除率最高為48.53%，其紅外表征顯示多糖為β-型吡喃多糖。這說明紅松蘑多糖抗氧化活性高，有一定的開發(fā)價(jià)值及前景。

關(guān)鍵詞：紅松蘑（Gomphidius rutilus）;多糖;抗氧化;紅外光譜

中圖分類號(hào)：R285.5 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）01-0123-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.027 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： The antioxidant activity of polysaccharide which extracted from Gomphidius rutilus was studied by. in vitro antioxidant systems. The structure of the extracted polysaccharide was also studied by infrared spectroscopy. The results showed that when the polysaccharide concentration reached 1 mg/mL the scavenging rate of superoxide radical， DPPH and hydroxyl radical was 96.96%， 48.53% and 94.95%， respectively. The IR results showed that polysaccharide is beta-pyranose. It indicated that Gomphidius rutiluss polysaccharide has a high antioxidant capacities and a bright future of development and utilization.

Key words： Gomphidius rutilus; polysaccharide; antioxidant; IR

紅松蘑學(xué)名血紅鉚釘菇（Chroogomphidius viscidus），俗稱松樹傘、紅蘑，主要分布于中國(guó)的東北、西南的松樹林地之間，是口感很不錯(cuò)的食用野生菌，有“素肉”之稱[1-3]。紅松蘑富含多種氨基酸，蛋白質(zhì)可達(dá)到18%以上（鮮重），維生素B族、膳食纖維可達(dá)24%以上（鮮重），多糖5%左右等[4，5]。此外，其還含有多酚、黃酮、脂肪酸、甾和萜類、香豆素等成分[6-11]，針對(duì)以上成分，主要進(jìn)行了多糖、黃酮的抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等活性研究[12，13]，相關(guān)研究結(jié)果表明其多糖活性比較高且具有良好的開發(fā)利用價(jià)值，為此，相關(guān)課題組進(jìn)一步開展菌絲發(fā)酵、酶促多糖工藝優(yōu)化、采用DEAE-52及CL-8分離純化等研究[14-17]。同時(shí)李震等[18]開展抗疲勞功能飲料的研制，取得了一定成果。自由基可以破壞RNA/DNA、結(jié)合破壞蛋白質(zhì)及酶體系，進(jìn)而干擾機(jī)體的細(xì)胞代謝[19-21]，從而加速機(jī)體的衰老，可直接或間接引起衰老、病變（腫瘤）、變態(tài)反應(yīng)等[22，23]，補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)具有較好的臨床及保健價(jià)值[18，21，22]?，F(xiàn)階段雖然對(duì)紅松蘑多糖做了較多的研究，但是不同產(chǎn)區(qū)紅松蘑研究結(jié)果存在一定差異，同時(shí)對(duì)紅松蘑多糖結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究較少見。因此，本試驗(yàn)以東北牡丹江地區(qū)紅松蘑為對(duì)象，研究其抗氧化活性，旨在為相關(guān)研究提供有益的參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

東北紅松蘑，采自牡丹江地區(qū)，經(jīng)過牡丹江師范學(xué)院曲秀春教授鑒定為血紅鉚釘菇，標(biāo)本藏于牡丹江師范學(xué)院標(biāo)本館。

主要試劑：溴化鉀（AR，上海國(guó)藥集團(tuán)），焦性沒食子酸（AR，上海琳帝化工有限公司），七水硫酸亞鐵（AR，天津博迪化工股份有限公司），無水乙醇（AR，天津進(jìn)豐化工有限公司），食用酒精（95%，黑龍江華潤(rùn)酒精有限公司），1，10-菲羅啉 （AR，瓦里西化工），L-抗壞血酸（AR，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司），30%雙氧水、鹽酸（AR，哈爾濱試劑廠），R-10纖維素酶，Y-23果膠酶（BR，日本Yakult公司），DPPH（97%，日本TCI公司）等。

主要儀器：JHBE-50T型閃式提取器（成都市宜邦科析儀器有限公司）;SL-2010N型超聲波萃取裝置（南京順流設(shè)備有限公司）; T6型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;PB-10型酸度計(jì)，BSA224S-CW型電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）;LGJ-18S型冷凍真空干燥機(jī)（鄭州鳴一儀器設(shè)備有限公司）;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限公司）等。

1.2 ?方法

1.2.1 ?多糖提取 ?取1 000 g紅松蘑切碎后，以無水乙醇為提取劑，料液比（g∶mL，下同）1∶5，在閃式提取器提取，攪拌轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，提取時(shí)間為120 s，提取2～3次，除掉脂溶性成分及部分色素，殘?jiān)蜏馗稍锖髠溆肹24]。

以純水為提取劑，每100 g紅松蘑加入1%～2%果膠酶、2%纖維素酶，控溫50 ℃，pH 5下酶促反應(yīng)2 h;微波滅活1～2 min;以料液比（g∶mL）1∶10加入水，功率800 W，超聲波提取60 min，提取2次，合并濾液，濃縮至原體積1/10，反復(fù)冷凍，6 000 r/min離心處理至熱水溶解無沉淀，Sevage法除去蛋白，-70 ℃預(yù)凍8～12 h，冷凍干燥后丙酮再次脫色備用[25，26]。

1.2.2 ?多糖抗氧化性研究 ?樣品液制備：精確稱取1.000 g多糖，純水配制成10 mg/mL的提取物溶液作為母液。用母液分別配制1.0～0.2 mg/mL的溶液[27]。維生素C溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，部分濃度低于0.2 mg/mL。

1）超氧自由基清除能力測(cè)定。依據(jù)文獻(xiàn)[28，29]方法采用鄰苯三酚自氧化法，以維生素C為對(duì)照，測(cè)定多糖對(duì)超氧自由基的清除能力，總時(shí)間控制在3.5～4.0 min內(nèi)，依據(jù)以下公式計(jì)算清除率，檢測(cè)3次結(jié)果取平均值。

清除率=[（CA-CB）/CA]×100%

式中，CA為自氧化時(shí)吸光度，CB為加入樣品溶液（或維生素C）后吸光度。

2）羥基自由基清除能力測(cè)定。依據(jù)文獻(xiàn)[30，31]的方法略有改變，以維生素C為對(duì)照，在510 nm下，采用菲羅啉-FeSO4-H2O2體系測(cè)定羥基自由基清除能力，并依據(jù)以下公式計(jì)算清除率，檢測(cè)3次結(jié)果取平均值。

清除率=[1-（Q0-Q1）/（Q2-Q1）]×100%

式中，Q0為樣品（或維生素C）+菲羅啉-FeSO4-H2O2體系溶液的吸光度;Q1為H2O2溶液+空白樣品體系溶液的吸光度;Q2為不加H2O2和樣品（或維生素C）體系溶液的吸光度。

3）DPPH自由基清除能力測(cè)定。依據(jù)文獻(xiàn)[26，30]的方法略有改動(dòng)，以維生素C為對(duì)照，在520 nm下暗條件反應(yīng)30 min，并依據(jù)以下公式計(jì)算清除率，檢測(cè)3次結(jié)果取平均值。

清除率=[1-（D1-D2）/D0]×100%

式中，D0為DPPH和95%乙醇的吸光度;D1為DPPH和待測(cè)樣品的吸光度;D2為待測(cè)樣品（或維生素C）和95%乙醇的吸光度。

1.2.3 ?多糖的紅外表征 ?將“1.2.1”獲得的粗多糖用去離子水配成溶液，通過Sevage法除去蛋白后，反復(fù)醇沉、離心、冷凍干燥、備用。采用溴化鉀壓片法制樣，在紅外光譜儀上檢測(cè)其紅外光譜。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 多糖對(duì)超氧自由基的清除作用

由圖1可見，濃度為0.3 mg/mL的多糖對(duì)超氧自由基的清除率與維生素C幾乎相等，隨著多糖濃度升高其清除作用逐漸加強(qiáng)，顯示濃度-清除率具有一定線性相關(guān)性（R2=0.943，P<0.05），濃度在0.8 mg/mL時(shí)其清除率可達(dá)78%以上，1.0 mg/mL時(shí)清除能力趨于飽和。

2.2 ?多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

由圖2可見，當(dāng)多糖濃度在0.4 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率接近維生素C，0.6 mg/mL以上時(shí)其清除率均高于維生素C，最高清除率可達(dá)到94%以上，顯示出較好的清除效果。由于羥基自由基與人體衰老有一定聯(lián)系，所以紅松蘑多糖具有一定潛在的抗衰老活性及價(jià)值，這與文獻(xiàn)[18]的研究結(jié)果較為接近。同時(shí)在研究濃度范圍內(nèi)其濃度與清除率顯示較好的線性相關(guān)性（R2=0.973，P<0.05）。

2.3 ?多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用

在整個(gè)試驗(yàn)濃度區(qū)間多糖對(duì)DPPH自由基的清除率上升較為平緩，這與文獻(xiàn)[12]的結(jié)果較為吻合，在濃度1.0 mg/mL時(shí)就達(dá)到48%以上，表現(xiàn)出一定的抗氧化效果，與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果存在一定差異，這可能與檢測(cè)方法及多糖純度或紅松蘑產(chǎn)區(qū)有一定關(guān)系，同時(shí)在研究濃度范圍內(nèi)多糖濃度與清除率顯示較好的線性相關(guān)性（R2=0.982，P<0.05）。

2.4 ?多糖紅外測(cè)定結(jié)果

由圖4可見，在3 331.33 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰為O-H或N-H伸縮振動(dòng)峰;在2 926.45 cm-1處的尖峰是C-H（-CH2）伸縮振動(dòng)峰;其897.13 cm-1、1076.79 cm-1、1 029.58 cm-1為吡喃糖特征吸收之一[24，32，33]，在1 653.21 cm-1處的強(qiáng)尖峰是C=O（-CHO）的伸縮振動(dòng)峰，表明此多糖為吡喃糖;568.35 cm-1的弱小尖峰是β-吡喃環(huán)彎曲振動(dòng)峰。以上結(jié)果說明多糖為β-型吡喃多糖[34]。

3 ?結(jié)論

在樣品測(cè)定濃度范圍內(nèi)，東北紅松蘑多糖濃度與其對(duì)自由基的清除率均顯示良好的線性相關(guān)（R2>0.9，P<0.05），其紅外表征顯示多糖為β-型吡喃多糖。其對(duì)羥基自由基（·OH）的清除率最高為94.95%，對(duì)超氧離子自由基（·O2-）的清除率最高為96.96%，濃度在0.4 mg/mL以上時(shí)其清除效果均優(yōu)于維生素C。由于羥基自由基及超氧離子自由基均與衰老有一定相關(guān)性，表明東北紅松蘑多糖具有潛在抗衰老應(yīng)用前景。

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